单位：徐卫明 朱贤立(同济医科大学附属协和医院神经外科，湖北武汉430022)
关键词：星形细胞瘤；新生血管化；碱性成纤维细胞生长因子；增殖；预后
癌症000118
摘 要：目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在幕上星形细胞瘤中异常表达对肿瘤新生血管形成能力和肿瘤细胞增殖的影响。方法：在71例幕上星形细胞瘤中，采用免疫组织化学技术检测bFGF蛋白和FGF受体表达，同时染色因子Ⅷ相关抗原以显示血管内皮细胞，染色增殖细胞核抗原(PCNA)反映肿瘤细胞增殖活性，并运用计算机辅助图像分析结合组织化学技术测定肿瘤细胞核的DNA倍体含量。结果：bFGF阳性染色位于肿瘤细胞的胞浆或胞核中，在肿瘤间质血管也有表达。FGFR阳性染色在肿瘤细胞和间质血管上均可观察到。bFGF表达与星形细胞瘤分级有密切关系(P<0.01)，高级别肿瘤细胞有较高水平的表达。相关分析显示，bFGF表达与肿瘤内微血管密度、PCNA标记指数和DNA倍体含量呈正相关(P<0.01)。预后分析显示,bFGF表达阳性组病人比bFGF表达阴性组病人的生存率要低(P<0.01)。结论：bFGF参与了星形细胞瘤新生血管形成和肿瘤细胞的增殖，对肿瘤的发展有重要作用。
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分类号：R739.41,R730.21 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0061-05
Expression of basic fibroblast growth factor in
supratentorial astrocytic tumors and its implication
XU Wei ming, ZHU Xian li
(Department of Neurosurgery, Union Hospital, Tongji Medical University， Wuhan 430022,P.R.China)
Abstract：Objective：To investigate the role of basic fibroblast growth factor (bFGF) on angiogenesis and tumor cell proliferation in supratentorial astrocytic tumors. Methods：A total of 71 specimens resected from patients with supratentorial astrocytic tumors were investigated using immunohistochemical staining with antibodies against bFGF and FGF receptor (FGFR). A polycolonal antibody against human Factor Ⅷ related antigen (F-Ⅷ RAg) was used to identify blood vessels and a monoclonal antibody against proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was used as a marker for proliferating cells. The cellular DNA ploidy of tumors was measured by quantitative image analysis combined with histochemistry techniques. Results： Positive immunostaining for bFGF was observed in tumor cell nuclei or cytoplasm, as well as in microvessels. FGFR also showed strong reactivity in tumor cells and microvascular wall. The expression of bFGF was in correlation with the grade of tumor (P<0.01). The expression of bFGF increased along with the increasing of tumor grading and positively correlated with the microvessel density, PCNA labelling index and DNA polidy of tumor cells (P< 0.01). The patients with positive bFGF expression had poorer survival than the patients with the negative bFGF expression(P< 0.01). Conclusions：bFGF can improve angiogenesis and proliferation of tumor cells. These data support a role for bFGF in the malignancy of human astrocytic tumors.
Key words： Astrocytic tumor; Basic fibroblast growth factor; Neovascularization; Proliferation; Prognosis ▲
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肿瘤新生血管的形成与肿瘤细胞增殖过程中产生和释放的肿瘤血管形成因子有关。迄今已从肿瘤中分离到多种促进血管生长的因子，其中最早发现的一个后来被证实为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。以后研究[1]表明，除了能使内皮细胞增殖外，bFGF还是中胚层、外胚层、内胚层来源的多种细胞的强有丝分裂因子，并且能促进肿瘤细胞的增殖。
本实验采用免疫组织化学方法研究碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)和FGF受体在颅内星形细胞瘤中的表达，分析其在新生血管形成和肿瘤细胞增殖中的作用，并探讨bFGF表达对预后的影响。
1材料和方法
1.1病例及标本
1992～1998年本校附属协和医院和同济医院神经外科手术切除颅内幕上星形细胞瘤71例，其中男46例，女25例，年龄范围2～68岁。平均36.8岁。按Kernohan病理分级，Ⅰ级20例，Ⅱ级18例，Ⅲ级13例，Ⅳ级20例。另外收集4例急性颅脑损伤病人急诊开颅行内减压手术中切除的脑组织作为正常对照。以上标本均经福尔马林固定,常规石蜡包埋。5μm厚连续切片，进行HE染色、免疫组化染色、Feulgen染色及对照实验。
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1.2免疫组化染色
采用SABC法，免疫组化染色包括bFGF、成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)、因子Ⅷ相关抗原(Factor Ⅷ Related Antigen,F-ⅧRAg)和增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)。第一抗体兔抗人VEGF多克隆抗体为SantaCruz公司产品，兔抗人FⅧRAg多克隆抗体为Sigma公司产品，小鼠抗人FGFR和PCNA单克隆抗体为Oncogene公司产品，以上试剂和SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书操作，DAB显色，用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照。
1.3Feulgen染色
参照文献[2]进行操作。
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1.4结果判定
1.4.1bFGF染色结果判定：判定一病例bFGF表达，参考Mattern[3]方法，从以下两方面评分：阳性染色深度(未见染色为0，轻度染色为1，中度染色为2，深度染色为3)和阳性细胞的百分比(未见染色记为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3)，将这两方面得分相加。在未知病理诊断的条件下，在高倍镜下分别观察10个视野平均而得。得分0～2分判为阴性表达，超过2分(3～6)判为阳性表达，其中3～4分为弱阳性，5～6分为强阳性。
1.4.2微血管密度的测定：参照Weidner方法[4]计数肿瘤内微血管密度(MicrovascularDensity,MVD)。先在显微镜低倍(40倍或100倍)视野下全面观察切片，以确定肿瘤内血管密度最高处，即新生血管形成最活跃的“热点”区域，再在高倍(200倍,0.74mm2/视野)视野下，以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数。管腔结构及内含红细胞并非计数所必须。每个标本记录5个高倍(200倍)视野下微血管计数,取其平均值作为该病例的MVD值。
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1.4.3PCNA标记指数判定：PCNA蛋白阳性染色位于细胞核。在不知病理诊断结果的条件下，先在低倍镜下选择染色阳性的高密度区域，再换高倍镜(400倍)观察，至少计数500个肿瘤细胞，其中阳性细胞所占百分比即为PCNA标记指数(PCNALabellingIndex,PCNALI)。
1.4.4DNA倍体分析：采用北京航空航天大学研制的CMIAS真彩色病理图像分系统进行DNA倍体分析[2]，用Feulgen染色切片测得细胞核积分光密度值(简称IOD)代表细胞核DNA相对含量。每张切片随机测量100个以上病变细胞，并在同张切片上测定50个以上淋巴细胞IOD值做为该例的正常二倍体(2C)对照。
1.5病例随访
在71例病人中，52例病人收集到符合预后分析的随访资料。对资料齐全的病人进行预后分析。
1.6统计学处理
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数据处理在统计软件STATA5.0上完成，bFGF蛋白表达与肿瘤病理级别的关系用Pearson卡方检验，MVD、PCNALI、DNA倍体含量在各级别肿瘤中的差异采用方差分析，bFGF蛋白表达与PCNALI、MVD及DNA倍体含量的关系采用Spearman相关分析检验，表达bFGF蛋白阴性和阳性的患者按照KaplanMeier法作生存率曲线，进行Wilcoxon-Gehan检验。
2结果
2.1bFGF蛋白表达及其与星形细胞瘤病理级别的关系
阳性bFGF蛋白免疫组化染色位于细胞胞浆，为棕黄色，在高倍视野下观察呈颗粒状。在正常脑组织中未观察到bFGF免疫组化阳性染色。在肿瘤的血管内皮细胞、基底膜和血管壁上有集中表达，表现为不同程度的棕黄色，见图1、2。经统计分析，bFGF蛋白表达与肿瘤病理分级密切相关，P<0.01，有极显著意义(见表1)。
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图1 多形细胞瘤，bFGF免疫组化阳性反应呈棕黄色，位于肿瘤细胞胞浆,×400
图2 星形细胞瘤Ⅱ级,bFGF免疫组化染色，部分肿瘤细胞呈阳性反应,×400
表1 星形细胞瘤中bFGF蛋白表达 级别
n
阳性
弱阳性
强阳性
Ⅰ
20
14
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6
0
Ⅱ
18
7
10
1
ⅢⅣ
13
2
7
4
20
1
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8
11
合计
24
24
31
16
2.2FGF受体在星形细胞瘤中的表达
阳性FGF受体免疫组化染色呈棕黄色，位于胞浆和胞膜。在星形细胞瘤中，肿瘤细胞和血管上均有阳性染色，见图3。
图3 FGF受体免疫组化染色，阳性反应呈棕黄色，位于增生的血管内皮和部分肿瘤细胞胞浆和胞膜上,×200
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2.3MVD、PCNALI和DNA倍体含量与肿瘤级别的关系
经F-ⅧRAg免疫组化染色，所有毛细血管、小静脉、小动脉内皮细胞染成棕黄色，见图4，PCNA阳性染色位于细胞核内，见图5，经方差分析，MVD、PCNALI和DNA倍体含量与肿瘤病理级别均密切相关，有极显著意义，P<0.01，见表2。
图4 星形细胞瘤Ⅲ级F-ⅧRAg免疫组化染色，微血管及出芽状生长的内皮细胞染成棕黄色,×200
图5 星形细胞瘤Ⅲ级PCNA免疫组化染色，部分肿瘤细胞核呈阳性反应,×400
表2 各级别肿瘤内MVD、PCNALI和DNA倍体含量(
±s) 级别
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n
MVD
PCNALI
DNA倍体含量
(个数/200倍视野)
(%)
(核积分光密度值)
Ⅰ
20
39.6±23.4
9.5±8.8
2.57±0.44
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Ⅱ
18
47.6±29.9
17.0±12.2
3.97±0.95A
Ⅲ
23
79.0±25.6Ab
47.3±11.2AB
6.25±1.28AB
Ⅳ
20
106.2±35.9AB
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67.7±20.8ABC
6.63±0.86AB
合计
71
67.6±40.1
34.7±28.3
4.77±1.96
注：A、B、C分别与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级比较差异有极显著意义，P<0.01，b与Ⅱ级比较差异有显著意义，P<0.05
2.4bFGF蛋白表达与MVD、PCNALI和DNA倍体含量的关系
将bFGF蛋白表达评分与MVD、PCNALI和DNA倍体含量作相关分析，相关系数分别为r1=0.5038,r2=0.7727，r3=0.6442，经检验bFGF蛋白表达与三者均密切相关，有极显著意义，P<0.01。
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2.5bFGF蛋白表达与预后的关系
将52例有齐全随访资料的病人分成bFGF蛋白表达阳性组和阴性组，作出Kaplan-Meier生存率曲线图，见图6，进行Wilcoxon-Gehan检验，P<0.001，bFGF蛋白表达对生存率有极显著影响，bFGF蛋白表达阴性组病人的生存率大于bFGF蛋白表达阳性组病人。
图6 bFGF表达阴性组和阳性组患者生存率曲线图
3讨论
bFGF是一种强促有丝分裂因子，它与细胞膜上的受体结合后可刺激多种来源的细胞增殖、分化，已发现bFGF在多种肿瘤细胞中均有表达。我们观察到星形细胞瘤内血管上有FGF受体表达，提示bFGF可作用于星形细胞瘤间质内血管组织对血管再生产生影响。我们在实验中发现星形细胞瘤中bFGF蛋白表达上调，并且与肿瘤内微血管密度呈正相关，说明bFGF蛋白表达促进了幕上星形细胞瘤新生血管的形成。体外研究[5]表明bFGF可促进细胞外基质降解，并可直接作用于血管内皮细胞，诱导其从基膜中脱离出来，向肿瘤区迁移、分裂、增殖，形成新的内皮细胞索，最终形成毛细血管；但在体内诱导新生血管的发生机制尚不清楚。在Abe[6]的离体试验中，与人胶质瘤细胞一同培养的小牛血管内皮细胞可以形成类似血管的结构，一旦培养液中加入抗bFGF抗体，就阻止了这种血管样结构的产生。这提示bFGF可能以一种“旁分泌”方式影响肿瘤新生血管的形成。
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另外，bFGF受体在星形细胞瘤细胞上也有表达，这使得bFGF不仅能移出细胞外作用于邻近的血管组织，还能作用于肿瘤细胞本身刺激肿瘤细胞增殖、生长[1]。FGF与受体结合可以通过影响RNA聚合酶Ⅰ，加强核蛋白体基因的转录，促进细胞内G0-G1、G1-S期转换，从而促进细胞的分裂与增殖[7]。在实验中，我们观察到bFGF蛋白表达与星形细胞瘤的病理级别关系密切，高级别肿瘤中bFGF蛋白表达明显增多。细胞核DNA倍体含量能准确地判断肿瘤细胞的恶性程度，客观地反映肿瘤细胞的生物学特性，是代表肿瘤细胞增殖活性的重要指标[8]。实验显示星形细胞瘤DNA倍体含量随着病理级别的增高而明显增高，并且与bFGF蛋白表达密切相关。细胞增殖核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，为细胞周期所必需的物质，常用来作为反映细胞增殖活性的标志物[9]。实验中观察到较高级别的星形细胞瘤PCNA标记指数(PCNALI)要高于较低级别的肿瘤，我们在实验中还发现bFGF蛋白表达与PCNALI呈正相关，并有极显著意义，提示bFGF在星形细胞瘤的增殖中发挥了重要作用。bFGF蛋白表达随着病理级别的增高而明显增加，说明星形细胞瘤中bFGF表达极大地推动了肿瘤的恶性进展。预后分析中，bFGF蛋白表达阳性组预后要明显比bFGF蛋白表达阴性组差，进一步显示了bFGF在肿瘤的恶性进程中的重要作用。
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本研究结果表明，在星形肿瘤中bFGF蛋白存在着过度表达，过度表达的bFGF与肿瘤新生血管的形成和肿瘤细胞恶性程度及增殖活力有密切关系，检测bFGF表达在病理诊断和临床预后上具有潜在的价值。过度表达的bFGF还为将来抗血管生长，治疗星形细胞瘤提供了一个治疗靶标，这使得可以通过封闭bFGF表达来抑制肿瘤血管再生和肿瘤细胞生长。
*通讯作者：Tel：86-27-85726833
Fax：86-27-85776343
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收稿日期：1999-07-21, 百拇医药