自由基损伤红细胞引起的大鼠脑微血管功能障碍及硒的保护作用自由基.SOD.微生态制剂
作者：段重高 李宏伟 张坚 黄益民 刘舒 刘燕霞 刘丹晶 修瑞娟
单位：段重高(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；李宏伟(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；张坚(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；修瑞娟(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；黄益民(北京心肺疾病研究所)；刘舒(北京心肺疾病研究所)；刘燕霞(北京心肺疾病研究所)；刘丹晶(北京心肺疾病研究所)
关键词：硒；红细胞；脑；微循环
中国微循环000105
【摘要】 目的 研究大鼠颈静脉回输自由基损伤红细胞所致的脑微血管功能障碍及硒的保护作用。方法 采用Fenton羟自由基体系Haber-Weiss反应体外造成红细胞损伤 ，激光衍射法测定红细胞变形性表示其损伤程度。应用荧光标记和微循环数字图像处理技术分别检测对照组、自由基损伤组和硒保护组脑微血管管径、微血管自律运动、红细胞流速及微血管通透性的变化。结果 自由基损伤导致红细胞变形性降低35%，硒保护组红细胞变形性仅降低15%。脑微循环检测显示自由基损伤组微血管管径变小。微动脉管径变化较明显，5min达高峰，约30min恢复正常水平；微静脉管径变化较缓慢，10min达高峰，约60min恢复；微血管自律运动紊乱，微动脉较明显；红细胞流速明显减慢，5min时微动脉、微静脉内红细胞速度分别减慢31%和35%；微血管通透性增加，5min时微动脉、微静脉通透性分别增加25%和34%。硒保护组上述指标均无显著性变化(P>0.05)。结论 自由基损伤的红细胞可引起大鼠脑微血管功能障碍，微量元素硒有一定保护作用。
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The Protective Effect of Selenium on Cerebral Microcirculatory Disturbance Induced by Free Radical-injured Erythrocyte in Rats
Duan Chonggao, Li Hongwei, Zhang Jian, et al.
(Institute of Microcirculation, CAMS ＆ PUMC, Beijing 100005)
【Abstract】 Objective To find out if selenium has protective effect on cerebral microcirculatory disturbance induced by free radical-injured erythrocyte. Methods Haber-Weiss reaction of Fenton system was used in vitro for producing hydroxy free radical, and then injured erythrocyte was made and transfused back into the same rat. In the selenium protective group, 10 μg selenium was added into the above reactive system. The degree of erythrocyte injury was demonstrated by erythrocyte deformability, using ektacytometry methods. Microvessel diameter, vasomotion, erythrocyte flow velocity and microvascular permeability were measured using MCIP dynamic digital image analysis system. Results The results showed that erythrocyte deformability was 35% lower in the free radical-injured erythrocyte group, while in the organic Se group, there was only 15% decrease, and in inorganic Se group, the decrease was 20%. Perfusion of free radical-injured erythrocyte back into the rat caused significant cerebral microcirculatory disturbance:microvessels contracted and the decrease of arteriole diameter reached its peak after 5 min, recovered gradually to normal in 30 min. The reaction and recovery of venule diameter occurred slower, with its peak of constricting at 10 min and recovery in about 1 hour. Vasomotion disorder was found in arteriole. The flow velocity of erythrocyte in microvessel decreased significantly and the microvascular permeability was increased. There was no change in microvessel diameter, vasomotion,permeability and velocity of erythrocyte in the control group with re-perfusion of normal erythrocyte and in the injured erythrocyte group with selenium protection (P>0.05). Conclusion This study revealed that free radical-injured erythrocyte could cause cerebral microcirculatory disturbance and Selenium has protective effect on it.
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【Key words】 Selenium RBC Brain Microcirculation
体外循环心内直视手术的病人在术中心肌缺血/再灌注期间，心肌组织产生并释放大量自由基，通过攻击红细胞膜蛋白和脂质分子造成红细胞膜流变性降低，影响器官微循环[1]。为了探讨自由基损伤的红细胞对大鼠脑微血管功能的影响及微量元素硒有无保护作用，我们将实验大白鼠分为自由基损伤组和硒保护组，对其脑微血管管径动态变化特征、自律运动、通透性及红细胞流速进行了连续观察和定量检测。
材料与方法
1 自由基体系 选用羟自由基体系(Fenton体系Haber-Weiss反应)。按照0.5：1：1.5的容积比将3%H2O2、450μmol/L的FeSO4和1.8%的NaCl混合配制成等渗 、pH7.0的羟自由基体系。分别在体系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉剂DMPO(5.5-Dymethyl-1-Pyroline-N-Oxide, Sigma 公司)捕捉自由基，用电子自旋共振波谱仪(ESR，Bruker ER-200D)测定自由基水平，证明羟自由基体系配制后即刻产生大量自由基，1h内浓度保持不变。
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2 红细胞悬液配制 经颈动脉插管取血5ml，肝素抗凝，离心获取新鲜红细胞。将之用3%牛血清白蛋白PBS清洗两遍，再悬浮于此液中配成压积40%的正常红细胞悬浮液；将新鲜红细胞与上述自由基体系在室温下作用30min，再用3%牛血清白蛋白PBS清洗两遍，悬浮于此液中即配成自由基损伤红细胞悬浮液；硒保护红细胞悬浮液的配制是在自由基体系开始作用的同时加入10μg有机硒(硒力口服液，硒力药业公司产品)或无机硒(亚硒酸钠)。用激光衍射法测定红细胞变形性，表示红细胞损伤程度。
3 大鼠脑微血管功能参数的检测 3.1 实验动物分组及模型制备：Wistar健康雄性大鼠48只，体重200～250g，由中国医学科学院基础医学研究所动物室提供。随机分为正常红细胞对照组、自由基损伤红细胞组、有机和无机硒保护组共4组，每组12只。实验室温度控制在20～26℃，麻醉用乌拉坦100mg/100g皮下注射。颈静脉插管作给药及输入红细胞用，颈动脉插管作取血用。为观测脑循环，采用开放式颅骨窗技术[2]。动物卧位固定于特制手术台上，颅顶部位局部消毒后打开皮肤，暴露颅顶骨。用颅骨钻将颅顶骨小心打开一直径4mm的圆窗，用眼科剪小心将窗内的硬脑膜剪除，暴露出软脑膜。在实验过程中，连续滴注pH7.4、37℃的人工脑脊液。3.2 脑微血管功能参数的检测：将麻醉动物置于微循环显微镜下，连接摄像系统。稳定30min后对脑表面微血管观测和录像。正常微循环录像5min；用对照红细胞悬液换血5ml(经颈静脉缓慢注入正常红细胞悬液5ml，同时由颈动脉等速抽血5ml)，录像15min；然后，自由基损伤红细胞组用自由基损伤红细胞混悬液换血5ml、有机和无机硒保护组分别用有机硒和无机硒保护红细胞混悬液换血5ml，每组分别录像30min。最后回放录像带，用MCIP微循环图像分析处理系统定量测定脑微血管管径动态变化及红细胞流速[3]。检测脑微血管通透性时经颈静脉注射异硫羟基荧光黄标记右旋糖酐(FITC-D，MW 50，700 Sigma公司)1%水溶液1ml/100g体重，在荧光显微镜下观测并连接摄像录像系统。应用生物医学图像处理系统(WinMIP，美国BMICS R ＆ D公司)测量，计量微血管壁外侧的荧光灰度值(共分255级)作为荧光渗出的相对量。
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结 果
1 自由基对红细胞的损伤作用 配制的正常红细胞悬液中红细胞变形性与全血中的红细胞相同；自由基损伤红细胞变形性比正常红细胞降低35%；有机硒组和无机硒组红细胞变形性分别降低15%和20%。以上结果说明自由基可损伤红细胞，降低其流变性；微量元素硒对这种损伤具有一定的保护作用。
2 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管功能的影响
2.1 对微血管管径的影响 大鼠微动脉及微静脉管径在输入正常红细胞悬浮液后连续观测15min与输入前比没有改变；在输入自由基损伤红细胞悬浮液后微动脉和微静脉立即发生收缩反应。微动脉收缩5min达高峰，然后逐渐恢复，约30min恢复正常；微静脉收缩反应较慢，恢复也较慢，10min达高峰，约1h恢复正常。输入有机硒或无机硒保护红细胞悬浮液后，微动脉及微静脉管径与输入正常红细胞悬浮液比无显著变化。说明自由基损伤红细胞可剌激大鼠脑微血管的收缩，影响脑微循环灌注，微量元素硒对这种不良影响有保护作用。见表1。
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2.2 对红细胞流速的影响 输入正常红细胞悬浮液后微静脉内红细胞流速无变化，但微动脉内红细胞流速有所增快，这可能是由于输入的贫氧红细胞悬浮液所致的一过性反应。当输入自由基损伤红细胞悬浮液后，微动脉及微静脉内红细胞流速均明显减慢，5min达到最低点，微动脉内红细胞流速约30min恢复正常，而微静脉内红细胞流速需60min才能恢复。硒对自由基损伤红细胞悬浮液所致的红细胞流速减慢也有明显的保护作用。见表2。
2.3 对微血管自律运动的影响 正常情况下大鼠脑微血管自律运动的振幅和频率比较规律和恒定，输入自由基损伤红细胞悬浮液可打乱其规律性，硒对这种紊乱自律运动的作用也有一定保护作用。见图1。
图1 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管
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自律运动的影响及硒的保护作用
A.正常红细胞组 B.自由基损伤红细胞组 C.有机硒保护组
2.4 对微血管通透性的影响 伴随输入自由基损伤红细胞引起微血管的收缩和红细胞流速的减慢，发生了脑组织的缺氧和微血管通透性增加。本研究发现，输入自由基损伤红细胞后，微动脉及微静脉壁外荧光值明显增高，5min达峰值，说明血管通透性增高，而硒保护组无明显峰值。但微静脉通透性变化与微动脉不同，除了自由基损伤红细胞组通透性有明显增高以外，其它3组与对照组相比，也都呈现出了较轻程度的通透性增高，可能是由于体外输入贫氧的红细胞悬浮液所致。见表3。
表1 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管管径的影响及硒的保护作用(μm,
±s)
分组
, 百拇医药
输入前
输入后(min)
1
5
10
15
20
30
微动脉
正常组
38.7±16.6
36.3±15.5
37.8±14.3
, 百拇医药
37.9±12.3
38.6±12.4
损伤组
38.6±12.4
31.5±14.9
28.7±15.0**
30.9±13.0
33.0±14.6
34.1±16.7
30.7±13.8
有机硒组
20.9±7.83
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19.5±8.07
18.9±6.78
20.2±6.87
22.2±6.25
23.4±6.73
21.3±7.82
无机硒组
30.4±6.25
28.7±8.21
28.4±9.36
27.2±7.20
30.5±9.34
, 百拇医药
34.5±11.4
34.9±13.0
微静脉
正常组
36.0±16.6
32.4±18.7
35.6±16.8
35.2±15.7
35.8±15.7
损伤组
35.8±15.7
32.0±14.1
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25.3±16.0*
23.2±14.3*
25.4±13.8*
25.6±16.9*
27.2±17.6
有机硒组
30.6±15.7
28.3±16.9
30.1±16.9
29.5±14.3
30.2±16.5
, 百拇医药
29.5±16.2
30.5±16.4
无机硒组
30.4±6.3
28.7±8.2
28.4±9.4
27.2±7.2
30.5±9.3
34.5±11.4
34.8±13.0
与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01
表2 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管内红细胞流速的影响及硒的保护作用(μm/s,±s)
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分组
输入前
输入后(min)
1
5
10
15
20
30
微动脉内
正常组
988±186
1037±114
, 百拇医药
1128±148
1112±248
1169±207*
损伤组
1169±207
916±272**
806±302***
967±322*
1073±312*
995±287*
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998±304
有机硒组
1210±152
1123±162
1206±160
1271±198
1311±173
1264±162
1296±151
无机硒组
1168±162
1173±227
, 百拇医药
1141±283
1195±331
1268±218
1275±235
1437±309
微静脉内
正常组
663±184
641±242
697±249
688±221
688±203
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损伤组
688±203
539±233*
444±209***
524±184*
592±241*
551±316*
508±255*
有机硒组
665±148
598±220
, 百拇医药
613±212
595±161
677±198
622±139
718±191
无机硒组
821±173
775±347
665±305
651±294
784±274
696±248
, 百拇医药
858±304
与输入前比*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表3 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管通透性的影响及硒的保护作用(荧光值,±s)
分组
注入荧光素溶液后(min)
0.5
1
2
3
5
, 百拇医药
10
20
微动脉
对照组
62.8±17.9
80.9±32.8
92.4±36.9
79.4±26.6
81.8±28.3
66.7±24.6
68.7±25.0
正常血组
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78.7±31.0
91.0±41.2
94.8±34.8
96.7±44.0*
102±47.9*
102±47.6*
83.0±33.0
损伤组
83.5±7.3***
77.5±18.4***
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85.6±25.4***
98.9±39.0***
109±47.8***
81.2±21.0***
75.7±19.5***
有机硒组
70.2±21.4
84.8±34.0
89.7±37.7
91.2±41.6
, 百拇医药
88.2±39.9
85.9±36.0
92.6±41.7
无机硒组
64.6±14.8
73.7±26.6
74.6±25.3
76.5±29.3
71.9±26.1
70.3±24.1
微静脉
对照组
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62.4±18.6
85.0±30.6
90.6±30.2
80.3±21.7
77.4±18.6
69.5±17.7
71.8±24.8
正常血组
73.3±23.6
91.6±37.6*
100±31.7*
, 百拇医药
96.2±38.5*
101±40.8*
97.4±44.0*
76.2±20.5
损伤组
58.7±10.8
75.1±15.0***
86.5±29.6***
98.2±38.6***
111±58.9***
, 百拇医药
82.9±29.2***
80.6±30.1***
有机硒组
63.0±12.8
82.0±35.1
85.6±36.6
87.9±44.8
89.0±33.5*
77.5±23.3
78.7±30.5
无机硒组
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69.4±15.1
80.5±28.2
84.4±30.5
90.9±37.8
84.0±29.2
83.2±25.5*
与对照组比*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
讨 论
红细胞的变形性是其顺利通过毛细血管完成与组织间物质交换的重要保证。为了造成自由基损伤红细胞对脑微血管功能损伤的动物模型，本研究采用亚铁离子与过氧化氢反应的Fenton自由基体系产生的OH.，导致红细胞变形性的降低。然后用等量换血的方式将变形性降低的红细胞回输进实验大鼠血循环中。
, 百拇医药
自由基降低红细胞变形性的机理比较复杂。红细胞膜由磷脂双层、镶嵌蛋白及支撑于膜内侧的膜骨架蛋白构成[4]。自由基主要通过造成膜蛋白分子氢键破坏及巯基氧化使其二级结构改变、膜磷脂分子亲水区和疏水区的过氧化损伤引起化学结构及构象的改变从而造成这些分子间正常排列及相互作用的破坏，最终致使这些分子的流动性乃至整个红细胞膜的流动性降低[5]。
脑组织耗氧量大而氧储备和能量储备极少，保持脑微循环持续良好的灌注十分重要。在本研究中发现，实验动物体内输入自由基损伤红细胞后，造成了脑微血管功能障碍，表现为微血管收缩、微动脉自律运动规律的紊乱、微血管内红细胞流速变慢及微血管通透性增加等。这些因素都可减少脑组织灌注量，最终累及脑功能。自由基损伤红细胞悬浮液造成脑微血管功能障碍可能是多因素的：(1)自由基损伤红细胞的变形性降低，使其难于通过脑毛细血管甚至堵塞毛细血管，使脑微血管阻力增加甚至发生局部组织暂时缺血；(2)红细胞变形性降低致使血液粘稠度增加，血液流变性异常与微循环障碍是密切相关的；(3)自由基对脑微血管的直接作用。然而，自由基损伤红细胞造成脑微血管功能障碍的确切机理尚待进一步的实验研究提供证据。
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我们的研究提示，自由基对脑微循环具有损伤作用。脑微血管功能障碍直接影响脑组织灌注，微血管通透性增加是脑水肿的病理学基础，提示微血管壁已严重损伤。这与我们同步进行的临床研究发现是一致的：在心脏直视手术过程中，我们检测了病人冠状静脉窦血中自由基水平、红细胞变形性及皮肤微循环灌注，发现在心肌缺血/再灌注后的20min是自由基产生的高峰，此时红细胞变形性及皮肤微循环灌注量均降低。初步研究结果说明，在心脏直视手术及其它具有组织缺血再灌注损伤的病理过程中，自由基对红细胞及重要脏器微循环的损伤和保护应该引起重视。
微量元素硒与生物膜的关系日益受到重视，它在稳定人红细胞膜结构、维持红细胞功能具有重要作用。硒是人体内许多自由基清除剂(如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶)的重要组成部分，具有清除过氧化物的功能。迄今为止，应用硒稳定细胞膜的研究仍多停留在实验研究方面[6,7]，临床研究甚少。我们初步临床研究证明，在手术前口服微量元素硒可有效保护在心内直视手术中心肌缺血/再灌注期间红细胞流变性免受自由基的损伤。结合本实验研究结果可以推测，应用微量元素硒防护在心脏手术中由于缺血再灌注产生的自由基对脑微循环的损伤也是可能的。
, 百拇医药
根据本研究的结果并综合以上各点我们认为，自由基损伤的红细胞变形性降低，可引起脑微血管功能的障碍，主要表现为脑微血管缩舒功能失调、灌注能力低下及微血管壁的损伤。本研究还为在心脏直视手术中应用微量元素硒保护脑组织免受缺血再灌注所产生自由基的损伤提供了理论依据。
国家自然科学基金(39270199)，北京自然科学基金(7942013)资助项目
参考文献
1，黄益民，韩玲，郭金良，等.硒对心肌缺血/再灌注期间冠状静脉窦血中红细胞变形性的保护作用。中华医学杂志1998，78(2)：101
2，Duan CG, Li HW, Xu LN and Xiu RJ.Influences of Puerarin on Microcirculatory Disturbance in Brain of Hamster. Asia Pacific Journal of Pharmacology. 1994,9:93
, 百拇医药
3，Ying XY, Xiu RJ. Dynamic and Still Microcirculatory Image Analysis for Quantitative Microcirculation Research. In:Physiology and Function from Multidimensional Images. Eds: R.S.Acharya and E.A. Hoffman, SPIE Proc. 1994,21:68
4，Singer SJ. The Structure and Functin of Membranes-personal memoir. J Membrane Biol. 1992,129:3
5，黄益民，赵辉，虞欣，等.自由基损伤红细胞膜分子的机理研究.生物物理学报.1997，13(2)：315
6，刘佃辛.硒的分子生物学研究概况.国外医学卫生学分册.1993，3:155
, http://www.100md.com
7，刘为民，李广生，张秀云，等.大鼠心肌自由基含量与微量元素硒的关系.微量元素与健康研究.1995，12(1)：3
(收稿：1999-12-24)
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 植物微生态学
自由基.SOD.微生态制剂
作者：王琦 徐维敏 梁化荣 梅汝鸿
单位：中国农业大学 植物微生态工程研究所，北京 100094)
关键词：, 百拇医药
单位：段重高(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；李宏伟(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；张坚(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；修瑞娟(100005， 北京市，中国医学科学院，中国协和医科大学微循环研究所)；黄益民(北京心肺疾病研究所)；刘舒(北京心肺疾病研究所)；刘燕霞(北京心肺疾病研究所)；刘丹晶(北京心肺疾病研究所)
关键词：硒；红细胞；脑；微循环
中国微循环000105
【摘要】 目的 研究大鼠颈静脉回输自由基损伤红细胞所致的脑微血管功能障碍及硒的保护作用。方法 采用Fenton羟自由基体系Haber-Weiss反应体外造成红细胞损伤 ，激光衍射法测定红细胞变形性表示其损伤程度。应用荧光标记和微循环数字图像处理技术分别检测对照组、自由基损伤组和硒保护组脑微血管管径、微血管自律运动、红细胞流速及微血管通透性的变化。结果 自由基损伤导致红细胞变形性降低35%，硒保护组红细胞变形性仅降低15%。脑微循环检测显示自由基损伤组微血管管径变小。微动脉管径变化较明显，5min达高峰，约30min恢复正常水平；微静脉管径变化较缓慢，10min达高峰，约60min恢复；微血管自律运动紊乱，微动脉较明显；红细胞流速明显减慢，5min时微动脉、微静脉内红细胞速度分别减慢31%和35%；微血管通透性增加，5min时微动脉、微静脉通透性分别增加25%和34%。硒保护组上述指标均无显著性变化(P>0.05)。结论 自由基损伤的红细胞可引起大鼠脑微血管功能障碍，微量元素硒有一定保护作用。
, 百拇医药
The Protective Effect of Selenium on Cerebral Microcirculatory Disturbance Induced by Free Radical-injured Erythrocyte in Rats
Duan Chonggao, Li Hongwei, Zhang Jian, et al.
(Institute of Microcirculation, CAMS ＆ PUMC, Beijing 100005)
【Abstract】 Objective To find out if selenium has protective effect on cerebral microcirculatory disturbance induced by free radical-injured erythrocyte. Methods Haber-Weiss reaction of Fenton system was used in vitro for producing hydroxy free radical, and then injured erythrocyte was made and transfused back into the same rat. In the selenium protective group, 10 μg selenium was added into the above reactive system. The degree of erythrocyte injury was demonstrated by erythrocyte deformability, using ektacytometry methods. Microvessel diameter, vasomotion, erythrocyte flow velocity and microvascular permeability were measured using MCIP dynamic digital image analysis system. Results The results showed that erythrocyte deformability was 35% lower in the free radical-injured erythrocyte group, while in the organic Se group, there was only 15% decrease, and in inorganic Se group, the decrease was 20%. Perfusion of free radical-injured erythrocyte back into the rat caused significant cerebral microcirculatory disturbance:microvessels contracted and the decrease of arteriole diameter reached its peak after 5 min, recovered gradually to normal in 30 min. The reaction and recovery of venule diameter occurred slower, with its peak of constricting at 10 min and recovery in about 1 hour. Vasomotion disorder was found in arteriole. The flow velocity of erythrocyte in microvessel decreased significantly and the microvascular permeability was increased. There was no change in microvessel diameter, vasomotion,permeability and velocity of erythrocyte in the control group with re-perfusion of normal erythrocyte and in the injured erythrocyte group with selenium protection (P>0.05). Conclusion This study revealed that free radical-injured erythrocyte could cause cerebral microcirculatory disturbance and Selenium has protective effect on it.
, 百拇医药
【Key words】 Selenium RBC Brain Microcirculation
体外循环心内直视手术的病人在术中心肌缺血/再灌注期间，心肌组织产生并释放大量自由基，通过攻击红细胞膜蛋白和脂质分子造成红细胞膜流变性降低，影响器官微循环[1]。为了探讨自由基损伤的红细胞对大鼠脑微血管功能的影响及微量元素硒有无保护作用，我们将实验大白鼠分为自由基损伤组和硒保护组，对其脑微血管管径动态变化特征、自律运动、通透性及红细胞流速进行了连续观察和定量检测。
材料与方法
1 自由基体系 选用羟自由基体系(Fenton体系Haber-Weiss反应)。按照0.5：1：1.5的容积比将3%H2O2、450μmol/L的FeSO4和1.8%的NaCl混合配制成等渗 、pH7.0的羟自由基体系。分别在体系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉剂DMPO(5.5-Dymethyl-1-Pyroline-N-Oxide, Sigma 公司)捕捉自由基，用电子自旋共振波谱仪(ESR，Bruker ER-200D)测定自由基水平，证明羟自由基体系配制后即刻产生大量自由基，1h内浓度保持不变。
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2 红细胞悬液配制 经颈动脉插管取血5ml，肝素抗凝，离心获取新鲜红细胞。将之用3%牛血清白蛋白PBS清洗两遍，再悬浮于此液中配成压积40%的正常红细胞悬浮液；将新鲜红细胞与上述自由基体系在室温下作用30min，再用3%牛血清白蛋白PBS清洗两遍，悬浮于此液中即配成自由基损伤红细胞悬浮液；硒保护红细胞悬浮液的配制是在自由基体系开始作用的同时加入10μg有机硒(硒力口服液，硒力药业公司产品)或无机硒(亚硒酸钠)。用激光衍射法测定红细胞变形性，表示红细胞损伤程度。
3 大鼠脑微血管功能参数的检测 3.1 实验动物分组及模型制备：Wistar健康雄性大鼠48只，体重200～250g，由中国医学科学院基础医学研究所动物室提供。随机分为正常红细胞对照组、自由基损伤红细胞组、有机和无机硒保护组共4组，每组12只。实验室温度控制在20～26℃，麻醉用乌拉坦100mg/100g皮下注射。颈静脉插管作给药及输入红细胞用，颈动脉插管作取血用。为观测脑循环，采用开放式颅骨窗技术[2]。动物卧位固定于特制手术台上，颅顶部位局部消毒后打开皮肤，暴露颅顶骨。用颅骨钻将颅顶骨小心打开一直径4mm的圆窗，用眼科剪小心将窗内的硬脑膜剪除，暴露出软脑膜。在实验过程中，连续滴注pH7.4、37℃的人工脑脊液。3.2 脑微血管功能参数的检测：将麻醉动物置于微循环显微镜下，连接摄像系统。稳定30min后对脑表面微血管观测和录像。正常微循环录像5min；用对照红细胞悬液换血5ml(经颈静脉缓慢注入正常红细胞悬液5ml，同时由颈动脉等速抽血5ml)，录像15min；然后，自由基损伤红细胞组用自由基损伤红细胞混悬液换血5ml、有机和无机硒保护组分别用有机硒和无机硒保护红细胞混悬液换血5ml，每组分别录像30min。最后回放录像带，用MCIP微循环图像分析处理系统定量测定脑微血管管径动态变化及红细胞流速[3]。检测脑微血管通透性时经颈静脉注射异硫羟基荧光黄标记右旋糖酐(FITC-D，MW 50，700 Sigma公司)1%水溶液1ml/100g体重，在荧光显微镜下观测并连接摄像录像系统。应用生物医学图像处理系统(WinMIP，美国BMICS R ＆ D公司)测量，计量微血管壁外侧的荧光灰度值(共分255级)作为荧光渗出的相对量。
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结 果
1 自由基对红细胞的损伤作用 配制的正常红细胞悬液中红细胞变形性与全血中的红细胞相同；自由基损伤红细胞变形性比正常红细胞降低35%；有机硒组和无机硒组红细胞变形性分别降低15%和20%。以上结果说明自由基可损伤红细胞，降低其流变性；微量元素硒对这种损伤具有一定的保护作用。
2 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管功能的影响
2.1 对微血管管径的影响 大鼠微动脉及微静脉管径在输入正常红细胞悬浮液后连续观测15min与输入前比没有改变；在输入自由基损伤红细胞悬浮液后微动脉和微静脉立即发生收缩反应。微动脉收缩5min达高峰，然后逐渐恢复，约30min恢复正常；微静脉收缩反应较慢，恢复也较慢，10min达高峰，约1h恢复正常。输入有机硒或无机硒保护红细胞悬浮液后，微动脉及微静脉管径与输入正常红细胞悬浮液比无显著变化。说明自由基损伤红细胞可剌激大鼠脑微血管的收缩，影响脑微循环灌注，微量元素硒对这种不良影响有保护作用。见表1。
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2.2 对红细胞流速的影响 输入正常红细胞悬浮液后微静脉内红细胞流速无变化，但微动脉内红细胞流速有所增快，这可能是由于输入的贫氧红细胞悬浮液所致的一过性反应。当输入自由基损伤红细胞悬浮液后，微动脉及微静脉内红细胞流速均明显减慢，5min达到最低点，微动脉内红细胞流速约30min恢复正常，而微静脉内红细胞流速需60min才能恢复。硒对自由基损伤红细胞悬浮液所致的红细胞流速减慢也有明显的保护作用。见表2。
2.3 对微血管自律运动的影响 正常情况下大鼠脑微血管自律运动的振幅和频率比较规律和恒定，输入自由基损伤红细胞悬浮液可打乱其规律性，硒对这种紊乱自律运动的作用也有一定保护作用。见图1。
图1 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管
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自律运动的影响及硒的保护作用
A.正常红细胞组 B.自由基损伤红细胞组 C.有机硒保护组
2.4 对微血管通透性的影响 伴随输入自由基损伤红细胞引起微血管的收缩和红细胞流速的减慢，发生了脑组织的缺氧和微血管通透性增加。本研究发现，输入自由基损伤红细胞后，微动脉及微静脉壁外荧光值明显增高，5min达峰值，说明血管通透性增高，而硒保护组无明显峰值。但微静脉通透性变化与微动脉不同，除了自由基损伤红细胞组通透性有明显增高以外，其它3组与对照组相比，也都呈现出了较轻程度的通透性增高，可能是由于体外输入贫氧的红细胞悬浮液所致。见表3。
表1 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管管径的影响及硒的保护作用(μm,
±s)分组
, 百拇医药
输入前
输入后(min)
1
5
10
15
20
30
微动脉
正常组
38.7±16.6
36.3±15.5
37.8±14.3
, 百拇医药
37.9±12.3
38.6±12.4
损伤组
38.6±12.4
31.5±14.9
28.7±15.0**
30.9±13.0
33.0±14.6
34.1±16.7
30.7±13.8
有机硒组
20.9±7.83
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19.5±8.07
18.9±6.78
20.2±6.87
22.2±6.25
23.4±6.73
21.3±7.82
无机硒组
30.4±6.25
28.7±8.21
28.4±9.36
27.2±7.20
30.5±9.34
, 百拇医药
34.5±11.4
34.9±13.0
微静脉
正常组
36.0±16.6
32.4±18.7
35.6±16.8
35.2±15.7
35.8±15.7
损伤组
35.8±15.7
32.0±14.1
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25.3±16.0*
23.2±14.3*
25.4±13.8*
25.6±16.9*
27.2±17.6
有机硒组
30.6±15.7
28.3±16.9
30.1±16.9
29.5±14.3
30.2±16.5
, 百拇医药
29.5±16.2
30.5±16.4
无机硒组
30.4±6.3
28.7±8.2
28.4±9.4
27.2±7.2
30.5±9.3
34.5±11.4
34.8±13.0
与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01
表2 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管内红细胞流速的影响及硒的保护作用(μm/s,
±s), http://www.100md.com
分组
输入前
输入后(min)
1
5
10
15
20
30
微动脉内
正常组
988±186
1037±114
, 百拇医药
1128±148
1112±248
1169±207*
损伤组
1169±207
916±272**
806±302***
967±322*
1073±312*
995±287*
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998±304
有机硒组
1210±152
1123±162
1206±160
1271±198
1311±173
1264±162
1296±151
无机硒组
1168±162
1173±227
, 百拇医药
1141±283
1195±331
1268±218
1275±235
1437±309
微静脉内
正常组
663±184
641±242
697±249
688±221
688±203
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损伤组
688±203
539±233*
444±209***
524±184*
592±241*
551±316*
508±255*
有机硒组
665±148
598±220
, 百拇医药
613±212
595±161
677±198
622±139
718±191
无机硒组
821±173
775±347
665±305
651±294
784±274
696±248
, 百拇医药
858±304
与输入前比*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表3 自由基损伤红细胞对大鼠脑微血管通透性的影响及硒的保护作用(荧光值,
±s)分组
注入荧光素溶液后(min)
0.5
1
2
3
5
, 百拇医药
10
20
微动脉
对照组
62.8±17.9
80.9±32.8
92.4±36.9
79.4±26.6
81.8±28.3
66.7±24.6
68.7±25.0
正常血组
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78.7±31.0
91.0±41.2
94.8±34.8
96.7±44.0*
102±47.9*
102±47.6*
83.0±33.0
损伤组
83.5±7.3***
77.5±18.4***
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85.6±25.4***
98.9±39.0***
109±47.8***
81.2±21.0***
75.7±19.5***
有机硒组
70.2±21.4
84.8±34.0
89.7±37.7
91.2±41.6
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88.2±39.9
85.9±36.0
92.6±41.7
无机硒组
64.6±14.8
73.7±26.6
74.6±25.3
76.5±29.3
71.9±26.1
70.3±24.1
微静脉
对照组
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62.4±18.6
85.0±30.6
90.6±30.2
80.3±21.7
77.4±18.6
69.5±17.7
71.8±24.8
正常血组
73.3±23.6
91.6±37.6*
100±31.7*
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96.2±38.5*
101±40.8*
97.4±44.0*
76.2±20.5
损伤组
58.7±10.8
75.1±15.0***
86.5±29.6***
98.2±38.6***
111±58.9***
, 百拇医药
82.9±29.2***
80.6±30.1***
有机硒组
63.0±12.8
82.0±35.1
85.6±36.6
87.9±44.8
89.0±33.5*
77.5±23.3
78.7±30.5
无机硒组
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69.4±15.1
80.5±28.2
84.4±30.5
90.9±37.8
84.0±29.2
83.2±25.5*
与对照组比*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
讨 论
红细胞的变形性是其顺利通过毛细血管完成与组织间物质交换的重要保证。为了造成自由基损伤红细胞对脑微血管功能损伤的动物模型，本研究采用亚铁离子与过氧化氢反应的Fenton自由基体系产生的OH.，导致红细胞变形性的降低。然后用等量换血的方式将变形性降低的红细胞回输进实验大鼠血循环中。
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自由基降低红细胞变形性的机理比较复杂。红细胞膜由磷脂双层、镶嵌蛋白及支撑于膜内侧的膜骨架蛋白构成[4]。自由基主要通过造成膜蛋白分子氢键破坏及巯基氧化使其二级结构改变、膜磷脂分子亲水区和疏水区的过氧化损伤引起化学结构及构象的改变从而造成这些分子间正常排列及相互作用的破坏，最终致使这些分子的流动性乃至整个红细胞膜的流动性降低[5]。
脑组织耗氧量大而氧储备和能量储备极少，保持脑微循环持续良好的灌注十分重要。在本研究中发现，实验动物体内输入自由基损伤红细胞后，造成了脑微血管功能障碍，表现为微血管收缩、微动脉自律运动规律的紊乱、微血管内红细胞流速变慢及微血管通透性增加等。这些因素都可减少脑组织灌注量，最终累及脑功能。自由基损伤红细胞悬浮液造成脑微血管功能障碍可能是多因素的：(1)自由基损伤红细胞的变形性降低，使其难于通过脑毛细血管甚至堵塞毛细血管，使脑微血管阻力增加甚至发生局部组织暂时缺血；(2)红细胞变形性降低致使血液粘稠度增加，血液流变性异常与微循环障碍是密切相关的；(3)自由基对脑微血管的直接作用。然而，自由基损伤红细胞造成脑微血管功能障碍的确切机理尚待进一步的实验研究提供证据。
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我们的研究提示，自由基对脑微循环具有损伤作用。脑微血管功能障碍直接影响脑组织灌注，微血管通透性增加是脑水肿的病理学基础，提示微血管壁已严重损伤。这与我们同步进行的临床研究发现是一致的：在心脏直视手术过程中，我们检测了病人冠状静脉窦血中自由基水平、红细胞变形性及皮肤微循环灌注，发现在心肌缺血/再灌注后的20min是自由基产生的高峰，此时红细胞变形性及皮肤微循环灌注量均降低。初步研究结果说明，在心脏直视手术及其它具有组织缺血再灌注损伤的病理过程中，自由基对红细胞及重要脏器微循环的损伤和保护应该引起重视。
微量元素硒与生物膜的关系日益受到重视，它在稳定人红细胞膜结构、维持红细胞功能具有重要作用。硒是人体内许多自由基清除剂(如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶)的重要组成部分，具有清除过氧化物的功能。迄今为止，应用硒稳定细胞膜的研究仍多停留在实验研究方面[6,7]，临床研究甚少。我们初步临床研究证明，在手术前口服微量元素硒可有效保护在心内直视手术中心肌缺血/再灌注期间红细胞流变性免受自由基的损伤。结合本实验研究结果可以推测，应用微量元素硒防护在心脏手术中由于缺血再灌注产生的自由基对脑微循环的损伤也是可能的。
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根据本研究的结果并综合以上各点我们认为，自由基损伤的红细胞变形性降低，可引起脑微血管功能的障碍，主要表现为脑微血管缩舒功能失调、灌注能力低下及微血管壁的损伤。本研究还为在心脏直视手术中应用微量元素硒保护脑组织免受缺血再灌注所产生自由基的损伤提供了理论依据。
国家自然科学基金(39270199)，北京自然科学基金(7942013)资助项目
参考文献
1，黄益民，韩玲，郭金良，等.硒对心肌缺血/再灌注期间冠状静脉窦血中红细胞变形性的保护作用。中华医学杂志1998，78(2)：101
2，Duan CG, Li HW, Xu LN and Xiu RJ.Influences of Puerarin on Microcirculatory Disturbance in Brain of Hamster. Asia Pacific Journal of Pharmacology. 1994,9:93
, 百拇医药
3，Ying XY, Xiu RJ. Dynamic and Still Microcirculatory Image Analysis for Quantitative Microcirculation Research. In:Physiology and Function from Multidimensional Images. Eds: R.S.Acharya and E.A. Hoffman, SPIE Proc. 1994,21:68
4，Singer SJ. The Structure and Functin of Membranes-personal memoir. J Membrane Biol. 1992,129:3
5，黄益民，赵辉，虞欣，等.自由基损伤红细胞膜分子的机理研究.生物物理学报.1997，13(2)：315
6，刘佃辛.硒的分子生物学研究概况.国外医学卫生学分册.1993，3:155
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7，刘为民，李广生，张秀云，等.大鼠心肌自由基含量与微量元素硒的关系.微量元素与健康研究.1995，12(1)：3
(收稿：1999-12-24)
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 植物微生态学
自由基.SOD.微生态制剂
作者：王琦 徐维敏 梁化荣 梅汝鸿
单位：中国农业大学 植物微生态工程研究所，北京 100094)
关键词：, 百拇医药