巯基嘌呤甲基转移酶的检测及其临床意义
作者：程雄 刘维媛 李明远
单位：程雄(德阳市人民医院，德阳，618000)； 刘维媛(攀枝花市第五人民医院，617000)； 李明远(华西医科大学微生学教研室，成都，610041))
关键词：
华西医学000188 综述 审校
分类号：R329.2+6；Q503 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0120-02▲
巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)是一种专门催化芳香族和杂环化合物的巯基甲基化反应的胞内酶，与临床上使用的巯基嘌呤类药物的代谢有重要关系。而巯基嘌呤类药物在临床上已使用多年，常用的药物为6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AT)，主要用于白血病和肿瘤的化疗、器官移植受者的免疫抑制治疗以及自身免疫性疾病的治疗〔1，2〕。随着对这类药物的作用机制和代谢过程的深化研究，已经发现TPMT在人群中分布的多样性，特别是发现TPMP的基因突变与酶缺陷的关系后，使本领域的研究更加活跃。本文就TPMT活性测定和突变基因的检测及其临床意义作一综述。
, 百拇医药
1 TPMT的生化特性及其多态性
TPMT是在哺乳动物的鸟类当中发现的一种细胞内的甲基转移酶。该酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供应者，催化芳香族和杂环化合物的硫原子甲基化。它最初是在鼠的肾脏和肝脏中发现的，后来发现在多数组织中都存在，如心、血细胞、胎盘、胰腺、小肠等，而且在人的这些组织及红细胞中也发现了TPMT〔3，4〕。TMPT的分子量为28kDa，由245个氨基酸残基组成，其酶活性不依赖金属离子。人肾脏TPMT的最适pH为7.5，而人红细胞中TPMT的最适pH为6.7。通过离子交换层析分析，人肾、肝脏中的TPMT存在两种异构体，但具有相同的分子量和催化活性。
TPMT在巯基嘌呤代谢中具有重要作用，它的催化特性取决于MP或TG底物。用放射掺合法测定纯化的人肾脏TPMT催化甲基化反应的Km值，当底物是MP时，该值是383μm；当底物是TG时，该值是557μm〔5〕。TPMP的抑制物有L-甲硫氨酸、6-甲硫醇嘌呤、3.4-二甲基-5-羟基苯甲酸，它们对TPMT活性的抑制作用呈剂量依赖关系。
, 百拇医药
人类红细胞内TPMT活性与肝、肾、白细胞、急性淋巴母细胞性白血病的淋巴细胞的TPMT活性是呈正相关的，因而红细胞成为测定TMPT最容易得到的组织。根据Klemetsdal的报道〔6〕，不同人种红细胞的TPMP活性是有差异的。例如挪威北部莎弥人的TPMT活性就高于该地区非莎弥的白种人；在美国佛罗里达州，黑人的TPMT活性比白人低33%，但黑人和白人中高活性、中等活性的比例是一致的；新加坡华人的TPMT活性高于美国人。以上这些都显示出TMPT结构和生物活性的多态性。
2 TPMT活性测定
如前所述，一则因为RBC与组织细胞中TPMT活性的相关性，二则外周血易于采集，故外周血RBC成为测定TPMT的理想标本来源。而关于RBC溶解物中TPMT活性测定的方法方面较常用的是非螯合的放射化学法〔7〕(简称放射化学法)。放射化学法测定TPMT活性的基本原理是利用该酶的转甲基作用，以14C标记的S-甲基14C-腺苷-甲硫氨酸(14-SAM)为标记甲基的供者，在RBC溶解物中TPMT的催化下使MP接受14C标记的甲基，再以液体闪烁计数测定DPM值，最后计算TMPT活性单位(U/ml pRBC)。
, http://www.100md.com
就具体的放射化学法操作而言，抽取外周血标本后肝素抗凝，精确量取RBC压积，并分离RBC和充分洗涤，再用冷蒸馏水低渗溶解RBC，高速离心后收集上清即为待测的RBC溶解物。在TPMT活性测定正式测验时，先向RBC溶解物中加入MP，再加入新鲜配制的14C-SAM。反应在37℃持续1小时后用碱性硼酸缓冲液终止酶促反应。用乙醇异戊酯分离有机相(含接受14C甲基的MP)，测定DPM值后计算出TPMT活性单位数。本法测定的1个单位即代表1小时催化形成1nmol的甲基化硫基嘌呤。正常人外周血RBC溶解物的TPMT约为12～15U/ml pRBC。
3 TPMT的基因突变与检测
在TPMT缺陷的病人中发现的第一种突变(称为TPMT2)是第80位密码子改变，即发生了G238→C颠换，由此导致丙氨酸80→脯氨酸(Alu80→Pro)，使TPMT活性上百倍地下降〔8〕。据推测产生这种现象的原因是由于Alu80→Pro后，引起了TPMT二级结构的改变，产生了另一种折迭形式，改变了酶蛋白的稳定性，致使酶活性丧失。发现的另一种突变(称为TPMT3)是在TPMT的ORF出现了两个核苷酸的转换，即G460→A和A719→G，导致相应的氨基酸由丙氨酸154→苏氨酸和酪氨酸240→半胱氨酸〔9〕。根据研究发现，产生这种突变后可使细胞内TPMT蛋白的含量下降，可比野生型低400倍，从而导致该酶缺陷。
, 百拇医药
而有关TPMT基因突变检测方法的建立，正是基于上述点突基础的〔8，9〕。如G460→A的突变破坏了内切酶MwoⅠ的识别位点，而719→G的突变则增加了酶Acel的切割位点，因而建立了TPMT3特异性的PCR-RFLP。对于G460→A突变是设计内含子6和外显子7的特异引物，进行PCR扩增，得到了304bp的基因DNA片段，其中包括了G460→A突变，再用MwoⅠ酶切后进行PCR-RFLP分析；而对于A719→G突变设计内含子9和外显子10的特异引物，通过PCR扩增后用Acel酶切，再做PCR-RFLP分析。通过此分析，可得到TPMT3的突变频率。据报道的对22名无关的TPMT缺陷患者的PCR-RFLP分析结果，发生TPMT3型突变的占17人，而且其中15人为G460和A719均发生突变，在另两人中，一人仅出现G460突变，而另一人仅出现A719突变。对于TPMT2型突变(G238)，虽然G238突变后失去CviRⅠ的酶切位点，但由于CviRⅠ不能彻底消化野生型的DNA，因而还未建立可测出这种突变的PCR-RFLP方法，但已建立了G238突变特异性的PCR方法，即用内含子4/外显子5和内含子5的特异引物，进行PCR扩增后分析。通过用此法测定，发现美国人群中TPMT2型突变的发生是比较少的。
, 百拇医药
4 TPMT突变检测的临床意义
临床上广为使用的巯基嘌呤类药物主要有6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AG)。MP用于治疗急 性淋巴母细胞白血病(ALL)已40多年，至今仍是ALL治疗方案中不可缺少的药物。而AT则已成为免疫抑制治疗的三联药物之一，已广泛用于肾移植病人。近来报道还可用于治疗自身免疫性肝炎，且效果良好〔1〕。巯基嘌呤类药物在体内的代谢主要有两条途径，一是在TPMT的催化下使硫基甲基化，二是在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化成硫尿酸。由于造血组织中缺乏黄嘌呤氧化酶，该组织中的嘌呤类药物主要靠TPMT催化分解，因而TPMT缺陷的病人，如果使用了常规剂量的MP、AT和TG时，则会引起巯基嘌呤类药物在体内堆积，而且主要影响造血系统，轻者引起中毒和影响治疗效果，重者可致死亡。虽然测定RBC中的TPMT活性可诊断TPMT缺陷，但由于肿瘤病人和器官移植受者接受同种异体输血后，干扰了TPMT活性的检测结果。故对TPMT缺陷者最好采用基因诊断。通过建立PCR和PCR-RFLP分析法，可测定>80%的TPMT缺陷的基因，并有助于提高基因诊断水平，为将来的基因治疗奠定基础。中国是发展中国家，由于经济的制约，近邻结婚较为常见，故TPMT缺陷的发生频率可能还会高一些，因而特别有必要开展这方面的检查和研究，更好地造福于患者。■
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Hollander AAM，van Saase JLCM，Kootte AMM，et al.Lancet，1995；345∶610-664.
[2] Johsaon PJ，McFarlane IG，William SR.New Engl J Med，1995，333∶958-963.
[3] Woodson LC，Ames MM，Selssie CD，et al.Molec Pharmacol，1983；24∶471-478.
[4] Szumlanski CL，Honchel R，Scott MC，et al.Pharmacogen，1992；2∶148-159.
[5] Deininger M，Szumalanski CL.Otterness DM，et al.Biochem Pharmacol，1994；48∶2135-2138.
, 百拇医药
[6] Klemetsdal B，Straume B，Wist E，et al.Eur J Clin Pharmacol，1993；44∶147-152.
[7] Mclood HL，Relling MV Liu Q，et al.Blood，1995；85(7)∶1897-1902.
[8] Krynetski EY，Krynetskaia NF，Yanishevski Y，et al.Molec Pharmacol，1995；47∶1141-1147.
[9] Tai HL，Krynetski EY，Evans WE.ISSX Pro-ceedings，1995；8∶103-106.
收稿日期：1999-12-14, 百拇医药
单位：程雄(德阳市人民医院，德阳，618000)； 刘维媛(攀枝花市第五人民医院，617000)； 李明远(华西医科大学微生学教研室，成都，610041))
关键词：
华西医学000188 综述 审校
分类号：R329.2+6；Q503 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0120-02▲
巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)是一种专门催化芳香族和杂环化合物的巯基甲基化反应的胞内酶，与临床上使用的巯基嘌呤类药物的代谢有重要关系。而巯基嘌呤类药物在临床上已使用多年，常用的药物为6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AT)，主要用于白血病和肿瘤的化疗、器官移植受者的免疫抑制治疗以及自身免疫性疾病的治疗〔1，2〕。随着对这类药物的作用机制和代谢过程的深化研究，已经发现TPMT在人群中分布的多样性，特别是发现TPMP的基因突变与酶缺陷的关系后，使本领域的研究更加活跃。本文就TPMT活性测定和突变基因的检测及其临床意义作一综述。
, 百拇医药
1 TPMT的生化特性及其多态性
TPMT是在哺乳动物的鸟类当中发现的一种细胞内的甲基转移酶。该酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供应者，催化芳香族和杂环化合物的硫原子甲基化。它最初是在鼠的肾脏和肝脏中发现的，后来发现在多数组织中都存在，如心、血细胞、胎盘、胰腺、小肠等，而且在人的这些组织及红细胞中也发现了TPMT〔3，4〕。TMPT的分子量为28kDa，由245个氨基酸残基组成，其酶活性不依赖金属离子。人肾脏TPMT的最适pH为7.5，而人红细胞中TPMT的最适pH为6.7。通过离子交换层析分析，人肾、肝脏中的TPMT存在两种异构体，但具有相同的分子量和催化活性。
TPMT在巯基嘌呤代谢中具有重要作用，它的催化特性取决于MP或TG底物。用放射掺合法测定纯化的人肾脏TPMT催化甲基化反应的Km值，当底物是MP时，该值是383μm；当底物是TG时，该值是557μm〔5〕。TPMP的抑制物有L-甲硫氨酸、6-甲硫醇嘌呤、3.4-二甲基-5-羟基苯甲酸，它们对TPMT活性的抑制作用呈剂量依赖关系。
, 百拇医药
人类红细胞内TPMT活性与肝、肾、白细胞、急性淋巴母细胞性白血病的淋巴细胞的TPMT活性是呈正相关的，因而红细胞成为测定TMPT最容易得到的组织。根据Klemetsdal的报道〔6〕，不同人种红细胞的TPMP活性是有差异的。例如挪威北部莎弥人的TPMT活性就高于该地区非莎弥的白种人；在美国佛罗里达州，黑人的TPMT活性比白人低33%，但黑人和白人中高活性、中等活性的比例是一致的；新加坡华人的TPMT活性高于美国人。以上这些都显示出TMPT结构和生物活性的多态性。
2 TPMT活性测定
如前所述，一则因为RBC与组织细胞中TPMT活性的相关性，二则外周血易于采集，故外周血RBC成为测定TPMT的理想标本来源。而关于RBC溶解物中TPMT活性测定的方法方面较常用的是非螯合的放射化学法〔7〕(简称放射化学法)。放射化学法测定TPMT活性的基本原理是利用该酶的转甲基作用，以14C标记的S-甲基14C-腺苷-甲硫氨酸(14-SAM)为标记甲基的供者，在RBC溶解物中TPMT的催化下使MP接受14C标记的甲基，再以液体闪烁计数测定DPM值，最后计算TMPT活性单位(U/ml pRBC)。
, http://www.100md.com
就具体的放射化学法操作而言，抽取外周血标本后肝素抗凝，精确量取RBC压积，并分离RBC和充分洗涤，再用冷蒸馏水低渗溶解RBC，高速离心后收集上清即为待测的RBC溶解物。在TPMT活性测定正式测验时，先向RBC溶解物中加入MP，再加入新鲜配制的14C-SAM。反应在37℃持续1小时后用碱性硼酸缓冲液终止酶促反应。用乙醇异戊酯分离有机相(含接受14C甲基的MP)，测定DPM值后计算出TPMT活性单位数。本法测定的1个单位即代表1小时催化形成1nmol的甲基化硫基嘌呤。正常人外周血RBC溶解物的TPMT约为12～15U/ml pRBC。
3 TPMT的基因突变与检测
在TPMT缺陷的病人中发现的第一种突变(称为TPMT2)是第80位密码子改变，即发生了G238→C颠换，由此导致丙氨酸80→脯氨酸(Alu80→Pro)，使TPMT活性上百倍地下降〔8〕。据推测产生这种现象的原因是由于Alu80→Pro后，引起了TPMT二级结构的改变，产生了另一种折迭形式，改变了酶蛋白的稳定性，致使酶活性丧失。发现的另一种突变(称为TPMT3)是在TPMT的ORF出现了两个核苷酸的转换，即G460→A和A719→G，导致相应的氨基酸由丙氨酸154→苏氨酸和酪氨酸240→半胱氨酸〔9〕。根据研究发现，产生这种突变后可使细胞内TPMT蛋白的含量下降，可比野生型低400倍，从而导致该酶缺陷。
, 百拇医药
而有关TPMT基因突变检测方法的建立，正是基于上述点突基础的〔8，9〕。如G460→A的突变破坏了内切酶MwoⅠ的识别位点，而719→G的突变则增加了酶Acel的切割位点，因而建立了TPMT3特异性的PCR-RFLP。对于G460→A突变是设计内含子6和外显子7的特异引物，进行PCR扩增，得到了304bp的基因DNA片段，其中包括了G460→A突变，再用MwoⅠ酶切后进行PCR-RFLP分析；而对于A719→G突变设计内含子9和外显子10的特异引物，通过PCR扩增后用Acel酶切，再做PCR-RFLP分析。通过此分析，可得到TPMT3的突变频率。据报道的对22名无关的TPMT缺陷患者的PCR-RFLP分析结果，发生TPMT3型突变的占17人，而且其中15人为G460和A719均发生突变，在另两人中，一人仅出现G460突变，而另一人仅出现A719突变。对于TPMT2型突变(G238)，虽然G238突变后失去CviRⅠ的酶切位点，但由于CviRⅠ不能彻底消化野生型的DNA，因而还未建立可测出这种突变的PCR-RFLP方法，但已建立了G238突变特异性的PCR方法，即用内含子4/外显子5和内含子5的特异引物，进行PCR扩增后分析。通过用此法测定，发现美国人群中TPMT2型突变的发生是比较少的。
, 百拇医药
4 TPMT突变检测的临床意义
临床上广为使用的巯基嘌呤类药物主要有6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AG)。MP用于治疗急 性淋巴母细胞白血病(ALL)已40多年，至今仍是ALL治疗方案中不可缺少的药物。而AT则已成为免疫抑制治疗的三联药物之一，已广泛用于肾移植病人。近来报道还可用于治疗自身免疫性肝炎，且效果良好〔1〕。巯基嘌呤类药物在体内的代谢主要有两条途径，一是在TPMT的催化下使硫基甲基化，二是在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化成硫尿酸。由于造血组织中缺乏黄嘌呤氧化酶，该组织中的嘌呤类药物主要靠TPMT催化分解，因而TPMT缺陷的病人，如果使用了常规剂量的MP、AT和TG时，则会引起巯基嘌呤类药物在体内堆积，而且主要影响造血系统，轻者引起中毒和影响治疗效果，重者可致死亡。虽然测定RBC中的TPMT活性可诊断TPMT缺陷，但由于肿瘤病人和器官移植受者接受同种异体输血后，干扰了TPMT活性的检测结果。故对TPMT缺陷者最好采用基因诊断。通过建立PCR和PCR-RFLP分析法，可测定>80%的TPMT缺陷的基因，并有助于提高基因诊断水平，为将来的基因治疗奠定基础。中国是发展中国家，由于经济的制约，近邻结婚较为常见，故TPMT缺陷的发生频率可能还会高一些，因而特别有必要开展这方面的检查和研究，更好地造福于患者。■
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Hollander AAM，van Saase JLCM，Kootte AMM，et al.Lancet，1995；345∶610-664.
[2] Johsaon PJ，McFarlane IG，William SR.New Engl J Med，1995，333∶958-963.
[3] Woodson LC，Ames MM，Selssie CD，et al.Molec Pharmacol，1983；24∶471-478.
[4] Szumlanski CL，Honchel R，Scott MC，et al.Pharmacogen，1992；2∶148-159.
[5] Deininger M，Szumalanski CL.Otterness DM，et al.Biochem Pharmacol，1994；48∶2135-2138.
, 百拇医药
[6] Klemetsdal B，Straume B，Wist E，et al.Eur J Clin Pharmacol，1993；44∶147-152.
[7] Mclood HL，Relling MV Liu Q，et al.Blood，1995；85(7)∶1897-1902.
[8] Krynetski EY，Krynetskaia NF，Yanishevski Y，et al.Molec Pharmacol，1995；47∶1141-1147.
[9] Tai HL，Krynetski EY，Evans WE.ISSX Pro-ceedings，1995；8∶103-106.
收稿日期：1999-12-14, 百拇医药