鲨鱼软骨粉对小鼠移植性肿瘤的抑制作用与微血管的关系
作者：蔡峥嵘 钱睿哲 金惠铭 张国平 PF Davis Yi He
单位：蔡峥嵘(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；钱睿哲(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；金惠铭(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；张国平(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；PF Davis, Yi He(新西兰惠灵顿医学院)
关键词：鲨鱼软骨粉；肿瘤血管形成 微血管；血管内皮生长因子；FIK-1(VEGF)
中国微循环000104
【摘要】 目的 观察鲨鱼软骨粉对小鼠移植性SRS(淋巴瘤)生长的影响与微血管密度的关系。方法 肿瘤称重，切片用vWF免疫组化染色及微血管计算机扫描方法半定量。结果 在已建立的小鼠SRS实体瘤模型上应用口服鲨鱼软骨粉治疗，发现54毫克/d治疗15d后肿瘤重量及微血管密度较对照组明显减少(P<0.05)。治疗组血管内皮生长因子(VEGF)与VEGF受体FIK-1表达明显减少(P<0.05)。结论 上述剂量的鲨鱼软骨粉可抑制小鼠移植性SRS的生长。肿瘤微血管形成的抑制可能是鲨鱼软骨粉抗肿瘤机制之一，后者又与VEGF和FIK-1表达的抑制有关
, http://www.100md.com
Inhibition of Implanting Tumor Growth by Intubation of Powdered Shark Cartilage in Mice and Relationship to Microvascular Density
Cai Zhengrong， Qian Ruizhe, Jin Huiming, et al.
(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University (200032)
Davis, Yi He,(Wellington School of Medicine, New Zealand.)
【Abstract】 Objective To Study the effect of shark cartilage powder on the growth of implanting SRS , its relationship to microvascular density and the expression of VEGF and FIk-1. Method Tumor slides were stained with vWF ：Ag antibody,VEGF antibody and FIk-1 antibody immunohistochemically(ABC) and then were studied by a computerized image processing system. Results The 54mg/day treatment group mice have lower tumor weight and smaller microvascular density compared to control(P<0.05),and the depression of expression of VEGF and its receptor Flk-1 in the treatment group. Conclusion The growth of the mice implanting SRS lymphoma can be suppressed by intubation of shark cartilage powder of 54mg daily after 15d and the expression of VEGF and Flk-1 can be depressed by shark cartilage powder. The inhibition of tumor angiogenesis might be one of the mechanisms of the antitumor efftcts of shark cartilage powder and it relates to the depression of the expression of VEGF and Flk-1.
, 百拇医药
【Key words】 Shark cartilage powder Tumor angiogenesis Microvascular. VEGF FIK-1
口服鲨鱼软骨粉作为一种抗肿瘤的疗法正在临床试用。有人认为其作用机制可能与鲨鱼软骨粉中抗血管形成因子[1-4]有关。用含有鲨鱼软骨粉提取物的聚合物小碟移植于兔角膜可抑制肿瘤新血管网的形成[1,5]。对小鼠肿瘤部位注射鲨鱼软骨粉混悬液可减少肿瘤新生血管的形成[6]，并且现已从鲨鱼软骨粉中提取出抗血管形成因子[7]。因此口服鲨鱼软骨粉的抗肿瘤新生血管形成的作用正在进一步研究中。
本实验将观察口服鲨鱼软骨粉对小鼠移植性实体肿瘤(SRS)生长的影响及其与微血管密度的关系。
材料与方法
, 百拇医药 鲨鱼软骨粉：由新西兰惠灵顿医学院内科研究所提供(来源于Waitaki Biosciences, Christchurch, New Zealand)。
小鼠肿瘤模型：采用6周龄昆明种健康小白鼠126只，随机分为实验组与对照组。本实验采用SRS(Shanghai Reticular Sarcoma)腹水瘤细胞株[8]。该细胞株是于1965年建成L6565病毒性白血病株，并于1971年用6565白血病小鼠的胸腺细胞悬液，接种到昆明种小鼠腹腔，建立了SRS淋巴细胞腹水瘤。用SRS腹水瘤传代小鼠的腹水0.2ml(含肿瘤细胞9.6×103个/m3)，于小鼠左前肢根部腋窝皮下注射。接种肿瘤后第2d开始对实验组小鼠用18号针头经口喂饲各种浓度的鲨鱼软骨粉混悬液(分别为36mg/ml，54mg/ml，72mg/ml，108mg/ml)0.5ml，对照组以同容量的生理盐水代替，1日2次。每5d称重并记录体重。实验第15d处死小鼠并切开皮肤，取出肿瘤，使用精度至0.01g的天平(shangping FA1004)称量肿块重量、摄影，并留取标本，液氮冷冻或置于10%福尔马林中固定保存。
, 百拇医药
将肿瘤标本切片作HE染色及兔抗人Ⅷ因子(vWF)相关抗原抗体(ABC法、DAB显色)染色以显示血管内皮细胞。染色方法如下：肿瘤组织石蜡切片常规二甲苯及系列酒精脱蜡；PBS洗5min；0.3%H2O2处理切片10min，以消除内源性过氧化物酶作用；PBS洗5min3次；0.1mg/ml胰蛋白酶(Trypsin)室温下孵育切片10min；PBS洗5min3次；10%绵羊血清封闭切片(室温下孵育切片10min)，吸去封闭剂，勿洗；加1：100稀释兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(Dako公司，华美公司分装)，1:200稀释兔抗小鼠VEGF、FIK-1抗体(博士德公司),37℃恒温湿盒内孵育60min，或4℃冰箱内孵育16～72h；PBS洗5min3次；加入1：100稀释二抗(Biotin-anti-Rabbit抗体，华美公司)，37℃恒温湿盒内孵育30min。试剂A、B 1：50稀释后等体积混合，37℃孵育30min，即成ABC；切片PBS洗5min3次；切片上加入ABC试剂，37℃恒温湿盒孵育30min；PBS洗5min3次；DAB稀释并加入3%H2O2至终浓度为0.03%H2O2，加入切片显色5～30min，显微镜下控制显色。冲洗切片，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照采用体外培养血管内皮细胞涂片，阴性对照用PBS代替一抗。
, 百拇医药
光学显微镜下作形态观察。通过称重，比较实验组及对照组体重的动态变化及实验结束时两组肿瘤重量的差别，计算肿瘤切片中单位面积里微血管数(MVD)。方法如下[9]：所有切片均采用Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组化染色以显示血管内皮细胞。在100×低倍镜下观察棕染的微血管及小静脉密集区。肿瘤的新生血管(DAB染色棕染)密集区多位于肿瘤与正常组织的交界处，计数时应以血管密集区为准，避免硬化和坏死区。肿瘤组织内散在的单个微血管作为测定灰度值的内参照。计数血管在200×(20×物镜，10×目镜，0.74m/视野)光镜下进行。切片中任何可与周围组织明确区分的棕染内皮细胞及细胞群均作为一个血管计数。血管可无管腔，红细胞不作为血管标志。每张切片计数选用五个视野和血管计数的平均值。所有切片均由两个观察者按统一标准计数。每张切片计数时间均在5～10分钟以上。步骤：1.在切片上四个角及中央用记号笔作好五点标记，使标记尽量分布于正常蓝染的肿瘤组织区域，避开红染的无组织区和裂缝。2.在10×10倍低倍镜下观察，选取计数视野。计数视野的选择，统一选取标记点的左上角。3.在20×20高倍镜下观察并计数微血管。4.将五个计数视野的计数求平均数，将两组数据进行统计学处理。并采用Leica Q500IW图象处理分析系统处理vWF:Ag抗体免疫组化染色切片，采用141nm波长，测试面积为0.7m，在每张切片上选取5个血管密度最大的区(免疫组化棕染的微血管达5个以上[9])，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
, 百拇医药
光学显微镜下观察兔抗小鼠VEGF抗体染色切片，用低倍镜(100×)观察全片染色情况，并确定是否有深棕染的细胞。评价标准为：(1)以肿瘤及其附近的血管内皮细胞浆出现黄色的为阳性表达，按其染色深浅分级评分，不染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深棕黄色为3分。(2)按视野中染色阳性细胞的比例评分。无阳性细胞为0分，阳性细胞<25%为1分，阳性细胞26%～50%为2分，阳性细胞>50%为3分。(1)(2)项相加最大值为6。两项相加大于3者为切片VEGF抗体染色呈阳性。兔抗小鼠Flk-1抗体染色切片处理同vWF:Ag抗体免疫组化染色切片。应用Leica Q500IW图像处理分析系统处理，采用141nm波长，测试面积为0.7mm2，在每张切片上选取深染细胞密度最大的区(微血管密集区)，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
统计学处理：本文实验的计量资料用平均值±标准差表示， 自身比较和组间比较均用t检验， 或χ2检验。
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结 果
1 荷瘤小鼠体重动态变化：在实验的第1d、第5d、第10d、第15d时称量小鼠体重，比较小鼠体重发现各实验组中治疗组及对照组、各性别、各时间点差别均无显著意义，P>0.05。
2 不同剂量鲨鱼软骨粉治疗小鼠15d后收获的部分肿瘤大小：观察比较发现，54mg/d剂量治疗组肿瘤体积明显较对照组小(图1，见插4)。
3 肿瘤重量的变化：根据小鼠灌饲的鲨鱼软骨粉的剂量分组，54mg/d治疗组治疗15d后收获的移植性肿瘤重量明显低于对照组，与其余各组相比较也有明显差异(P<0.05，见图2)。
4 54mg/d剂量治疗组与对照组肿瘤组织中微血管密度： SRS组织切片微血管染色显示， 54mg/d剂量组治疗(图3，见插4)小鼠肿瘤组织中微血管密度明显低于对照组(图4，见插4)。照片中深染处为血管内皮。
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图1 鲨鱼软骨粉54mg/d剂量治疗SRS菏瘤小鼠15d肿瘤大小比较
图2.鲨鱼软骨粉剂量与肿瘤重量效应关系(*P<0.05)
图3 54mg/d剂量治疗小鼠肿瘤组织中微血管免疫组化染色结果(10×20倍)
图4 对照组小鼠肿瘤组织中微血管免疫组化染色结果(10×20倍)
5 肿瘤微血管密度的变化：用vWF抗体免疫组化染色54mg/d剂量组15d治疗后，肿瘤切片中的血管，经肉眼计数(表1)和计算机图象扫描处理结果(表2)发现，治疗组较对照组微血管计数明显减少，P均<0.01。
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表1 治疗组(54毫克/天)与对照组肿瘤切片微血管计数
分组
实验例数
平均值±标准差
对照组
19
9.58±3.75
治疗组
17
5.17±1.98
表2 治疗组(54mg/d)与对照组肿瘤切片Ⅷ因子相关抗原染色灰度扫描
分组
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实验例数
平均值±标准差
对照组
19
0.27±0.08
治疗组
17
0.22±0.10
t=2.56,P<0.05
6 肿瘤重量与肿瘤微血管的关系：在54mg/d治疗组或对照组中，微血管的密度均与实验第15d时收获肿瘤重量呈直线相关，随着微血管密度的增加，肿瘤的重量也随之增加，治疗组r=0.82，对照组r=0.98，两组P均<0.05。
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7 肿瘤VEGF表达情况：用VEGF抗体免疫组化染色54mg/d剂量组15d治疗后肿瘤切片显示其中VEGF表达，结果(表3)发现，治疗组阴性例数较对照组明显增多，P均<0.05。
表3 治疗组(54mg/d)与对照组VEGF抗体染色结果
分组
实验例数
阳性例数
阴性例数
对照组
19
12
7
治疗组
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17
8
9
经χ2检验, P<0.05
8 肿瘤血管内皮细胞Flk-1抗体免疫组化染色：54mg/d剂量组15d治疗后肿瘤切片显示其中Flk-1表达经计算机图像扫描处理结果(表4)发现，治疗组较对照组灰度值明显减少，P<0.05。
表4 治疗组(54mg/d)与对照组Flk-1抗体染色灰度扫描结果
分组
实验例数
平均值±标准差
对照组
, 百拇医药
19
0.19±0.02
治疗组
17
0.11±0.01
t=1.63, P<0.05
9 肿瘤毛细血管密度与肿瘤血管内皮细胞Flk-1表达情况相关性分析：无论在54mg/d治疗组或对照组中，Flk-1表达量均与实验第15d时收获肿瘤微血管的密度呈显著正相关，随着Flk-1表达量的增加，微血管密度也随之增加，治疗组r=0.82，对照组r=0.98，两组P均<0.05。
讨 论
肿瘤的生长、浸润和转移等生物学行为均需新生毛细血管网的支持。恶性肿瘤细胞依靠丰富的新生毛细血管网及时得到其迅速无限生长所需的养料和氧气，并将代谢产物运走，而缺少血供的肿瘤直径只能维持在1～2mm以内。肿瘤在生长过程中可分泌侵蚀血管并促进新生血管形成的物质。人们认识到如能抑制新生血管的形成，将对肿瘤的增长和转移起到抑制作用。并且有报道显示，肿瘤的恶性程度与其毛细血管的密度间有一定的相关关系[5]。因此，近年来，抗血管形成药物成为抗肿瘤物的研究方向。
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鲨鱼软骨是一种自然界中的天然药物。由于鲨鱼软骨占其体重的比例较高，其中无血管存在。鲨鱼软骨在拉美一些国家作为一种传统药物被用于治疗银屑病、乳腺癌等疾病，据报道有一定的疗效。人们在研究其药理作用的过程中，发现其有抑制新生血管形成的效应，引起了医学专家的浓厚兴趣，并开始在某些国家作为抗肿瘤的临床试用药物。
关于口服鲨鱼软骨粉治疗肿瘤的临床观察首先是在古巴、墨西哥、美国进行的，我国也有报道，但其结果非常矛盾[10～15]。近年来，P.E.Davis等[16]用鲨鱼软骨粉掺入饲料中由大鼠自由取食，结果显示口服鲨鱼软骨粉可减少炎症刺激剂诱发的大鼠肠系膜炎性血管形成。但这种方法无法保证每只大鼠摄入规定量的鲨鱼软骨粉，因此，无法确定治疗剂量。在本实验中，采用不同浓度的鲨鱼软骨粉混悬液灌饲移植肿瘤的小鼠，以确保每只小鼠每日摄入定量的鲨鱼软骨粉。实验结果显示，口服鲨鱼软骨粉对小鼠移植肿瘤的生长，在54mg/d治疗中，有明显的抑制作用，并具有统计学意义；而在低剂量组中则无抑制作用。在72mg/d治疗中，具有一定的抑制作用，但无统计意义。随剂量增大，在108mg/d治疗组中，口服鲨鱼软骨粉失去抑制作用，其原因不明。说明鲨鱼软骨粉的抗肿瘤作用在一定的剂量范围内有效。服药后肿瘤切片常规染色及vWF:Ag抗体免疫组化染色显示，54mg/d治疗15d组小鼠肿块平均每视野微血管数较对照明显减少(P<0.01)。经相关分析，肿瘤重量与肿瘤微血管密度间呈显著正相关。提示抑制微血管生长是鲨鱼软骨抗肿瘤作用的可能机制之一。VEGF免疫组化染色结果显示，治疗组较对照组阳性率低。而Flk-1抗体免疫组化染色结果经计算机扫描，治疗组较对照组灰度值低(P<0.05)。经相关分析，肿瘤微血管密度与Flk-1灰度间值呈显著正相关。提示鲨鱼软骨粉抑制肿瘤微血管内皮细胞表面的Flk-1受体的表达是其抑制血管形成作用的可能机制。对其具体作用途径，需进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Oikawa T, Ashino FH, Shimaura M,et al. A novel angiogenic inhibitor derived from Japanese shak cartilage (J). Extraction and estimation of inhibitory activities toward tumor and embryonic angiogenesis. Cancer Lett. 1990,51(3):181
2，沈先荣，贾福星，王玲,等.鲨鱼软骨制剂抗肿瘤作用的研究.中国生化药物杂志.1995,16(4):157
3，蔡平，于志洁.鲨鱼软骨血管生成抑制因子研究发展.海军军事医学.1996，17(2)：33
4，蔡平，于志洁.鲨鱼软骨血管生成抑制因子研究和开发现状.中国海洋药物.1996,15(3)：37
, 百拇医药
5，Moses MA, Sudhalter J, Langer R, Identification of an Inhibitor of neovascularization from Cartilage. Science. 1990,248(4961):1408
6，Cataldi JM, Osborne DL. Effects of shark cartilage on mammary tumor neovascularization in vivo and cell proliferation in vitro(Meeting abstract). FASEB J.1995,9(3):A135
7，焦炳南，王路，缪辉南。鲨鱼软骨中新生血管抑制因子的分离纯化及活性的初步研究.第二军医大学学报.1996,17(2):176
8，程立，郑葆芬，孔宪寿，等.小鼠SRS白血病病毒感染的细胞株的建立及其生物学特性.上海医科大学学报.1986,13(2):91
, 百拇医药
9，Folkman J. What is the evidence that tumors are angiohenesis dependent? J. Cancer Inst.1990,82(1):4
10，沈先荣，贾福星，王玲，等.鲨鱼软骨提取物的抗肿瘤效应及其作用机制.海军军事医学.1996,17(3):4
11，于志洁，吕家本，苏福强，等.沙克1号对Lewis肺癌移植瘤小鼠的抑瘤作用.海军军事医学.1996,17(4):12
12，Sheu JR, Fu CC， Tsai ML, et al. Effect of U-995, a potent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and anti-tumor activities. Anticancer Res.1998,18(6A):4435
, 百拇医药
13，Miller DR, Anderson GT,Stark JJ, et al. Phase Ⅰ/Ⅱtrial of the safety and efficacy of shark cartilage in the treatment of advanced cancer. J Dlin Oncol.1998,16(11):3649
14，Horsman MR, Alsner J, Overgaard J. The effect of shark cartilage extracts on the growth and metastatic spread of the SCCVⅡ carcinoma. Acta Oncol. 1998,37(5):441
15，Ernst E.Shark cartilage for cancer?[letter] Lancet.1998,351(9098):298
16，Davis PF, He Y, Furneaux RH. Inhibition of angiogenesis by oral ingestion of powdered shark cartilage in a rat model. Microvasc. Rec.1197,54(2):
178
(收稿：1999-07-14), http://www.100md.com
单位：蔡峥嵘(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；钱睿哲(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；金惠铭(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；张国平(200032 上海市，上海医科大学病理生理教研室)；PF Davis, Yi He(新西兰惠灵顿医学院)
关键词：鲨鱼软骨粉；肿瘤血管形成 微血管；血管内皮生长因子；FIK-1(VEGF)
中国微循环000104
【摘要】 目的 观察鲨鱼软骨粉对小鼠移植性SRS(淋巴瘤)生长的影响与微血管密度的关系。方法 肿瘤称重，切片用vWF免疫组化染色及微血管计算机扫描方法半定量。结果 在已建立的小鼠SRS实体瘤模型上应用口服鲨鱼软骨粉治疗，发现54毫克/d治疗15d后肿瘤重量及微血管密度较对照组明显减少(P<0.05)。治疗组血管内皮生长因子(VEGF)与VEGF受体FIK-1表达明显减少(P<0.05)。结论 上述剂量的鲨鱼软骨粉可抑制小鼠移植性SRS的生长。肿瘤微血管形成的抑制可能是鲨鱼软骨粉抗肿瘤机制之一，后者又与VEGF和FIK-1表达的抑制有关
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Inhibition of Implanting Tumor Growth by Intubation of Powdered Shark Cartilage in Mice and Relationship to Microvascular Density
Cai Zhengrong， Qian Ruizhe, Jin Huiming, et al.
(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University (200032)
Davis, Yi He,(Wellington School of Medicine, New Zealand.)
【Abstract】 Objective To Study the effect of shark cartilage powder on the growth of implanting SRS , its relationship to microvascular density and the expression of VEGF and FIk-1. Method Tumor slides were stained with vWF ：Ag antibody,VEGF antibody and FIk-1 antibody immunohistochemically(ABC) and then were studied by a computerized image processing system. Results The 54mg/day treatment group mice have lower tumor weight and smaller microvascular density compared to control(P<0.05),and the depression of expression of VEGF and its receptor Flk-1 in the treatment group. Conclusion The growth of the mice implanting SRS lymphoma can be suppressed by intubation of shark cartilage powder of 54mg daily after 15d and the expression of VEGF and Flk-1 can be depressed by shark cartilage powder. The inhibition of tumor angiogenesis might be one of the mechanisms of the antitumor efftcts of shark cartilage powder and it relates to the depression of the expression of VEGF and Flk-1.
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【Key words】 Shark cartilage powder Tumor angiogenesis Microvascular. VEGF FIK-1
口服鲨鱼软骨粉作为一种抗肿瘤的疗法正在临床试用。有人认为其作用机制可能与鲨鱼软骨粉中抗血管形成因子[1-4]有关。用含有鲨鱼软骨粉提取物的聚合物小碟移植于兔角膜可抑制肿瘤新血管网的形成[1,5]。对小鼠肿瘤部位注射鲨鱼软骨粉混悬液可减少肿瘤新生血管的形成[6]，并且现已从鲨鱼软骨粉中提取出抗血管形成因子[7]。因此口服鲨鱼软骨粉的抗肿瘤新生血管形成的作用正在进一步研究中。
本实验将观察口服鲨鱼软骨粉对小鼠移植性实体肿瘤(SRS)生长的影响及其与微血管密度的关系。
材料与方法
, 百拇医药 鲨鱼软骨粉：由新西兰惠灵顿医学院内科研究所提供(来源于Waitaki Biosciences, Christchurch, New Zealand)。
小鼠肿瘤模型：采用6周龄昆明种健康小白鼠126只，随机分为实验组与对照组。本实验采用SRS(Shanghai Reticular Sarcoma)腹水瘤细胞株[8]。该细胞株是于1965年建成L6565病毒性白血病株，并于1971年用6565白血病小鼠的胸腺细胞悬液，接种到昆明种小鼠腹腔，建立了SRS淋巴细胞腹水瘤。用SRS腹水瘤传代小鼠的腹水0.2ml(含肿瘤细胞9.6×103个/m3)，于小鼠左前肢根部腋窝皮下注射。接种肿瘤后第2d开始对实验组小鼠用18号针头经口喂饲各种浓度的鲨鱼软骨粉混悬液(分别为36mg/ml，54mg/ml，72mg/ml，108mg/ml)0.5ml，对照组以同容量的生理盐水代替，1日2次。每5d称重并记录体重。实验第15d处死小鼠并切开皮肤，取出肿瘤，使用精度至0.01g的天平(shangping FA1004)称量肿块重量、摄影，并留取标本，液氮冷冻或置于10%福尔马林中固定保存。
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将肿瘤标本切片作HE染色及兔抗人Ⅷ因子(vWF)相关抗原抗体(ABC法、DAB显色)染色以显示血管内皮细胞。染色方法如下：肿瘤组织石蜡切片常规二甲苯及系列酒精脱蜡；PBS洗5min；0.3%H2O2处理切片10min，以消除内源性过氧化物酶作用；PBS洗5min3次；0.1mg/ml胰蛋白酶(Trypsin)室温下孵育切片10min；PBS洗5min3次；10%绵羊血清封闭切片(室温下孵育切片10min)，吸去封闭剂，勿洗；加1：100稀释兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(Dako公司，华美公司分装)，1:200稀释兔抗小鼠VEGF、FIK-1抗体(博士德公司),37℃恒温湿盒内孵育60min，或4℃冰箱内孵育16～72h；PBS洗5min3次；加入1：100稀释二抗(Biotin-anti-Rabbit抗体，华美公司)，37℃恒温湿盒内孵育30min。试剂A、B 1：50稀释后等体积混合，37℃孵育30min，即成ABC；切片PBS洗5min3次；切片上加入ABC试剂，37℃恒温湿盒孵育30min；PBS洗5min3次；DAB稀释并加入3%H2O2至终浓度为0.03%H2O2，加入切片显色5～30min，显微镜下控制显色。冲洗切片，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照采用体外培养血管内皮细胞涂片，阴性对照用PBS代替一抗。
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光学显微镜下作形态观察。通过称重，比较实验组及对照组体重的动态变化及实验结束时两组肿瘤重量的差别，计算肿瘤切片中单位面积里微血管数(MVD)。方法如下[9]：所有切片均采用Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组化染色以显示血管内皮细胞。在100×低倍镜下观察棕染的微血管及小静脉密集区。肿瘤的新生血管(DAB染色棕染)密集区多位于肿瘤与正常组织的交界处，计数时应以血管密集区为准，避免硬化和坏死区。肿瘤组织内散在的单个微血管作为测定灰度值的内参照。计数血管在200×(20×物镜，10×目镜，0.74m/视野)光镜下进行。切片中任何可与周围组织明确区分的棕染内皮细胞及细胞群均作为一个血管计数。血管可无管腔，红细胞不作为血管标志。每张切片计数选用五个视野和血管计数的平均值。所有切片均由两个观察者按统一标准计数。每张切片计数时间均在5～10分钟以上。步骤：1.在切片上四个角及中央用记号笔作好五点标记，使标记尽量分布于正常蓝染的肿瘤组织区域，避开红染的无组织区和裂缝。2.在10×10倍低倍镜下观察，选取计数视野。计数视野的选择，统一选取标记点的左上角。3.在20×20高倍镜下观察并计数微血管。4.将五个计数视野的计数求平均数，将两组数据进行统计学处理。并采用Leica Q500IW图象处理分析系统处理vWF:Ag抗体免疫组化染色切片，采用141nm波长，测试面积为0.7m，在每张切片上选取5个血管密度最大的区(免疫组化棕染的微血管达5个以上[9])，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
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光学显微镜下观察兔抗小鼠VEGF抗体染色切片，用低倍镜(100×)观察全片染色情况，并确定是否有深棕染的细胞。评价标准为：(1)以肿瘤及其附近的血管内皮细胞浆出现黄色的为阳性表达，按其染色深浅分级评分，不染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深棕黄色为3分。(2)按视野中染色阳性细胞的比例评分。无阳性细胞为0分，阳性细胞<25%为1分，阳性细胞26%～50%为2分，阳性细胞>50%为3分。(1)(2)项相加最大值为6。两项相加大于3者为切片VEGF抗体染色呈阳性。兔抗小鼠Flk-1抗体染色切片处理同vWF:Ag抗体免疫组化染色切片。应用Leica Q500IW图像处理分析系统处理，采用141nm波长，测试面积为0.7mm2，在每张切片上选取深染细胞密度最大的区(微血管密集区)，测定其灰度值，并求其平均值(表示单位面积内的染色物质的吸光强度)、标准差，将两组数据进行统计学处理。
统计学处理：本文实验的计量资料用平均值±标准差表示， 自身比较和组间比较均用t检验， 或χ2检验。
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结 果
1 荷瘤小鼠体重动态变化：在实验的第1d、第5d、第10d、第15d时称量小鼠体重，比较小鼠体重发现各实验组中治疗组及对照组、各性别、各时间点差别均无显著意义，P>0.05。
2 不同剂量鲨鱼软骨粉治疗小鼠15d后收获的部分肿瘤大小：观察比较发现，54mg/d剂量治疗组肿瘤体积明显较对照组小(图1，见插4)。
3 肿瘤重量的变化：根据小鼠灌饲的鲨鱼软骨粉的剂量分组，54mg/d治疗组治疗15d后收获的移植性肿瘤重量明显低于对照组，与其余各组相比较也有明显差异(P<0.05，见图2)。
4 54mg/d剂量治疗组与对照组肿瘤组织中微血管密度： SRS组织切片微血管染色显示， 54mg/d剂量组治疗(图3，见插4)小鼠肿瘤组织中微血管密度明显低于对照组(图4，见插4)。照片中深染处为血管内皮。
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图1 鲨鱼软骨粉54mg/d剂量治疗SRS菏瘤小鼠15d肿瘤大小比较
图2.鲨鱼软骨粉剂量与肿瘤重量效应关系(*P<0.05)
图3 54mg/d剂量治疗小鼠肿瘤组织中微血管免疫组化染色结果(10×20倍)
图4 对照组小鼠肿瘤组织中微血管免疫组化染色结果(10×20倍)
5 肿瘤微血管密度的变化：用vWF抗体免疫组化染色54mg/d剂量组15d治疗后，肿瘤切片中的血管，经肉眼计数(表1)和计算机图象扫描处理结果(表2)发现，治疗组较对照组微血管计数明显减少，P均<0.01。
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表1 治疗组(54毫克/天)与对照组肿瘤切片微血管计数
分组
实验例数
平均值±标准差
对照组
19
9.58±3.75
治疗组
17
5.17±1.98
表2 治疗组(54mg/d)与对照组肿瘤切片Ⅷ因子相关抗原染色灰度扫描
分组
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实验例数
平均值±标准差
对照组
19
0.27±0.08
治疗组
17
0.22±0.10
t=2.56,P<0.05
6 肿瘤重量与肿瘤微血管的关系：在54mg/d治疗组或对照组中，微血管的密度均与实验第15d时收获肿瘤重量呈直线相关，随着微血管密度的增加，肿瘤的重量也随之增加，治疗组r=0.82，对照组r=0.98，两组P均<0.05。
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7 肿瘤VEGF表达情况：用VEGF抗体免疫组化染色54mg/d剂量组15d治疗后肿瘤切片显示其中VEGF表达，结果(表3)发现，治疗组阴性例数较对照组明显增多，P均<0.05。
表3 治疗组(54mg/d)与对照组VEGF抗体染色结果
分组
实验例数
阳性例数
阴性例数
对照组
19
12
7
治疗组
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17
8
9
经χ2检验, P<0.05
8 肿瘤血管内皮细胞Flk-1抗体免疫组化染色：54mg/d剂量组15d治疗后肿瘤切片显示其中Flk-1表达经计算机图像扫描处理结果(表4)发现，治疗组较对照组灰度值明显减少，P<0.05。
表4 治疗组(54mg/d)与对照组Flk-1抗体染色灰度扫描结果
分组
实验例数
平均值±标准差
对照组
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19
0.19±0.02
治疗组
17
0.11±0.01
t=1.63, P<0.05
9 肿瘤毛细血管密度与肿瘤血管内皮细胞Flk-1表达情况相关性分析：无论在54mg/d治疗组或对照组中，Flk-1表达量均与实验第15d时收获肿瘤微血管的密度呈显著正相关，随着Flk-1表达量的增加，微血管密度也随之增加，治疗组r=0.82，对照组r=0.98，两组P均<0.05。
讨 论
肿瘤的生长、浸润和转移等生物学行为均需新生毛细血管网的支持。恶性肿瘤细胞依靠丰富的新生毛细血管网及时得到其迅速无限生长所需的养料和氧气，并将代谢产物运走，而缺少血供的肿瘤直径只能维持在1～2mm以内。肿瘤在生长过程中可分泌侵蚀血管并促进新生血管形成的物质。人们认识到如能抑制新生血管的形成，将对肿瘤的增长和转移起到抑制作用。并且有报道显示，肿瘤的恶性程度与其毛细血管的密度间有一定的相关关系[5]。因此，近年来，抗血管形成药物成为抗肿瘤物的研究方向。
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鲨鱼软骨是一种自然界中的天然药物。由于鲨鱼软骨占其体重的比例较高，其中无血管存在。鲨鱼软骨在拉美一些国家作为一种传统药物被用于治疗银屑病、乳腺癌等疾病，据报道有一定的疗效。人们在研究其药理作用的过程中，发现其有抑制新生血管形成的效应，引起了医学专家的浓厚兴趣，并开始在某些国家作为抗肿瘤的临床试用药物。
关于口服鲨鱼软骨粉治疗肿瘤的临床观察首先是在古巴、墨西哥、美国进行的，我国也有报道，但其结果非常矛盾[10～15]。近年来，P.E.Davis等[16]用鲨鱼软骨粉掺入饲料中由大鼠自由取食，结果显示口服鲨鱼软骨粉可减少炎症刺激剂诱发的大鼠肠系膜炎性血管形成。但这种方法无法保证每只大鼠摄入规定量的鲨鱼软骨粉，因此，无法确定治疗剂量。在本实验中，采用不同浓度的鲨鱼软骨粉混悬液灌饲移植肿瘤的小鼠，以确保每只小鼠每日摄入定量的鲨鱼软骨粉。实验结果显示，口服鲨鱼软骨粉对小鼠移植肿瘤的生长，在54mg/d治疗中，有明显的抑制作用，并具有统计学意义；而在低剂量组中则无抑制作用。在72mg/d治疗中，具有一定的抑制作用，但无统计意义。随剂量增大，在108mg/d治疗组中，口服鲨鱼软骨粉失去抑制作用，其原因不明。说明鲨鱼软骨粉的抗肿瘤作用在一定的剂量范围内有效。服药后肿瘤切片常规染色及vWF:Ag抗体免疫组化染色显示，54mg/d治疗15d组小鼠肿块平均每视野微血管数较对照明显减少(P<0.01)。经相关分析，肿瘤重量与肿瘤微血管密度间呈显著正相关。提示抑制微血管生长是鲨鱼软骨抗肿瘤作用的可能机制之一。VEGF免疫组化染色结果显示，治疗组较对照组阳性率低。而Flk-1抗体免疫组化染色结果经计算机扫描，治疗组较对照组灰度值低(P<0.05)。经相关分析，肿瘤微血管密度与Flk-1灰度间值呈显著正相关。提示鲨鱼软骨粉抑制肿瘤微血管内皮细胞表面的Flk-1受体的表达是其抑制血管形成作用的可能机制。对其具体作用途径，需进一步研究。
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参考文献
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2，沈先荣，贾福星，王玲,等.鲨鱼软骨制剂抗肿瘤作用的研究.中国生化药物杂志.1995,16(4):157
3，蔡平，于志洁.鲨鱼软骨血管生成抑制因子研究发展.海军军事医学.1996，17(2)：33
4，蔡平，于志洁.鲨鱼软骨血管生成抑制因子研究和开发现状.中国海洋药物.1996,15(3)：37
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5，Moses MA, Sudhalter J, Langer R, Identification of an Inhibitor of neovascularization from Cartilage. Science. 1990,248(4961):1408
6，Cataldi JM, Osborne DL. Effects of shark cartilage on mammary tumor neovascularization in vivo and cell proliferation in vitro(Meeting abstract). FASEB J.1995,9(3):A135
7，焦炳南，王路，缪辉南。鲨鱼软骨中新生血管抑制因子的分离纯化及活性的初步研究.第二军医大学学报.1996,17(2):176
8，程立，郑葆芬，孔宪寿，等.小鼠SRS白血病病毒感染的细胞株的建立及其生物学特性.上海医科大学学报.1986,13(2):91
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9，Folkman J. What is the evidence that tumors are angiohenesis dependent? J. Cancer Inst.1990,82(1):4
10，沈先荣，贾福星，王玲，等.鲨鱼软骨提取物的抗肿瘤效应及其作用机制.海军军事医学.1996,17(3):4
11，于志洁，吕家本，苏福强，等.沙克1号对Lewis肺癌移植瘤小鼠的抑瘤作用.海军军事医学.1996,17(4):12
12，Sheu JR, Fu CC， Tsai ML, et al. Effect of U-995, a potent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and anti-tumor activities. Anticancer Res.1998,18(6A):4435
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15，Ernst E.Shark cartilage for cancer?[letter] Lancet.1998,351(9098):298
16，Davis PF, He Y, Furneaux RH. Inhibition of angiogenesis by oral ingestion of powdered shark cartilage in a rat model. Microvasc. Rec.1197,54(2):
178
(收稿：1999-07-14), http://www.100md.com