一种新型杆状病毒亲本株的鉴定及病毒DNA的纯化
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山东医科大学学报 2000年第1期第38卷 科研简报
作者：朱长军 张利宁 马春红 曹英林 宋 静
单位：山东医科大学微生物免疫学教研室
关键词：病毒；DNA
山东医科大学000133
分类号：R373 文献标识码：B
文章编号：1000-0496(2000)01-0096-02
昆虫杆状病毒表达系统以其表达产量高、表达产物理化和生物特性与天然蛋白相似等优点，成为目前较理想的真核表达系统。该系统的主要步骤包括亲本病毒的培养鉴定、病毒DNA的纯化、重组转移载体的构建、共转染形成重组病毒及重组病毒感染昆虫细胞表达目的蛋白。其中，病毒培养的鉴定及病毒DNA的纯化是主要因素之一。我们在表达抑癌基因p16INK4时采用了王殉章教授构建的系统。但该系统所用亲本病毒TnNPV与国外用的野生型TnNPV不同，其鉴定方法也不一样。现将我们在工作中建立的病毒鉴定及纯化方法介绍如下。1材料与方法1.1细胞与病毒将sf9(Spodopterafrugiperda)细胞由华中师范大学昆虫所赠送。新型TnNPV亲本株(TnNPV-SVIG)由中山大学昆虫所惠增[1,2]。所用培养基TC-100及10%胎牛血清(FBS)均为GIBCO公司产品。1.2研究方法1.2.1细胞培养及病毒感染[3]将sf9细胞接种于25cm2培养瓶中，加入10%FBS-TC100，27℃培养。2～3d后，细胞形成单层(约2×106细胞)，用吸管直接吹打贴壁细胞，使之悬浮，进行传代。细胞传代24h后，吸去培养基，加入病毒感染液0.5ml，感染复数约为1，置27℃攻击lh(中间摇动培养瓶3～4次，使病毒感染液均匀覆盖于细胞上)后，弃病毒感染液,再加入4ml新鲜TC-100培养基，27℃孵育2～4d。1.2.2病毒鉴定病毒感染细胞2～4d后,吸去细胞培养液，加入100uL2%X-gal(2ulX-gal加98ulTC-100)，轻轻摇动培养瓶，使液体覆盖贴壁细胞，室温静置5min，再加入lmlTC-100，避光，27℃孵育4～5h，观察培养液颜色变化。同时取末感染TnNPV-SVI-G及感染野生型TnNPV的sf细胞以同样方法处理作为对照。1.2.3病毒DNA的纯化及酶切[4]病毒感染细胞4d后，细胞病变(CPE)几乎100%时，将细胞培养液经2000×g离Polyhedrin(735hp)心15min，上清液加固体NaCI至终浓度为1.Omol/L，再加固体聚乙二醇(MW6000)至终浓度为10%(W/V)，混匀溶解，置4℃过夜。然后将混合液2000×g离心20min，弃尽上清，加l/10原培养液体积的蛋白消化液,混匀后加RNase和蛋白酶K分别为100mg/L和50mg/L，37℃水浴2～3h，至液体清澈透明，最后常规酚/氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀获得病毒DNA。用HindⅢ酶切病毒DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳观察。2结果与讨论2.1病毒的鉴定TnNPV-SVI-G与野生型TnNPV不同，它不能形成多角体，所以，病毒感染sf9细胞后无特征性的细胞病变，从形态学上无法鉴定是否有亲本株病毒感染,主要靠x-gal染色法及病毒DNA酶切电泳来鉴定。(全文见PDF)2.1.1x-gal染色法用x-gal染色后,观察可见感染TnNPV-SVI-G的细胞培养液变蓝色，而对照组未出现颜色变化。因为TnNPV-SVI-G尽管缺失多角体基因，但含有β-半乳糖苷酶基因，病毒感染昆虫细胞后可表达半乳糖苷酶。昆虫细胞分泌半乳糖苷酶至培养液中，用x-gal染色后，细胞培养液中的半乳糖苷酶水解，其底物x-gal释放出亮蓝色靛青染料，使培养液变蓝色。此方法简单，结果易见。2.1.2病毒DNA的酶切电泳尽管TnNPV-SVI-G缺失多角体基因，但我们发现其DNA经酶切后电泳仍可形成特征DNA带型，不仅包括野生型TnNPVDNAHindⅢ酶切的主要大片段(A～E)，还含有一个新的大片段(14.8kb)。因为野生型TnNPV的多角体蛋白基因(polyhedrin，735bp)含有HindⅢ酶切位点，位于病毒DNAHindⅢ酶切后的F片段(8.7kb)与V片段(O.9kb)之间。TnNPV-SVI-G以β-半乳糖苷酶基因(β-gal，5.9kb)取代多角体基因[1]，而β-gal基因不含HindⅢ酶切位点，使病毒DNAF片段与V片段之间的HindⅢ酶切位点消失。用HindⅢ酶切后，片段与V片段消失，形成一个新的包含F片段、V片段及β-gal基因的大片段(14.8kb)，位于病毒DNAHind酶切A(22.6kb)、B(20.9kb)片段与C片段(11.6kb)之间(见图l，2)。图1野生型TnNPVDNAHindⅢ酶切图谱(%)Fig.1HindⅢrestrictionpatternsofwildtypeTnNPVDNA(%)图2亲本病毒TnNPV-SVI-GDNAHindⅢ酶切图谱A：TnNPV-SVI-GDNA/HindⅢ；M：λDNA/HindⅢ右箭头所指为新片段(14.8kb)Fig.2DigestionofrecombinantTnNPV-SVI-GDNAwithrestrictionenzymesHindⅢA：TnNPV-SVl-GDNA/Hindc；M：λDNA/HindⅢ；Rightarrowindicatednewfragment(14.8kb)2.2病毒DNA的纯化许多报道，纯化病毒DNA离心时，一般要求离心力在100000×g以上，所得的病毒纯度很高，但其价格昂贵，制备DNA量低，无超速离心机的单位受到限制。我们参考郑永晨等[4]提取腺病毒DNA的方法，探索用聚乙二醇(PEG6000)法提取杆状病毒DNA，获得较好的结果，并成功地进行了酶切鉴定。用这种方法在每毫升病毒感染的细胞培养液中可抽提到约2ug病毒DNA。在纯化病毒DNA过程中，应该注意：(1)将细胞培养液中细胞碎片及悬浮细胞彻底沉淀，以避免细胞染色体DNA污染，故我们采用2000×g离心15min，效果较好。(2)加固体NaCl与PEG6000后，一定要充分混匀，以保证病毒粒子完全沉淀下来。此法简便易行，制备病毒DNA量与纯度都很高，完全能够满足病毒DNA的酶切及共转染,且仅需一般实验室所具备的条件，值得推广。
, 百拇医药
基金项目：卫生部科研基金资助课题(413653)
参考文献：
[1]王徇章，谢伟东，龙綮新，等.形成多角体的杆状病毒载体系统的建立[J].病毒学报，1991,7(3):253
[2]王徇章，谢伟东，龙綮新,等.人工合成杆状病毒后期启动子的探讨[J].中国科学，1992,B辑(1):39
[3]Summers，MD, Smith GE.A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures[R].Texas Agriculture Experiment Station Bulletin，1987.1555:10
[4]郑永晨，梁东，傅文水.简单快速提取病毒DNA的方法[J].中华医学检验杂志,1990,13(2):91
收稿日期：1999-10-27, 百拇医药
单位：山东医科大学微生物免疫学教研室
关键词：病毒；DNA
山东医科大学000133
分类号：R373 文献标识码：B
文章编号：1000-0496(2000)01-0096-02
昆虫杆状病毒表达系统以其表达产量高、表达产物理化和生物特性与天然蛋白相似等优点，成为目前较理想的真核表达系统。该系统的主要步骤包括亲本病毒的培养鉴定、病毒DNA的纯化、重组转移载体的构建、共转染形成重组病毒及重组病毒感染昆虫细胞表达目的蛋白。其中，病毒培养的鉴定及病毒DNA的纯化是主要因素之一。我们在表达抑癌基因p16INK4时采用了王殉章教授构建的系统。但该系统所用亲本病毒TnNPV与国外用的野生型TnNPV不同，其鉴定方法也不一样。现将我们在工作中建立的病毒鉴定及纯化方法介绍如下。1材料与方法1.1细胞与病毒将sf9(Spodopterafrugiperda)细胞由华中师范大学昆虫所赠送。新型TnNPV亲本株(TnNPV-SVIG)由中山大学昆虫所惠增[1,2]。所用培养基TC-100及10%胎牛血清(FBS)均为GIBCO公司产品。1.2研究方法1.2.1细胞培养及病毒感染[3]将sf9细胞接种于25cm2培养瓶中，加入10%FBS-TC100，27℃培养。2～3d后，细胞形成单层(约2×106细胞)，用吸管直接吹打贴壁细胞，使之悬浮，进行传代。细胞传代24h后，吸去培养基，加入病毒感染液0.5ml，感染复数约为1，置27℃攻击lh(中间摇动培养瓶3～4次，使病毒感染液均匀覆盖于细胞上)后，弃病毒感染液,再加入4ml新鲜TC-100培养基，27℃孵育2～4d。1.2.2病毒鉴定病毒感染细胞2～4d后,吸去细胞培养液，加入100uL2%X-gal(2ulX-gal加98ulTC-100)，轻轻摇动培养瓶，使液体覆盖贴壁细胞，室温静置5min，再加入lmlTC-100，避光，27℃孵育4～5h，观察培养液颜色变化。同时取末感染TnNPV-SVI-G及感染野生型TnNPV的sf细胞以同样方法处理作为对照。1.2.3病毒DNA的纯化及酶切[4]病毒感染细胞4d后，细胞病变(CPE)几乎100%时，将细胞培养液经2000×g离Polyhedrin(735hp)心15min，上清液加固体NaCI至终浓度为1.Omol/L，再加固体聚乙二醇(MW6000)至终浓度为10%(W/V)，混匀溶解，置4℃过夜。然后将混合液2000×g离心20min，弃尽上清，加l/10原培养液体积的蛋白消化液,混匀后加RNase和蛋白酶K分别为100mg/L和50mg/L，37℃水浴2～3h，至液体清澈透明，最后常规酚/氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀获得病毒DNA。用HindⅢ酶切病毒DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳观察。2结果与讨论2.1病毒的鉴定TnNPV-SVI-G与野生型TnNPV不同，它不能形成多角体，所以，病毒感染sf9细胞后无特征性的细胞病变，从形态学上无法鉴定是否有亲本株病毒感染,主要靠x-gal染色法及病毒DNA酶切电泳来鉴定。(全文见PDF)2.1.1x-gal染色法用x-gal染色后,观察可见感染TnNPV-SVI-G的细胞培养液变蓝色，而对照组未出现颜色变化。因为TnNPV-SVI-G尽管缺失多角体基因，但含有β-半乳糖苷酶基因，病毒感染昆虫细胞后可表达半乳糖苷酶。昆虫细胞分泌半乳糖苷酶至培养液中，用x-gal染色后，细胞培养液中的半乳糖苷酶水解，其底物x-gal释放出亮蓝色靛青染料，使培养液变蓝色。此方法简单，结果易见。2.1.2病毒DNA的酶切电泳尽管TnNPV-SVI-G缺失多角体基因，但我们发现其DNA经酶切后电泳仍可形成特征DNA带型，不仅包括野生型TnNPVDNAHindⅢ酶切的主要大片段(A～E)，还含有一个新的大片段(14.8kb)。因为野生型TnNPV的多角体蛋白基因(polyhedrin，735bp)含有HindⅢ酶切位点，位于病毒DNAHindⅢ酶切后的F片段(8.7kb)与V片段(O.9kb)之间。TnNPV-SVI-G以β-半乳糖苷酶基因(β-gal，5.9kb)取代多角体基因[1]，而β-gal基因不含HindⅢ酶切位点，使病毒DNAF片段与V片段之间的HindⅢ酶切位点消失。用HindⅢ酶切后，片段与V片段消失，形成一个新的包含F片段、V片段及β-gal基因的大片段(14.8kb)，位于病毒DNAHind酶切A(22.6kb)、B(20.9kb)片段与C片段(11.6kb)之间(见图l，2)。图1野生型TnNPVDNAHindⅢ酶切图谱(%)Fig.1HindⅢrestrictionpatternsofwildtypeTnNPVDNA(%)图2亲本病毒TnNPV-SVI-GDNAHindⅢ酶切图谱A：TnNPV-SVI-GDNA/HindⅢ；M：λDNA/HindⅢ右箭头所指为新片段(14.8kb)Fig.2DigestionofrecombinantTnNPV-SVI-GDNAwithrestrictionenzymesHindⅢA：TnNPV-SVl-GDNA/Hindc；M：λDNA/HindⅢ；Rightarrowindicatednewfragment(14.8kb)2.2病毒DNA的纯化许多报道，纯化病毒DNA离心时，一般要求离心力在100000×g以上，所得的病毒纯度很高，但其价格昂贵，制备DNA量低，无超速离心机的单位受到限制。我们参考郑永晨等[4]提取腺病毒DNA的方法，探索用聚乙二醇(PEG6000)法提取杆状病毒DNA，获得较好的结果，并成功地进行了酶切鉴定。用这种方法在每毫升病毒感染的细胞培养液中可抽提到约2ug病毒DNA。在纯化病毒DNA过程中，应该注意：(1)将细胞培养液中细胞碎片及悬浮细胞彻底沉淀，以避免细胞染色体DNA污染，故我们采用2000×g离心15min，效果较好。(2)加固体NaCl与PEG6000后，一定要充分混匀，以保证病毒粒子完全沉淀下来。此法简便易行，制备病毒DNA量与纯度都很高，完全能够满足病毒DNA的酶切及共转染,且仅需一般实验室所具备的条件，值得推广。
, 百拇医药
基金项目：卫生部科研基金资助课题(413653)
参考文献：
[1]王徇章，谢伟东，龙綮新，等.形成多角体的杆状病毒载体系统的建立[J].病毒学报，1991,7(3):253
[2]王徇章，谢伟东，龙綮新,等.人工合成杆状病毒后期启动子的探讨[J].中国科学，1992,B辑(1):39
[3]Summers，MD, Smith GE.A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures[R].Texas Agriculture Experiment Station Bulletin，1987.1555:10
[4]郑永晨，梁东，傅文水.简单快速提取病毒DNA的方法[J].中华医学检验杂志,1990,13(2):91
收稿日期：1999-10-27, 百拇医药