HSP70在大肠癌细胞的表达规律
作者：刘忠 孔令红 罗深秋
单位：刘忠(第一军医大学细胞生物与医学遗传学教研室，广东 广州 510515)；孔令红(南方医院妇产科，广东 广州 510515)；罗深秋(第一军医大学细胞生物与医学遗传学教研室，广东 广州 510515)
关键词：HSP70；大肠癌细胞；热应激
第一军医大学学报000107 摘要: 目的 探讨大肠癌细胞(LoVo株)热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)热应激时表达规律，为进一步研究HSP70在TNF-a 诱导大肠癌细胞凋亡中的作用提供了实验依据。方法 培养大肠癌细胞(LoVo)，热应激(42℃，30 min)后分别培养2、5、8、11 h，然后运用免疫组化、Western blot方法分析应激后不同时间细胞内HSP70的表达和分布。 结果 热应激2 h后HSP70合成量增加，与未应激组比有显著差异(P<0.05)，5～ 8 h后合成量最高(P<0.01)，11 h后明显减少，与2 h染色情况基本相同。并观察到热应激细胞中胞核比胞质染色深，HSP70有核迁移现象。少量热应激死亡细胞的特异性染色更深。结论 热应激前HSP70在大肠癌细胞中合成较少，热应激后合成量增加，在5～ 8 h达峰值后降低。
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中图分类号：R392.11 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0022-02
Expression of HSP70 in human colon carcinoma cells
LIU Zhong LUO Shen-qiu
(Department of Cell Biology and Medical Genetics, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
KONG Ling-hong
(Department of Gynecology and Obstatics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To study the synthesis of HSP70 in human colon carcinoma cells and prepare the ground for the investigation into the role of HSP70 in the apoptosis of colon carcinoma cells . Methods Human colon carcinoma cells were stressed at 42℃ for 30 min, and were then cultured for 2, 5, 8, 11 h respectively. The synthesis and distribuion of HSP70 were examined by means of immunohistochemistry and Western blot. Results The synthesis of HSP70 began to increase2 h after heat shock and reached the maximum after 5-8 h; it decreased markedly 11 h after the heat shock, and more HSP70 was observed in the karyon than in the cytoplasm. Conclusion The experiment indicated that human colon carcinoma cells (LoVo) synthesize low level of HSP70 in normal, but more HSP70 is synthesized and reaches the maximum at 5 8 h after the heat shock and gradually decreased afterwards.
, 百拇医药
Key words: HSP70; human colon carcinoma cell; heat shock
热休克反应是以基因表达及调控方面的变化为主的一种反应：细胞内某些正常蛋白质合成关闭，而诱导产生一组新的蛋白质 热休克蛋白。根据分子量不同，热休克蛋白一般可分为4个家族：HSP90、HSP70、HSP60及sHSP；HSP70在应激反应，特别是在热刺激时，诱导性最显著，合成量较多，是人们侧重研究的一类热休克蛋白。目前认为HSP70使细胞具有热耐受性和分子伴侣的作用。但也发现热应激诱发的热休克蛋白，尤其是HSP70的表达，对肿瘤治疗有对抗作用[1]。本实验通过建立一热应激条件，探讨HSP70在大肠癌细胞内的表达规律。
1 方法
1.1 试剂
RPMI1640粉(美国生物技术公司)，HSP70一抗(美国Sigma公司)，SP法免疫组化试剂盒(北京中山公司)，大肠癌细胞株(LoVo )(上海中科院)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1细胞培养和热应激处理 六孔培养板经紫外灯照射30 min，内置高压消毒的盖玻片，将大肠癌细胞以5´ 108/L转到盖玻片上，12 h后42℃热应激30 min然后在37℃、5%CO2中培养，分别在2、5、8和11 h时取出，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定10 min。
1.2.2 免疫组化SP法 生长于载玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定后行免疫组化染色，方法按试剂盒说明书步骤进行。
1.2.3 Western blot法检测HSP70的表达 热应激后提取细胞内总蛋白，做SDS-PAGE电泳。电泳结束将SDS-PAGE凝胶取下，行半干转移1 h，10%脱脂奶粉中封闭过夜。PBS漂洗2次，加一抗及显色反应程序如免疫组化法。出现棕色条带后立即用自来水冲洗终止反应，滤纸吸干保存。
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1.2.4 免疫组化图象分析 每个时间点的免疫组化切片选取5个视野，用图象分析仪测定各样本平均光密度，进行多样本均数的方差分析。
2 结果
2.1 免疫组化
大肠癌细胞经42℃热应激30 min后，分别取未应激的对照、应激后2、5、8、11 h的细胞，用免疫组织化学方法原位检测HSP70的表达。光镜下可见热应激前仅有少数细胞HSP70特异性着色，染色浅，呈淡棕色；热应激后2 h，表达HSP70的细胞数增多，细胞HSP70特异性染色加深，呈棕褐色，与未应激组比有显著差异(P<0.05)。热应激后5和8 h几乎所有的大肠癌细胞都表达HSP70，细胞特异性染色最显著(P<0.01)，呈深棕褐色；热应激后11 h细胞染色又变浅，与2 h染色情况基本相同，说明HSP70的表达减少。同时观察到热应激细胞中胞核比胞质染色深；HSP70有核迁移现象。少量热应激死亡细胞的特异性染色更深。
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2.2 图象分析
分别检测免疫组化各样本的光密度值，统计分析结果见表1。图象分析表明，应激细胞与未应激细胞HSP70表达量的免疫组化平均D(λ)值有显著差异，应激后5和8 h平均光密度值大于2和11 h平均D(λ)值。
表1 不同时间HSP70表达量的免疫组化平均光密度(Dλ)值
Tab.1 OD of HSP70 expressed at various times Time(h)
OD(M± SD)
P
Control
0.061476± 0.002407
, 百拇医药
After heat shock 2 h
0.070586± 0.003186
<0.05
5 h
0.087652± 0.003681
<0.01
8 h
0.086872± 0.004248
<0.01
11 h
0.072406± 0.003483
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<0.05
2.3 Western blotting
大肠癌细胞经42℃热应激30 h后，分别提取未应激的对照、应激后2、5、8、11 h的细胞总蛋白进行电泳。经HSP70γ抗特异性结合、SP法显色，观察到未经热应激的对照组没有反应条带出现；2和11 h可看到染色较浅且相近的棕褐色条带。5和8 h的棕褐色条带较宽，着色深。说明应激后5和8 h的HSP70表达量相近，并且处于高峰期。
3 讨论
不同细胞表达HSP70的规律是有差异的，并且同一细胞在不同生理状态时也有差异，对HSP70表达规律的研究有利于进一步了解其在细胞中的生物功能及作用机制。中国仓鼠HA-1细胞内HSP代谢规律是45℃热应激，5、10和20 min后HSP87及HSP110表达量较少。随热应激时间的延长HSP70表达量显著增多。热应激20 min时，2～ 8 h为HSP70的合成高峰，12 h后合成明显减少[1]；由于体外培养的细胞与在体细胞发生热休克的应激温度有一定差异，有研究者通过选择大量不同温度应激体内、体外细胞进行统计分析，发现在温度为(42±0.5)℃时，体内、外热应激反应相似[2]。本实验参考多篇文献，建立了大肠癌细胞(LoVo)表达HSP70的热应激实验模型：42℃，30 min。免疫组化及Western blotting的结果表明大肠癌细胞在热应激后2 h HSP70的表达量有增加，5～ 8 h为合成高峰期，11 h明显减少。这与Hela细胞内HSP70的代谢规律不完全相同[3]，显示了细胞种群间的差异性。
, 百拇医药
本实验采用细胞免疫组化法观察到应激前后HSP70在细胞中表达量及分布的变化。在未应激细胞中，HSP70表达很少；在应激细胞中，HSP70表达多，且大多都集中在细胞核中。此结果与其它文献报道基本相符。这种分布上的变化与不同状态下HSP70的功能有关。在生理状态HSP70的功能主要是“分子伴侣”作用，在胞质参与新生蛋白的装配、折叠及跨膜转运。在应激状态，HSP70的功能主要表现在热耐受上，高浓度地聚集在核质内，并以特殊的方式与解聚的染色质相互作用，以防止染色质及hnRNA复合物降解。胞质中HSP70的量比应激前还是增高的，协助清除变性蛋白，参与细胞骨架的修复，并阻止应激状态下产生的氧自由基对线粒体膜的损伤。在Western blotting中，我们克服了以往用35S-Met掺入蛋白质实验法中放射性标记的弊端，并能特异地对蛋白HSP70进行较敏感地鉴别、定量分析，为进一步研究其在TNF-a 诱导大肠癌细胞凋亡中的作用提供了实验基础。
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Li GC, Mivechi NF, Weitzel G. Heat shock proteins, thermotolerance, and their relevance clinical hyperthermia[J]. Int J Hyperthermia, 1995, 11(4):459～88.
[2]Rofstd EK, Brustad T. Arrhenius analysis of the heat response in vivo and in vitro of human melanoma xenografts[J]. Int J Hyperthermia, 1986, 2:359～68.
[3]徐明波，程素绮. 热休克蛋白代谢过程中HeLa细胞热耐受性的变化[J]. 中国应用生理学杂志，1991, 7(1):39～ 42.
1999-02-21, 百拇医药
单位：刘忠(第一军医大学细胞生物与医学遗传学教研室，广东 广州 510515)；孔令红(南方医院妇产科，广东 广州 510515)；罗深秋(第一军医大学细胞生物与医学遗传学教研室，广东 广州 510515)
关键词：HSP70；大肠癌细胞；热应激
第一军医大学学报000107 摘要: 目的 探讨大肠癌细胞(LoVo株)热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)热应激时表达规律，为进一步研究HSP70在TNF-a 诱导大肠癌细胞凋亡中的作用提供了实验依据。方法 培养大肠癌细胞(LoVo)，热应激(42℃，30 min)后分别培养2、5、8、11 h，然后运用免疫组化、Western blot方法分析应激后不同时间细胞内HSP70的表达和分布。 结果 热应激2 h后HSP70合成量增加，与未应激组比有显著差异(P<0.05)，5～ 8 h后合成量最高(P<0.01)，11 h后明显减少，与2 h染色情况基本相同。并观察到热应激细胞中胞核比胞质染色深，HSP70有核迁移现象。少量热应激死亡细胞的特异性染色更深。结论 热应激前HSP70在大肠癌细胞中合成较少，热应激后合成量增加，在5～ 8 h达峰值后降低。
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中图分类号：R392.11 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0022-02
Expression of HSP70 in human colon carcinoma cells
LIU Zhong LUO Shen-qiu
(Department of Cell Biology and Medical Genetics, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
KONG Ling-hong
(Department of Gynecology and Obstatics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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Abstract: Objective To study the synthesis of HSP70 in human colon carcinoma cells and prepare the ground for the investigation into the role of HSP70 in the apoptosis of colon carcinoma cells . Methods Human colon carcinoma cells were stressed at 42℃ for 30 min, and were then cultured for 2, 5, 8, 11 h respectively. The synthesis and distribuion of HSP70 were examined by means of immunohistochemistry and Western blot. Results The synthesis of HSP70 began to increase2 h after heat shock and reached the maximum after 5-8 h; it decreased markedly 11 h after the heat shock, and more HSP70 was observed in the karyon than in the cytoplasm. Conclusion The experiment indicated that human colon carcinoma cells (LoVo) synthesize low level of HSP70 in normal, but more HSP70 is synthesized and reaches the maximum at 5 8 h after the heat shock and gradually decreased afterwards.
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Key words: HSP70; human colon carcinoma cell; heat shock
热休克反应是以基因表达及调控方面的变化为主的一种反应：细胞内某些正常蛋白质合成关闭，而诱导产生一组新的蛋白质 热休克蛋白。根据分子量不同，热休克蛋白一般可分为4个家族：HSP90、HSP70、HSP60及sHSP；HSP70在应激反应，特别是在热刺激时，诱导性最显著，合成量较多，是人们侧重研究的一类热休克蛋白。目前认为HSP70使细胞具有热耐受性和分子伴侣的作用。但也发现热应激诱发的热休克蛋白，尤其是HSP70的表达，对肿瘤治疗有对抗作用[1]。本实验通过建立一热应激条件，探讨HSP70在大肠癌细胞内的表达规律。
1 方法
1.1 试剂
RPMI1640粉(美国生物技术公司)，HSP70一抗(美国Sigma公司)，SP法免疫组化试剂盒(北京中山公司)，大肠癌细胞株(LoVo )(上海中科院)。
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1.2 方法
1.2.1细胞培养和热应激处理 六孔培养板经紫外灯照射30 min，内置高压消毒的盖玻片，将大肠癌细胞以5´ 108/L转到盖玻片上，12 h后42℃热应激30 min然后在37℃、5%CO2中培养，分别在2、5、8和11 h时取出，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定10 min。
1.2.2 免疫组化SP法 生长于载玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定后行免疫组化染色，方法按试剂盒说明书步骤进行。
1.2.3 Western blot法检测HSP70的表达 热应激后提取细胞内总蛋白，做SDS-PAGE电泳。电泳结束将SDS-PAGE凝胶取下，行半干转移1 h，10%脱脂奶粉中封闭过夜。PBS漂洗2次，加一抗及显色反应程序如免疫组化法。出现棕色条带后立即用自来水冲洗终止反应，滤纸吸干保存。
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1.2.4 免疫组化图象分析 每个时间点的免疫组化切片选取5个视野，用图象分析仪测定各样本平均光密度，进行多样本均数的方差分析。
2 结果
2.1 免疫组化
大肠癌细胞经42℃热应激30 min后，分别取未应激的对照、应激后2、5、8、11 h的细胞，用免疫组织化学方法原位检测HSP70的表达。光镜下可见热应激前仅有少数细胞HSP70特异性着色，染色浅，呈淡棕色；热应激后2 h，表达HSP70的细胞数增多，细胞HSP70特异性染色加深，呈棕褐色，与未应激组比有显著差异(P<0.05)。热应激后5和8 h几乎所有的大肠癌细胞都表达HSP70，细胞特异性染色最显著(P<0.01)，呈深棕褐色；热应激后11 h细胞染色又变浅，与2 h染色情况基本相同，说明HSP70的表达减少。同时观察到热应激细胞中胞核比胞质染色深；HSP70有核迁移现象。少量热应激死亡细胞的特异性染色更深。
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2.2 图象分析
分别检测免疫组化各样本的光密度值，统计分析结果见表1。图象分析表明，应激细胞与未应激细胞HSP70表达量的免疫组化平均D(λ)值有显著差异，应激后5和8 h平均光密度值大于2和11 h平均D(λ)值。
表1 不同时间HSP70表达量的免疫组化平均光密度(Dλ)值
Tab.1 OD of HSP70 expressed at various times Time(h)
OD(M± SD)
P
Control
0.061476± 0.002407
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After heat shock 2 h
0.070586± 0.003186
<0.05
5 h
0.087652± 0.003681
<0.01
8 h
0.086872± 0.004248
<0.01
11 h
0.072406± 0.003483
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2.3 Western blotting
大肠癌细胞经42℃热应激30 h后，分别提取未应激的对照、应激后2、5、8、11 h的细胞总蛋白进行电泳。经HSP70γ抗特异性结合、SP法显色，观察到未经热应激的对照组没有反应条带出现；2和11 h可看到染色较浅且相近的棕褐色条带。5和8 h的棕褐色条带较宽，着色深。说明应激后5和8 h的HSP70表达量相近，并且处于高峰期。
3 讨论
不同细胞表达HSP70的规律是有差异的，并且同一细胞在不同生理状态时也有差异，对HSP70表达规律的研究有利于进一步了解其在细胞中的生物功能及作用机制。中国仓鼠HA-1细胞内HSP代谢规律是45℃热应激，5、10和20 min后HSP87及HSP110表达量较少。随热应激时间的延长HSP70表达量显著增多。热应激20 min时，2～ 8 h为HSP70的合成高峰，12 h后合成明显减少[1]；由于体外培养的细胞与在体细胞发生热休克的应激温度有一定差异，有研究者通过选择大量不同温度应激体内、体外细胞进行统计分析，发现在温度为(42±0.5)℃时，体内、外热应激反应相似[2]。本实验参考多篇文献，建立了大肠癌细胞(LoVo)表达HSP70的热应激实验模型：42℃，30 min。免疫组化及Western blotting的结果表明大肠癌细胞在热应激后2 h HSP70的表达量有增加，5～ 8 h为合成高峰期，11 h明显减少。这与Hela细胞内HSP70的代谢规律不完全相同[3]，显示了细胞种群间的差异性。
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本实验采用细胞免疫组化法观察到应激前后HSP70在细胞中表达量及分布的变化。在未应激细胞中，HSP70表达很少；在应激细胞中，HSP70表达多，且大多都集中在细胞核中。此结果与其它文献报道基本相符。这种分布上的变化与不同状态下HSP70的功能有关。在生理状态HSP70的功能主要是“分子伴侣”作用，在胞质参与新生蛋白的装配、折叠及跨膜转运。在应激状态，HSP70的功能主要表现在热耐受上，高浓度地聚集在核质内，并以特殊的方式与解聚的染色质相互作用，以防止染色质及hnRNA复合物降解。胞质中HSP70的量比应激前还是增高的，协助清除变性蛋白，参与细胞骨架的修复，并阻止应激状态下产生的氧自由基对线粒体膜的损伤。在Western blotting中，我们克服了以往用35S-Met掺入蛋白质实验法中放射性标记的弊端，并能特异地对蛋白HSP70进行较敏感地鉴别、定量分析，为进一步研究其在TNF-a 诱导大肠癌细胞凋亡中的作用提供了实验基础。
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Li GC, Mivechi NF, Weitzel G. Heat shock proteins, thermotolerance, and their relevance clinical hyperthermia[J]. Int J Hyperthermia, 1995, 11(4):459～88.
[2]Rofstd EK, Brustad T. Arrhenius analysis of the heat response in vivo and in vitro of human melanoma xenografts[J]. Int J Hyperthermia, 1986, 2:359～68.
[3]徐明波，程素绮. 热休克蛋白代谢过程中HeLa细胞热耐受性的变化[J]. 中国应用生理学杂志，1991, 7(1):39～ 42.
1999-02-21, 百拇医药