雷帕霉素产生菌吸水链霉菌中免疫抑制结合蛋白的研究
作者：陈 纯
单位：现在福建医科大学药理学教研室
关键词：免疫抑制结合蛋白(FK506-binding proteins)；雷帕霉素；肽酰-脯氨酰顺-反异构酶；吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
福建医科大学学报000141
硕士研究生
专 业 药理学
导 师 程元荣,陈崇宏
目的 雷帕霉素(RPM)是吸水链霉菌产生的一种强效三烯含氮大环内酯类免疫抑制剂和基因治疗药，它的免疫抑制结合蛋白(FK506-binding proteins,FKBPs)是种肽酰-脯氨酰顺-反异构酶(peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase，PPIase)。雷帕霉素对FKBPs有很高的亲和力，结合后FKBPs的酶活性明显受抑制，而另一类免疫抑制剂环孢素(CsA)不与FKBPs结合，对FKBPs的酶活性无明显影响。目前研究表明雷帕霉素需与其中的FKBP12结合后才能发挥其免疫抑制效应。本研究从雷帕霉素产生菌吸水链霉菌中分离具有PPIase活性的结合蛋白FKBPs，并探讨分析雷帕霉素产量与FKBPs含量的可能关系。方法 采用硫酸铵分段沉淀(终饱和度分为50%,80%)、制备性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，利用紫外/可见光分光光度计及Reaction kinetics酶动力软件测蛋白质的PPIase酶活性，高效液相色谱仪测不同菌株的RPM产量，对比高产突变菌株和野生菌株中蛋白质电泳图谱及FKBPs含量的差异。结果 吸水链霉菌菌体蛋白质制备、分离，所得蛋白质样品，应用SDS-PAGE以标准分子量蛋白质确定样品蛋白质的分子量，以底物寡肽N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe 4-nitro-anilide测样品的酶活性，获得具有PPIase活性的25 kD蛋白质及15.5 kD蛋白质。根据RPM和CsA对FKBPs酶活性的影响不同，在活性样品中分别加入10 nmol RPM和1 μmol CsA，再测酶活性，酶反应曲线显示，nmol级的RPM对样品酶活性有明显抑制作用，CsA 在μmol级对其的抑制作用不明显，表明样品中存在具有PPIase活性的FKBP，相当于FKBP25及FKBP12；比较三株RPM高产突变株与野生菌株的蛋白质电泳图谱及PPIase酶活性，发现RPM低产的野生株中25 kD及52.8 kD蛋白质含量比三株RPM高产突变菌株高，提取的野生株菌体蛋白液的PPIase酶活性也比高产突变菌株的菌体蛋白液均高。对含有52.8 kD的蛋白质分离样品进行PPIase活性测定，发现该样品无酶活性。故认为RPM低产的野生株中FKBP25的含量比三株RPM高产突变菌株均高。结论 初步认为在吸水链霉菌中RPM的产量与 FKBP25量的多寡可能呈现一定的相关性。
, 百拇医药
几种胃肠肽对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤的保护作用及其机制
硕士研究生 章丽金
专 业 内科学
导 师 蔡立勉副教授，潘秀珍教授，魏一生研究员
目的 研究表皮生长因子(EGF)、神经降压素(NT)、降钙素基因相关肽(CGRP)对四氯化碳(CCl4)急性损伤的在体大鼠肝脏和离体培养肝细胞的保护作用，并探讨其机制。方法 第一步建立大鼠CCl4损伤模型，设立对照组、损伤组及各胃肠肽保护组，于注射CCl4前30 min、前10 min，后10 min注射各胃肠肽，24 h后测定血清酶学水平、肝匀浆SOD活性及MDA含量，观察肝脏形态学变化；第二步建立大鼠离体培养肝细胞损伤模型，设对照组、损伤组及不同浓度胃肠肽预处理组(胃肠肽提前1 h加入)，24 h后测上清液酶学水平、肝细胞内SOD活性和MDA含量，以台盼蓝染色试验计算肝细胞存活率，观察形态学变化；第三步以Fura-2/AM和DPH荧光探针测定肝细胞内游离钙和膜流动性，观察对肝细胞有直接保护作用的胃肠肽对这两个指标的影响。结果 (1)EGF、NT、CGRP明显降低CCl4损伤后大鼠血清酶学水平、肝匀浆MDA含量，使SOD活性回升(P<0.01)，改善肝脏病理学变化。(2)EGF、NT明显降低原代培养肝细胞CCl4损伤后上清液酶学水平、MDA含量，提高SOD活性和细胞存活率(P<0.01)，改善形态学变化。CGRP对上述指标和形态学改变无明显影响。(3)EGF、NT明显对抗肝细胞CCl4损伤后胞内[Ca2+]i的增高和膜流动性的降低(P<0.01)。结论 (1)EGF、NT、CGRP对大鼠急性CCl4肝损伤均有保护作用，它们是通过稳定生物膜和增强自由基清除能力、抗脂质过氧化起作用。(2)EGF、NT对离体培养肝细胞CCl4损伤有直接保护作用，而CGRP无此作用。CGRP对在体肝脏的保护作用是通过肝细胞以外的因素实现的。(3)EGF、NT有维持肝细胞膜流动性和胞浆钙稳态的作用，这是其肝细胞保护作用的重要机制。
, 百拇医药
关键词 四氯化碳; 肝保护; 表皮生长因子; 神经降压素; 降钙素基因相关肽
(现在福建省立医院)
幽门螺杆菌及其cagA因子与胃腺癌的关系及其致癌的可能机理
硕士研究生 陈奕贵
专 业 内科学
导 师 陈玉丽教授
目的 (1)探讨幽门螺杆菌(Hp)与胃腺癌的相关性,特别是cagA因子与胃腺癌相关性；(2)探讨Hp特别是cagA因子与胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白表达异常的关系，从而探讨cagA是否为一致癌因子及其致癌的可能机理；(3)通过对胃腺癌演化系列胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白的检测，探讨胃腺癌发生的可能机制。方法 (1)利用血抗Hp-IgG、RUT、PCR-Hp-DNA3种方法检测270例病人耳垂血或胃粘膜活检组织中的Hp及其cagA基因；(2)利用免疫组化S-P法检测胃癌演化系列胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白的表达；(3)利用SPSS统计软件包作统计学分析处理。结果 (1)福州地区Hp感染率68.25%，男性cagA+Hp感染率为63.41%，女性为41.94%；cagA+Hp致胃炎程度及活动性均较cagA-Hp及Hp者高(P<0.05)；男性感染cagA+Hp更易发展为CAG、IM(P<0.05)；感染Hp者胃腺癌的分化程度低，且向周围浸润及淋巴结转移的能力强(P<0.05),但与cagA因子无关(P>0.05)；非贲门腺癌患者血抗Hp-IgG抗体为76.32%，大于贲门癌(52.90%)(P<0.05)。(2)在CSG、CAG、IM阶段，Hp感染促进胃粘膜中Bax、Bcl-2的表达，cagA因子与Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1高表达均相关，且在CSG阶段已显现(P<0.05)；在胃癌阶段，Hp感染与胃腺癌粘膜中Bcl-2、P21-WAF1、P16-MTS1的低表达相关，但cagA因子与此无关(P>0.05)。(3)在CSG、CAG、IM系列粘膜中Bax、Bcl-2表达先高后低，与男性cagA+Hp感染率呈正相关，而P21-WAF1、P16-MTS1表达先低后高，与之呈负相关(P<0.05)。高分化胃癌中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1表达较低分化者高；P16-MTS1表达在非贲门癌中比贲门癌中高，P21-WAF1表达在有淋巴结转移的胃腺癌中更高(P<0.05)。结论 (1)Hp感染与胃腺癌相关；cagA因子可能为胃腺癌，特别是男性胃腺癌的致癌因子之一，主要作用于胃癌发生的早期阶段。(2)Hp的cagA因子可能通过影响CSG、CAG、IM患者胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21WAF1、P16-MTS1的表达，成为胃腺癌发生的“启动子”之一；Hp通过非cagA因子途径影响Bcl-2、P21WAF1、P16-MTS1的表达，进一步影响胃腺癌的发展。(3)Bax、Bcl-2的高表达及P21WAF1、P16-MTS1的表达受抑可能与胃腺癌发生相关；四种蛋白表达均与胃腺癌分化呈正相关；P21WAF1、P16-MTS1的表达异常与胃腺癌的发生部位及淋巴结转移相关。
, 百拇医药
关键词 幽门螺杆菌; 胃癌; 细胞毒素相关基因(cagA); 原癌基因蛋白/Bcl-2; Bax; P21-WAF1; P16-MTS1
(现在福建医科大学附属第一医院)
幽门螺杆菌相关性胃病的细胞增殖和凋亡
硕士研究生 卢世云
专 业 内科学(消化病学)
导 师 潘秀珍教授, 彭孝伟,施作霖副教授
目的 观察幽门螺杆菌(Hp)感染在正常粘膜演变为胃癌过程中对细胞增殖和凋亡的作用及CagA基因对细胞增殖和凋亡的影响，进而探讨Hp增加胃癌发生危险性的机制。方法 研究对象为Hp阳性与阴性的慢性浅表性胃炎(CSG，n=56)、慢性萎缩性胃炎(CAG，n=20)、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生(CAGIM，n=16)、不典型增生(DYS，n=18)、胃癌(GC，n=17)患者及正常对照组(NS，n=14)。应用ki-67免疫组化技术评价胃幽门窦上皮细胞增生，用切口末端标记法(TUNEL)检测胃上皮细胞凋亡，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测Hp的CagA基因，以对Hp进行基因分型。结果 Hp阳性患者(n=75)的增殖指数(LI)和凋亡指数(AI)显著高于Hp阴性者(n=52)或正常人(P<0.05和P<0.01)。CSGHp阳性的LI和AI明显高于Hp阴性者(P<0.01)，而其余四种胃病Hp阳性的LI或AI与Hp阴性者比较均无显著性差异。五种胃病无论Hp阳性与阴性的LI均较NS组高(P<0.01)，但五种胃病只有CSG(不论Hp阳性或阴性)的AI较NS组高(P<0.01)，其余四种胃病无论Hp阳性或阴性的AI与NS组比较均差异无显著性(P>0.05)。CagA+Hp感染者的LI明显高于CagAHp感染者(P<0.05)，而AI则明显低于CagAHp患者(P<0.05)。CSGHp阳性或阴性的AI/LI与NS组比无明显差异(P>0.05)，其余四种胃病无论Hp阳性或阴性的AI/LI均较NS组低(P<0.01)。Hp阳性或阴性CSG、NS组的AI与LI呈正相关，GC患者的AI与LI呈负相关，CAG、CAGIM、DYSHp阳性及阴性患者的AI与LI无明显相关性。LI和AI与胃粘膜炎症程度无明显关系. 结论 (1)Hp诱导胃粘膜上皮细胞过度增殖和凋亡主要发生在Hp感染的早期。(2)CagA+Hp与CagAHp促增殖和凋亡作用的能力明显不同。(3)Hp感染通过引起增殖和凋亡比例的失调，最终促进肿瘤发生。(4)初步推断CagA+Hp具有更强的增加胃癌发生的危险性。
关键词 幽门螺杆菌; 细胞增殖; 细胞凋亡; 胃癌发生; CagA基因
(现在福建省立医院), http://www.100md.com
单位：现在福建医科大学药理学教研室
关键词：免疫抑制结合蛋白(FK506-binding proteins)；雷帕霉素；肽酰-脯氨酰顺-反异构酶；吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
福建医科大学学报000141
硕士研究生
专 业 药理学
导 师 程元荣,陈崇宏
目的 雷帕霉素(RPM)是吸水链霉菌产生的一种强效三烯含氮大环内酯类免疫抑制剂和基因治疗药，它的免疫抑制结合蛋白(FK506-binding proteins,FKBPs)是种肽酰-脯氨酰顺-反异构酶(peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase，PPIase)。雷帕霉素对FKBPs有很高的亲和力，结合后FKBPs的酶活性明显受抑制，而另一类免疫抑制剂环孢素(CsA)不与FKBPs结合，对FKBPs的酶活性无明显影响。目前研究表明雷帕霉素需与其中的FKBP12结合后才能发挥其免疫抑制效应。本研究从雷帕霉素产生菌吸水链霉菌中分离具有PPIase活性的结合蛋白FKBPs，并探讨分析雷帕霉素产量与FKBPs含量的可能关系。方法 采用硫酸铵分段沉淀(终饱和度分为50%,80%)、制备性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，利用紫外/可见光分光光度计及Reaction kinetics酶动力软件测蛋白质的PPIase酶活性，高效液相色谱仪测不同菌株的RPM产量，对比高产突变菌株和野生菌株中蛋白质电泳图谱及FKBPs含量的差异。结果 吸水链霉菌菌体蛋白质制备、分离，所得蛋白质样品，应用SDS-PAGE以标准分子量蛋白质确定样品蛋白质的分子量，以底物寡肽N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe 4-nitro-anilide测样品的酶活性，获得具有PPIase活性的25 kD蛋白质及15.5 kD蛋白质。根据RPM和CsA对FKBPs酶活性的影响不同，在活性样品中分别加入10 nmol RPM和1 μmol CsA，再测酶活性，酶反应曲线显示，nmol级的RPM对样品酶活性有明显抑制作用，CsA 在μmol级对其的抑制作用不明显，表明样品中存在具有PPIase活性的FKBP，相当于FKBP25及FKBP12；比较三株RPM高产突变株与野生菌株的蛋白质电泳图谱及PPIase酶活性，发现RPM低产的野生株中25 kD及52.8 kD蛋白质含量比三株RPM高产突变菌株高，提取的野生株菌体蛋白液的PPIase酶活性也比高产突变菌株的菌体蛋白液均高。对含有52.8 kD的蛋白质分离样品进行PPIase活性测定，发现该样品无酶活性。故认为RPM低产的野生株中FKBP25的含量比三株RPM高产突变菌株均高。结论 初步认为在吸水链霉菌中RPM的产量与 FKBP25量的多寡可能呈现一定的相关性。
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几种胃肠肽对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤的保护作用及其机制
硕士研究生 章丽金
专 业 内科学
导 师 蔡立勉副教授，潘秀珍教授，魏一生研究员
目的 研究表皮生长因子(EGF)、神经降压素(NT)、降钙素基因相关肽(CGRP)对四氯化碳(CCl4)急性损伤的在体大鼠肝脏和离体培养肝细胞的保护作用，并探讨其机制。方法 第一步建立大鼠CCl4损伤模型，设立对照组、损伤组及各胃肠肽保护组，于注射CCl4前30 min、前10 min，后10 min注射各胃肠肽，24 h后测定血清酶学水平、肝匀浆SOD活性及MDA含量，观察肝脏形态学变化；第二步建立大鼠离体培养肝细胞损伤模型，设对照组、损伤组及不同浓度胃肠肽预处理组(胃肠肽提前1 h加入)，24 h后测上清液酶学水平、肝细胞内SOD活性和MDA含量，以台盼蓝染色试验计算肝细胞存活率，观察形态学变化；第三步以Fura-2/AM和DPH荧光探针测定肝细胞内游离钙和膜流动性，观察对肝细胞有直接保护作用的胃肠肽对这两个指标的影响。结果 (1)EGF、NT、CGRP明显降低CCl4损伤后大鼠血清酶学水平、肝匀浆MDA含量，使SOD活性回升(P<0.01)，改善肝脏病理学变化。(2)EGF、NT明显降低原代培养肝细胞CCl4损伤后上清液酶学水平、MDA含量，提高SOD活性和细胞存活率(P<0.01)，改善形态学变化。CGRP对上述指标和形态学改变无明显影响。(3)EGF、NT明显对抗肝细胞CCl4损伤后胞内[Ca2+]i的增高和膜流动性的降低(P<0.01)。结论 (1)EGF、NT、CGRP对大鼠急性CCl4肝损伤均有保护作用，它们是通过稳定生物膜和增强自由基清除能力、抗脂质过氧化起作用。(2)EGF、NT对离体培养肝细胞CCl4损伤有直接保护作用，而CGRP无此作用。CGRP对在体肝脏的保护作用是通过肝细胞以外的因素实现的。(3)EGF、NT有维持肝细胞膜流动性和胞浆钙稳态的作用，这是其肝细胞保护作用的重要机制。
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关键词 四氯化碳; 肝保护; 表皮生长因子; 神经降压素; 降钙素基因相关肽
(现在福建省立医院)
幽门螺杆菌及其cagA因子与胃腺癌的关系及其致癌的可能机理
硕士研究生 陈奕贵
专 业 内科学
导 师 陈玉丽教授
目的 (1)探讨幽门螺杆菌(Hp)与胃腺癌的相关性,特别是cagA因子与胃腺癌相关性；(2)探讨Hp特别是cagA因子与胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白表达异常的关系，从而探讨cagA是否为一致癌因子及其致癌的可能机理；(3)通过对胃腺癌演化系列胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白的检测，探讨胃腺癌发生的可能机制。方法 (1)利用血抗Hp-IgG、RUT、PCR-Hp-DNA3种方法检测270例病人耳垂血或胃粘膜活检组织中的Hp及其cagA基因；(2)利用免疫组化S-P法检测胃癌演化系列胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1蛋白的表达；(3)利用SPSS统计软件包作统计学分析处理。结果 (1)福州地区Hp感染率68.25%，男性cagA+Hp感染率为63.41%，女性为41.94%；cagA+Hp致胃炎程度及活动性均较cagA-Hp及Hp者高(P<0.05)；男性感染cagA+Hp更易发展为CAG、IM(P<0.05)；感染Hp者胃腺癌的分化程度低，且向周围浸润及淋巴结转移的能力强(P<0.05),但与cagA因子无关(P>0.05)；非贲门腺癌患者血抗Hp-IgG抗体为76.32%，大于贲门癌(52.90%)(P<0.05)。(2)在CSG、CAG、IM阶段，Hp感染促进胃粘膜中Bax、Bcl-2的表达，cagA因子与Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1高表达均相关，且在CSG阶段已显现(P<0.05)；在胃癌阶段，Hp感染与胃腺癌粘膜中Bcl-2、P21-WAF1、P16-MTS1的低表达相关，但cagA因子与此无关(P>0.05)。(3)在CSG、CAG、IM系列粘膜中Bax、Bcl-2表达先高后低，与男性cagA+Hp感染率呈正相关，而P21-WAF1、P16-MTS1表达先低后高，与之呈负相关(P<0.05)。高分化胃癌中Bcl-2、Bax、P21-WAF1、P16-MTS1表达较低分化者高；P16-MTS1表达在非贲门癌中比贲门癌中高，P21-WAF1表达在有淋巴结转移的胃腺癌中更高(P<0.05)。结论 (1)Hp感染与胃腺癌相关；cagA因子可能为胃腺癌，特别是男性胃腺癌的致癌因子之一，主要作用于胃癌发生的早期阶段。(2)Hp的cagA因子可能通过影响CSG、CAG、IM患者胃粘膜中Bcl-2、Bax、P21WAF1、P16-MTS1的表达，成为胃腺癌发生的“启动子”之一；Hp通过非cagA因子途径影响Bcl-2、P21WAF1、P16-MTS1的表达，进一步影响胃腺癌的发展。(3)Bax、Bcl-2的高表达及P21WAF1、P16-MTS1的表达受抑可能与胃腺癌发生相关；四种蛋白表达均与胃腺癌分化呈正相关；P21WAF1、P16-MTS1的表达异常与胃腺癌的发生部位及淋巴结转移相关。
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关键词 幽门螺杆菌; 胃癌; 细胞毒素相关基因(cagA); 原癌基因蛋白/Bcl-2; Bax; P21-WAF1; P16-MTS1
(现在福建医科大学附属第一医院)
幽门螺杆菌相关性胃病的细胞增殖和凋亡
硕士研究生 卢世云
专 业 内科学(消化病学)
导 师 潘秀珍教授, 彭孝伟,施作霖副教授
目的 观察幽门螺杆菌(Hp)感染在正常粘膜演变为胃癌过程中对细胞增殖和凋亡的作用及CagA基因对细胞增殖和凋亡的影响，进而探讨Hp增加胃癌发生危险性的机制。方法 研究对象为Hp阳性与阴性的慢性浅表性胃炎(CSG，n=56)、慢性萎缩性胃炎(CAG，n=20)、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生(CAGIM，n=16)、不典型增生(DYS，n=18)、胃癌(GC，n=17)患者及正常对照组(NS，n=14)。应用ki-67免疫组化技术评价胃幽门窦上皮细胞增生，用切口末端标记法(TUNEL)检测胃上皮细胞凋亡，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测Hp的CagA基因，以对Hp进行基因分型。结果 Hp阳性患者(n=75)的增殖指数(LI)和凋亡指数(AI)显著高于Hp阴性者(n=52)或正常人(P<0.05和P<0.01)。CSGHp阳性的LI和AI明显高于Hp阴性者(P<0.01)，而其余四种胃病Hp阳性的LI或AI与Hp阴性者比较均无显著性差异。五种胃病无论Hp阳性与阴性的LI均较NS组高(P<0.01)，但五种胃病只有CSG(不论Hp阳性或阴性)的AI较NS组高(P<0.01)，其余四种胃病无论Hp阳性或阴性的AI与NS组比较均差异无显著性(P>0.05)。CagA+Hp感染者的LI明显高于CagAHp感染者(P<0.05)，而AI则明显低于CagAHp患者(P<0.05)。CSGHp阳性或阴性的AI/LI与NS组比无明显差异(P>0.05)，其余四种胃病无论Hp阳性或阴性的AI/LI均较NS组低(P<0.01)。Hp阳性或阴性CSG、NS组的AI与LI呈正相关，GC患者的AI与LI呈负相关，CAG、CAGIM、DYSHp阳性及阴性患者的AI与LI无明显相关性。LI和AI与胃粘膜炎症程度无明显关系. 结论 (1)Hp诱导胃粘膜上皮细胞过度增殖和凋亡主要发生在Hp感染的早期。(2)CagA+Hp与CagAHp促增殖和凋亡作用的能力明显不同。(3)Hp感染通过引起增殖和凋亡比例的失调，最终促进肿瘤发生。(4)初步推断CagA+Hp具有更强的增加胃癌发生的危险性。
关键词 幽门螺杆菌; 细胞增殖; 细胞凋亡; 胃癌发生; CagA基因
(现在福建省立医院), http://www.100md.com