人前列腺癌细胞对化疗药物敏感性的对比
作者：邹永平 鲁功成 肖亚军
单位：邹永平(上海市杨浦区中心医院泌尿外科 上海，200090)；鲁功成 肖亚军(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：前列腺肿瘤；癌；药物筛选试验；抗肿瘤
临床泌尿外科杂志000114 摘 要：目的：研究人雄激素非依赖性前列腺癌细胞对化疗药物的敏感性。方法：采用噻唑蓝(MTT)法测定人雄激素非依赖性高转移前列腺癌细胞(PC-3M)对6种化疗药物的敏感性。结果：PC-3M对6种化疗药物的敏感性依次为喜树碱>依托泊甙>卡铂、阿霉素、氮芥>5-氟尿嘧啶(P均<0.05)。结论：PC-3M对喜树碱、依托泊甙较敏感。可作为临床用药参考。
Comparative study on chemosensitivity in prostate cancer cell
, 百拇医药
ZOU Yong-ping
(Department of Urology,Shanghai Yangpu Centre Hospital,Shanghai,200090)
LU Gong-cheng XIAO Ya-jun
(Department of Urology,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract：Purpose：To study the chemosensitivity in human androgen independent prostate cancer cell. Methods：Using the MTT method to study the chemosensitivities to six chemical drugs in human androgen independent prostate cancer cell (PC-3M).Results：The chemosensitivities to six chemical drugs in PC-3M are camptothecin>etoposidum>carboplatin,doxorubincin,nitrogen mastrad>5-fluorouracil (P<0.05).Conclusions：PC-3M is more sensitive to camptothecin,etoposidum, this may give reference to clinical treatment.
, 百拇医药
Key words：Prostatic neoplasmas Cancinoma Drug screening assays,antitumor▲
至今化疗药物对前列腺癌疗效的比较研究尚少，为此我们采用噻唑蓝(MTT)法测定体外培养的人雄激素非依赖性高转移前列腺癌细胞(PC-3M)对临床应用较多的6种化疗药物的敏感性，旨在筛选出比较有效的抗癌药物供临床用药参考。
1 材料和方法
1.1 主要材料
1.1.1 药物和试剂：①化疗药物：喜树碱(camptothecin，CAP，美国Sigma公司产)；依托泊甙(etoposidum，VP16，北京制药工业研究所实验药厂产)；氮芥(nitrogen mastard，NM，上海旭东海普药业有限公司产)；卡铂(carboplatin，CAR，济南齐鲁制药厂产)；阿霉素(doxorubicin，DOX，浙江海门制药厂产)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU，上海旭东海普药业有限公司产)。②试剂：MTT，美国Sigma公司产；二甲亚砜(DMSO)，上海硫酸厂产。
, http://www.100md.com
1.1.2 细胞株：PC-3M自美国引进，北京医科大学泌尿外科研究所提供。细胞在二氧化碳恒温培养箱(37℃，5% CO2)用含15%小牛血清的RPMI 1640培养基培养(RPMI 1640、小牛血清均为GIBCO公司产)，每3 d换液1次，0.25%胰蛋白酶消化传代。实验前1 d取外观良好、贴壁生长、接近汇合的细胞更换培养液。
1.2 主要步骤
1.2.1 药物浓度调制：用RPMI 1640将6种化疗药物调成浓度为0、0.80、1.60、3.10、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00mg/L的药液，过滤除菌，置于4℃冰箱备用。
1.2.2 处理细胞：RPMI 1640调制细胞浓度为2×107/L接种于96孔平底培养板，每孔200 μl(4 000个细胞/孔)。培养24 h弃上清，每排1种药物，按上述药物浓度依次各孔加入200 μl，设3组复孔。
, 百拇医药
1.2.3 MTT法检测：细胞培养96 h，各孔加入浓度为5 g/L MTT(用PBS新鲜配制)25 μl/孔，温箱孵育4 h，1 500 r/min离心后轻轻吸去150 μl/孔上清，再加入150 μl/孔的DMSO，静置10 min，在酶联检测仪上测波长570 nm光的吸光度(A)值〔1〕。
1.2.4 数据处理：按公式抑制率%=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值×100%计算出各组抑制率，抑制率高即对该药敏感性高〔2〕。统计学处理：按两因素方差分析资料，计算机统计结果。
2 结果
6种化疗药物对PC-3M的抑制率见表1。
表1 不同浓度的6种化疗药物对PC-3M的抑制率% 药物
浓度/(mg.L-1)
, http://www.100md.com
0
0.80
1.60
3.10
6.25
12.50
25.00
50.00
100.00
200.00
400.00
±s
CAP
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0
50
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66.3±24.0
VP16
, 百拇医药 0
46
50
53
56
57
66
73
80
86
93
60.0±24.0
CAR
0
, 百拇医药
30
47
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59
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63
73
81
52.0±20.6
DOX
0
, http://www.100md.com 26
39
42
52
55
61
62
65
68
71
49.2±20.2
NM
0
13
, 百拇医药
40
43
47
50
53
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62
73
80
47.5±22.6
5-FU
0
13
, http://www.100md.com 17
23
38
48
51
52
58
65
72
39.7±22.5
用两因素方差分析法统计所测结果，CAR、DOX、NM抑制率之间无显著性差异(P>0.05)，作为一组。抑制率由高到低为CAP>VP16>CAR、DOX、NM>5-FU，6种化疗药物按抑制率高低分为4组，组间差异均有显著性意义(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
MTT法常用于检测药物对癌细胞的杀伤或抑制率，原理为活细胞中的线粒体脱氢酶可还原MTT为蓝色产物(formazan)，药物作用后在酶标仪上测570 nm光的吸光度，即可计算出细胞抑制率。MTT法、同位素掺入法、集落法、染料排斥试验等都可检测细胞抑制率，但MTT法具有客观、简便、快速及不使用同位素等优点〔1〕，因此，受到广泛应用。
前列腺癌去势治疗后大部分复发，临床及体外实验显示肿瘤复发是由于前列腺癌从雄激素依赖性向雄激素非依赖性转变，前者依赖雄激素生长，而后者不依赖雄激素生长，对于后者去势治疗效果不好〔3〕。近些年前列腺癌的化学治疗逐渐引起人们的重视。
本组PC-3M为雄激素非依赖性高转移细胞株。实验发现PC-3M对6种化疗药物敏感性由高到低依次为CAP、VP16、CAR、DOX、NM、5-FU。CAP可与拓朴异构酶Ⅰ形成复合物，通过抑制该酶的作用阻止DNA复制；VP16通过抑制拓朴异构酶Ⅱ阻止DNA复制；CAR进入细胞后与DNA链上的碱基作用，改变其正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍；DOX与DNA结合使其作为核酸模板的功能受到损害，同时与细胞膜结合损害存在膜上的酶；NM可使DNA、RNA或蛋白质的多核基因烷化而影响DNA复制；5-FU代谢后产生的活性物质可结合到DNA上，干扰其功能，并抑制胸苷酸合成酶而阻止DNA合成。临床应用与体外实验结果往往有一定差异，CAP、VP16临床应用效果如何有待于进一步观察。
, http://www.100md.com
国外学者报道CAP可明显诱导前列腺癌细胞PC-3(一种雄激素非依赖性前列腺癌细胞)凋亡。一种新的植物提取剂β-lapachone为拓朴异构酶Ⅰ的抑制剂，亦可明显诱导PC-3细胞凋亡〔4〕。还未见这两种药治疗前列腺癌的临床报道。VP16广泛用于白血病的治疗，在前列腺癌的治疗方面亦取得一定疗效〔5〕。CAR、DOX、NM、5-FU在前列腺癌治疗中应用较多，效果并不满意。环磷酰胺通过肝脏代谢后才对癌细胞产生杀伤作用，故本实验未选用。临床上联合应用化疗药物常可增加疗效，而在治疗前列腺癌方面报道不多，有待进一步研究。另外化疗药物与雌激素联合治疗前列腺癌效果并不肯定。■
参考文献:
[1]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55～61
, 百拇医药
[2]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都：四川科学出版社，1995.55～56
[3]Raghavan D.Non-hormone chemotherapy for prostate cancer:principles of treatment and application to the testing of new drugs.Semin Oncol,1988,15：371～376
[4]Planchon S M,Wuerzberger S,Frydman B,et al.β-Lapachone-mediated apoptosis in human promyelocytic leukemia (HL-60) and human prostate cancer cell:a p53-independent response.Cancer Res,1995,55:3706～3711
[5]Pienta K J,Lehr J E.Inhibition of prostate cancer growth by estramustine and etoposide:evidence for interaction at the nuclear matrix.J Urol,1992,149:1622～1628
收稿日期：1998-05-28
, http://www.100md.com
单位：邹永平(上海市杨浦区中心医院泌尿外科 上海，200090)；鲁功成 肖亚军(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)
关键词：前列腺肿瘤；癌；药物筛选试验；抗肿瘤
临床泌尿外科杂志000114 摘 要：目的：研究人雄激素非依赖性前列腺癌细胞对化疗药物的敏感性。方法：采用噻唑蓝(MTT)法测定人雄激素非依赖性高转移前列腺癌细胞(PC-3M)对6种化疗药物的敏感性。结果：PC-3M对6种化疗药物的敏感性依次为喜树碱>依托泊甙>卡铂、阿霉素、氮芥>5-氟尿嘧啶(P均<0.05)。结论：PC-3M对喜树碱、依托泊甙较敏感。可作为临床用药参考。
Comparative study on chemosensitivity in prostate cancer cell
, 百拇医药
ZOU Yong-ping
(Department of Urology,Shanghai Yangpu Centre Hospital,Shanghai,200090)
LU Gong-cheng XIAO Ya-jun
(Department of Urology,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract：Purpose：To study the chemosensitivity in human androgen independent prostate cancer cell. Methods：Using the MTT method to study the chemosensitivities to six chemical drugs in human androgen independent prostate cancer cell (PC-3M).Results：The chemosensitivities to six chemical drugs in PC-3M are camptothecin>etoposidum>carboplatin,doxorubincin,nitrogen mastrad>5-fluorouracil (P<0.05).Conclusions：PC-3M is more sensitive to camptothecin,etoposidum, this may give reference to clinical treatment.
, 百拇医药
Key words：Prostatic neoplasmas Cancinoma Drug screening assays,antitumor▲
至今化疗药物对前列腺癌疗效的比较研究尚少，为此我们采用噻唑蓝(MTT)法测定体外培养的人雄激素非依赖性高转移前列腺癌细胞(PC-3M)对临床应用较多的6种化疗药物的敏感性，旨在筛选出比较有效的抗癌药物供临床用药参考。
1 材料和方法
1.1 主要材料
1.1.1 药物和试剂：①化疗药物：喜树碱(camptothecin，CAP，美国Sigma公司产)；依托泊甙(etoposidum，VP16，北京制药工业研究所实验药厂产)；氮芥(nitrogen mastard，NM，上海旭东海普药业有限公司产)；卡铂(carboplatin，CAR，济南齐鲁制药厂产)；阿霉素(doxorubicin，DOX，浙江海门制药厂产)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU，上海旭东海普药业有限公司产)。②试剂：MTT，美国Sigma公司产；二甲亚砜(DMSO)，上海硫酸厂产。
, http://www.100md.com
1.1.2 细胞株：PC-3M自美国引进，北京医科大学泌尿外科研究所提供。细胞在二氧化碳恒温培养箱(37℃，5% CO2)用含15%小牛血清的RPMI 1640培养基培养(RPMI 1640、小牛血清均为GIBCO公司产)，每3 d换液1次，0.25%胰蛋白酶消化传代。实验前1 d取外观良好、贴壁生长、接近汇合的细胞更换培养液。
1.2 主要步骤
1.2.1 药物浓度调制：用RPMI 1640将6种化疗药物调成浓度为0、0.80、1.60、3.10、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00mg/L的药液，过滤除菌，置于4℃冰箱备用。
1.2.2 处理细胞：RPMI 1640调制细胞浓度为2×107/L接种于96孔平底培养板，每孔200 μl(4 000个细胞/孔)。培养24 h弃上清，每排1种药物，按上述药物浓度依次各孔加入200 μl，设3组复孔。
, 百拇医药
1.2.3 MTT法检测：细胞培养96 h，各孔加入浓度为5 g/L MTT(用PBS新鲜配制)25 μl/孔，温箱孵育4 h，1 500 r/min离心后轻轻吸去150 μl/孔上清，再加入150 μl/孔的DMSO，静置10 min，在酶联检测仪上测波长570 nm光的吸光度(A)值〔1〕。
1.2.4 数据处理：按公式抑制率%=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值×100%计算出各组抑制率，抑制率高即对该药敏感性高〔2〕。统计学处理：按两因素方差分析资料，计算机统计结果。
2 结果
6种化疗药物对PC-3M的抑制率见表1。
表1 不同浓度的6种化疗药物对PC-3M的抑制率% 药物
浓度/(mg.L-1)
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1.60
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6.25
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用两因素方差分析法统计所测结果，CAR、DOX、NM抑制率之间无显著性差异(P>0.05)，作为一组。抑制率由高到低为CAP>VP16>CAR、DOX、NM>5-FU，6种化疗药物按抑制率高低分为4组，组间差异均有显著性意义(P<0.05)。
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3 讨论
MTT法常用于检测药物对癌细胞的杀伤或抑制率，原理为活细胞中的线粒体脱氢酶可还原MTT为蓝色产物(formazan)，药物作用后在酶标仪上测570 nm光的吸光度，即可计算出细胞抑制率。MTT法、同位素掺入法、集落法、染料排斥试验等都可检测细胞抑制率，但MTT法具有客观、简便、快速及不使用同位素等优点〔1〕，因此，受到广泛应用。
前列腺癌去势治疗后大部分复发，临床及体外实验显示肿瘤复发是由于前列腺癌从雄激素依赖性向雄激素非依赖性转变，前者依赖雄激素生长，而后者不依赖雄激素生长，对于后者去势治疗效果不好〔3〕。近些年前列腺癌的化学治疗逐渐引起人们的重视。
本组PC-3M为雄激素非依赖性高转移细胞株。实验发现PC-3M对6种化疗药物敏感性由高到低依次为CAP、VP16、CAR、DOX、NM、5-FU。CAP可与拓朴异构酶Ⅰ形成复合物，通过抑制该酶的作用阻止DNA复制；VP16通过抑制拓朴异构酶Ⅱ阻止DNA复制；CAR进入细胞后与DNA链上的碱基作用，改变其正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍；DOX与DNA结合使其作为核酸模板的功能受到损害，同时与细胞膜结合损害存在膜上的酶；NM可使DNA、RNA或蛋白质的多核基因烷化而影响DNA复制；5-FU代谢后产生的活性物质可结合到DNA上，干扰其功能，并抑制胸苷酸合成酶而阻止DNA合成。临床应用与体外实验结果往往有一定差异，CAP、VP16临床应用效果如何有待于进一步观察。
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国外学者报道CAP可明显诱导前列腺癌细胞PC-3(一种雄激素非依赖性前列腺癌细胞)凋亡。一种新的植物提取剂β-lapachone为拓朴异构酶Ⅰ的抑制剂，亦可明显诱导PC-3细胞凋亡〔4〕。还未见这两种药治疗前列腺癌的临床报道。VP16广泛用于白血病的治疗，在前列腺癌的治疗方面亦取得一定疗效〔5〕。CAR、DOX、NM、5-FU在前列腺癌治疗中应用较多，效果并不满意。环磷酰胺通过肝脏代谢后才对癌细胞产生杀伤作用，故本实验未选用。临床上联合应用化疗药物常可增加疗效，而在治疗前列腺癌方面报道不多，有待进一步研究。另外化疗药物与雌激素联合治疗前列腺癌效果并不肯定。■
参考文献:
[1]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55～61
, 百拇医药
[2]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都：四川科学出版社，1995.55～56
[3]Raghavan D.Non-hormone chemotherapy for prostate cancer:principles of treatment and application to the testing of new drugs.Semin Oncol,1988,15：371～376
[4]Planchon S M,Wuerzberger S,Frydman B,et al.β-Lapachone-mediated apoptosis in human promyelocytic leukemia (HL-60) and human prostate cancer cell:a p53-independent response.Cancer Res,1995,55:3706～3711
[5]Pienta K J,Lehr J E.Inhibition of prostate cancer growth by estramustine and etoposide:evidence for interaction at the nuclear matrix.J Urol,1992,149:1622～1628
收稿日期：1998-05-28
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