线粒体DNA氧化损伤机制的探讨
作者：王琳琳 凌文华
单位：王琳琳(中山医科大学公共卫生学院医学营养系， 广东 广州 510089)；凌文华(中山医科大学公共卫生学院医学营养系， 广东 广州 510089)
关键词：mtDNA；氧化损伤；自由基；抗氧化作用；修复
疾病控制杂志000131
【摘 要】 线粒体中呼吸链产生的自由基是体内自由基主要来源。在一定的生理(如年老)或/和病理条件下，自由基可以突破人体防御机制，损伤机体。由于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)结构功能特殊性，导致其成为自由基攻击的最主要最脆弱的靶目标，从而引起线粒体功能障碍，最终造成细胞的衰老与死亡。在此将探讨mtDNA氧化损伤的形成、防御及修复机制。
【分类号】 Q244； Q751 【文献标识码】 A
, 百拇医药
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0079-04
Study on the mechanisms of oxidative damage to mitochondrial DNA
WANG Lin-lin LING Wen-hua
(Department of Medical Nutrition， Public Health College, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
【Abstract】 Mitochondrial respiratory chain is a major site for the generation of endogenous free radicals. The free radicals may break through the antioxidative defense systems and harm body under a certain physiological and/or pathological conditions. Due to its specific structure and function, mtDNA is the most fragile target attacked by free radicals, which results in mitochondria dysfunction and ultimately cell in death. This article concentrates on the mechanisms of the formation, prevention and repair of oxidative damage to mtDNA.
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【Key words】 mtDNA; oxidative damage; free radical; antioxidation; repair
自由基可以广泛攻击体内生物大分子，受损的蛋白质、脂类可经降解，再重新合成；但核酸分子损伤后一般不被降解而直接修复，未被修复的损伤DNA片段可积累下来，造成进一步更大的损害[1]。由于mtDNA缺乏组蛋白，与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，复制快速且无校读功能(proofreading)以及缺乏有效的DNA修复机制，所以mtDNA较易受自由基攻击，氧化损伤而引起突变，其突变率是核DNA的10倍[2]。由于线粒体是机体的“动力工厂”，mtDNA损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞能量不足而造成细胞的衰老与死亡。大量研究发现mtDNA氧化损伤与线粒体肌病、神经变性疾病和衰老密切相关。本文就这一氧化损伤发生、发展及防御机制的研究情况综述如下。
1 mtDNA的结构功能特征
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mtDNA呈闭环双链状，独立存在于核外。每个细胞含数百个线粒体，每个线粒体含2～10个基因组DNA。人类mtDNA含16 569 bp，其全部序列已被测定。它包含22个tRNA基因，2个rRNA基因，13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质基因[3]。
与核DNA相比，mtDNA在结构和功能上有着自己独特的特征：①mtDNA是裸露的，缺乏组蛋白和DNA结合蛋白的保护；②mtDNA与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，又直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，因此极易受自由基的攻击；③mtDNA复制快速且催化复制的DNA聚合酶γ不具有校读功能，复制错误率高；④mtDNA与核DNA相比缺乏有效的修复机制；⑤每个细胞中含有数百个线粒体，每个线粒体含多个DNA分子，所以细胞中可同时存在正常mtDNA和突变mtDNA，即异质性；⑥mtDNA无内含子，所以mtDNA的突变很容易影响到其基因组内的一些重要功能区域；⑦突变mtDNA是否在组织产生表型效应，这要依突变mtDNA与正常mtDNA相对比例和该组织对线粒体产生的ATP依赖程度而定；⑧线粒体是半自主性细胞器，mtDNA基因的复制、转录和翻译受核DNA的制约；⑨线粒体位于胞质中，故mtDNA的遗传方式是细胞质遗传(母系遗传)，相应地有些线粒体病亦为母系遗传，如线粒体脑肌病、糖尿病等。因此，在研究mtDNA损伤过程中必须要考虑到这些特征[3，4]。
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2 mtDNA氧化损伤的形成
2.1 自由基的产生与Fenton反应 自由基主要来源于线粒体氧化磷酸化过程，它是指任何含有一个或多个不成对电子并能独立存在的基因，如H.、
、OH.、RO.、RO2.、NO.等。约1%～2%线粒体呼吸链消耗的氧被转化为，CoQ与NADH脱氢酶是这一转化过程发生的主要位点[5]；来源于线粒体外膜的单胺氧化酶-A/B对生物胺的氧化可以产生H2O2，这比复合物Ⅱ介导的琥珀酸氧化生成H2O2量要高48倍[6]。
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Fenton反应是针对于过渡性金属而言，过渡性金属除了一种基本状态外，还可形成不止一种的氧化态，这样就允许一个电子的氧化还原反应[7]。Fenton与后来的Haber和Weiss研究建立了Fenton反应基本方程式[8]：MeN++H2O2→Me(N+1)++HO.+H2O
细胞内Fe较Cu、Co的相对优势以及其与螯合配体高亲和力表明：Fe在体内Fenton反应中起重要作用[8]。经Fenton反应生成的Fenton氧化剂是以.OH为典型代表，羟基化和夺取氢是其两种最常见的反应形式[9]。
金属螯合剂由于占用了金属螯合位点而可阻止Fenton反应。在哺乳动物细胞中，去Fe制剂(desferal)和啡啉(o-phenanthroline金属螯合剂)可防止H2O2引起的姐妹染色体交换、DNA单链断裂及细胞损伤[8]。
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2.2 Fenton氧化剂导致mtDNA损伤机理 在H2O2依赖性的DNA损伤中，自由基攻击对象及性质取决于Fe附着于DNA的位点而非羟自由基。Fe介导的Fenton氧化剂按DNA损伤机制至少可分为两种截然不同的类型[10]，类型Ⅰ氧化剂对H2O2、乙醇中度敏感，并选择性裂解DNA的碱基T；类型Ⅱ氧化剂对H2O2、乙醇高度敏感，并选择性裂解DNA的碱基G。这些自由基迥然不同的损伤特征主要是由于介导产生它们的Fe所附着位置不同。
自由基攻击碱基主要导致*OH加合于富含电子的DNA双链，尤其在嘌呤N-7-C-8位点和嘧啶5、6-位点上[9]，一般地，Fenton氧化剂可攻击DNA碱基，也可攻击糖基。攻击糖基时，首先脱氧核糖链上一核糖被夺取氢，然后导致链断裂，碱基逸失。自由基攻击碱基部分并不能引起糖基改变或链断裂，除非修饰的碱基改变了N-糖苷键以允许无碱基位点形成[11]。在被修饰的碱基中，7、8-二氢-8-氧鸟嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-oxo-Gua)和乙二醇胸腺嘧啶(thymine glycol，及其羟化物)受到广泛的关注。可能由于同时存在独特切除酶的缘故，另外还可能由于8-oxo-Gua有高突变性和易于分离与定量[7]。在mtDNA复制过程中8-氧脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(8-oxodeoxyguanosine triphosphate, 8-oxo-dGTP)有高突变率，与其在核中表现的一样，应与8-oxo-dGTP配对的A很容易被C置换，这种错配mtDNA的稳定存在为一些变性疾病奠定基因水平的基础[12]。
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对于mtDNA而言，这些碱基、糖基的改变最终可导致点突变、缺失和插入突变，其中以片段缺失多见。至今已发现老年人不同组织的mtDNA缺失类型有十几种，其中某些缺失只见于某类组织，而另一些缺失却可能在不同组织或器官中出现，4 977 bp缺失是这些缺失中最普遍和研究最多的类型[13]。对应大鼠mtDNA的常缺失是4 834 bp缺失。
2.3 不依赖于Fenton反应的自由基致mtDNA氧化损伤 氮氧自由基的产生不需Fenton反应，与NO.快速反应生成ONOO-，另外ONOO-也可能与H2O2形成1O2，这种氮氧自由基可以使DNA脱氨基并诱导其突变，还可以增强线粒体氧化应激，及细胞对过氧化物介导损伤的敏感性[7]。存在着与Fenton反应无关的毒作用，如巴豆毒醇诱导白血球产生，并同时引起DNA单链断裂，这种损伤对H2O2水解酶不敏感，且被啡啉诱发而不是抑制[14]。
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单线态氧的产生同样不通过Fenton/H-W。例如，Cl-与H2O2反应生成OCl-，后者再与H2O2生成单线态氧，前一反应在体外被氯过氧化酶催化，在含有丰富H2O2和氯过氧化酶的嗜中性细胞中可见单线态氧的产生[7]。单线态氧容易氧化DNA的鸟嘌呤。上述这些自由基对mtDNA的氧化损伤机理需要进一步研究。
2.4 脂类过氧化导致mtDNA损伤机理 已有证据支持膜脂过氧化作用与自由基诱导的mtDNA损伤密切相关。Nakayama等在1984年发现α-生育酚可通过将氢给予脂质自由基而抑制DNA自由基的形成。两年后，他又发现α-生育酚可以阻止甲基亚麻酸过氧化氢(methyl linoleate hydroperoxide)诱导的DNA损伤。Andrew M.H.于1988年观察到作为使脂自由基失活的抗氧化剂α-生育酚可同时阻止脂质过氧化和DNA损伤；而作为自由基、H2O2、.OH清除剂的SOD、CAT和甘露醇却无此保护作用；如果说是因为这些清除剂不能进入线粒体发挥作用的话，那么对于另一具有高度膜通透性的自由基清除剂二甲基亚砜，仍不能发现其有阻止脂质过氧化和DNA损伤作用[15]。
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尽管脂质过氧化作用诱导mtDNA损伤的确切机制并未得以阐明，但可以推测脂质过氧化过程中产生的LO.、LOO.等自由基可以发挥*OH相似DNA攻击作用，进一步研究仍需继续[15]。
2.5 Cu诱导的mtDNA损伤 由于Cu可在氧化态和还原态之间反复改变，所以它是一种强的致氧化剂(prooxidant)，可产生.OH等自由基，同时Cu能够形成Cu-DNA复合物，在DNA附近生产的自由基很容易攻击这个靶目标，因此Cu能引起核DNA单、双链断裂，碱基交联、氧化、置换等。可推测在Cu过载状态下，线粒体内选择性积累的Cu会以易受氧化损伤的mtDNA为靶目标。而分布于胞浆与溶酶体的Fe即便在过载状态下，亦不会积聚到线粒体，故不能诱导上述作用。若Cu清除途径发生障碍，如编码Cu-转运ATP酶的核基因发生突变，就会产生Wilson's疾病，其特征性体征就是与mtDNA损伤有关的微血管脂肪变性[16]。
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3 机体抗氧化防御系统
3.1 抗氧化酶类 常见的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)等。哺乳动物细胞在胞浆产生Cu、Zn-SOD,在线粒体内产生Mn-SOD。SOD可将转化为H2O2。当Cu、Zn-SOD、CAT、GSH-PX活性随年龄增大而降低时，Mn-SOD活性却不断增高直至60岁，而后才开始下降，而且Mn-SOD/CAT、Mn-SOD/GSH-PX活性比随年龄增大而增加，这表明自由基清除酶在60岁以前可以有效清除自由基，但60岁后，自由基的产生与清除就会失衡，而产生氧化应激，可见，自由基清除酶的功能下降与氧化应激的不断增强，对于人类衰老进程中发生中的mtDNA氧化损伤起着重要的作用[17]。
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然而有研究发现在低浓度或高浓度SOD状态下，脂质过氧化均明显，而在中度浓度SOD状态下，脂质过氧化降低到最小程度，这可能由于在脂质链式氧化过程中，可同时起启动与终止的作用。所以固然SOD抗氧化作用良好，但体内SOD浓度并非愈高愈好[18]。
CAT与GSH-PX同时起着水解H2O2作用。在哺乳动物细胞中，CAT大多存在于过氧化物酶体中，且分泌较少，而GSP-PX则可广泛存在于线粒体、胞浆、过氧化物酶体，且作用强于CAT，特异性低于CAT，故可降解有机过氧化物，氧化的谷胱甘肽可由NADPH依赖的GSH还原酶还原[7]。
SOD、CAT、GSH-PX三者相对水平的高低对于它们抗氧化作用的有效发挥很重要。例如，增加的SOD消耗了，但增多了H2O2，过多的H2O2若不能被CAT、GSH-PX及时清除，就会有害于机体，然而过多的GSH-PX并不必要，它过分消耗了GSH和NADPH，尽管存在着足量的CAT[7]。
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白细胞内还含有硫醇特异性抗氧化酶，在低浓度H2O2(～50 μm)状态下发挥硫醇依赖的过氧化物酶的作用：高浓度H2O2(～10 mm)时，这种酶可以阻止由于硫醇/金属催化氧化造成的DNA损伤，然而这种保护作用在过氧化物酶体中并未发现[7]。
对DNA而言，唯一有效防御自由基的措施是非酶性的，组蛋白和紧密完整的染色体结构可以有效地保护DNA，然而mtDNA却缺乏组蛋白的保护及其它DNA结合蛋白，这是mtDNA对氧化损伤敏感性较核DNA高的重要原因之一。
3.2 抗氧化剂 大量研究已证实，VitE、VitC在体内具有强的抗氧化特性。近年研究也发现，VitE、VitC可以延缓mtDNA遭受与衰老相关的损伤。在研究AZT(一种治疗AIDS的药物)对骨骼肌mtDNA氧化损伤作用时发现，饮食中补允VitE、VitC的病人，服用AZT的副作用明显减弱[19]。β-胡萝卜素也具有清除自由基的作用。氧自由基连锁反应过程及其与抗氧化系统的关系可概括如下[22]，见图1。
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图1 氧自由基连锁反应过程及其与抗氧化系统的关系
Figure 1 Chain reaction of oxygen free radical and its
relationship with antioxidation
RO. organic free radical ROO. organic peroxide free radical
4 mtDNA氧化损伤的修复
正常状态下，机体抗氧化系统完全可以抵御自由基的攻击，一旦由于各种原因，抗氧化防御系统作用减弱或自由基产生过多而突破机体防御系统，那么mtDNA就会很容易发生损伤，这时，mtDNA的损伤修复系统就要启动。以前多数研究者认为，mtDNA缺乏有效的修复机制，然而近年来，不断的研究发现线粒体还是具有一定的DNA氧化损伤修复能力的。
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4.1 碱基切除修复 碱基切除修复被证实是通过一种DNA糖基酶，这种酶可以识别损伤的碱基，裂解其糖苷键。在细菌与哺乳动物细胞中有三种蛋白质参与G损伤修复：8-oxo-Gua DNA糖基酶/AP水解酶(Fpg Pro.或MutM)；A DNA糖基酶(MutY)，这种酶可以识别并切除与8-oxo-Gua错配的碱基A；8-oxo-dGTP酶(MutT)，此酶可以水解8-oxo-dGTP，生成8-oxo-dGMP。这样，损伤的G就不会再插入新合成的DNA中。目前，Fpg Pro.与MutT类似物已经从线粒体中分离出来，线粒体中是否存在MutY类似物仍需进一步探讨[20]。
对于单线态氧诱导的DNA碱基损伤，在线粒体中也存在着快速而有效的修复，另外线粒体内还存在AP内切酶、尿嘧啶DNA糖基酶等。
4.2 核苷切除修复 这一过程需要多种酶复合体同时参与，最终导致一段寡核苷酸链的切除。这一复杂的修复过程目前还未在线粒体中发现。已证实对于UV诱导的二聚体，线粒体缺乏修复能力。然而线粒体却可以修复4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)诱导的DNA损伤，而在核内4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)的损伤是通过核苷切除修复途径修复的，是否有核苷切除修复蛋白质与线粒体修复过程还未知[21]。
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4.3 重组修复 田鼠的mtDNA可以通过重组修复去除Cisplatin(含重金属化合物)引起的链内交联；Thyagrajan B等在体外用人体线粒体蛋白质抽提物可以在质粒间建立重组，此实验有力地支持了这一假设：哺乳动物线粒体可以利用同质性碱基重组修复损伤的DNA。
综上述所，mtDNA拥有一定的自我修复能力，然而大量研究显示mtDNA遭受比核DNA高数十倍的突变率，是否线粒体中氧化应激水平太高了，以致于即便具有效的修复系统，也不能维持一种低损伤水平?或者根本上，mtDNA的氧化损伤并不高于核DNA，而以前报告的8-oxo-dG水平偏高，可能由于分离过程中人工氧化所致?
5 结束语
mtDNA的氧化损伤可导致线粒体氧化磷酸化功能障碍，从而引起细胞能量代谢削弱，造成细胞坏死和凋亡，对能量需求较高的中枢神经系统及肌肉组织会因此受到累及，而出现功能障碍甚至疾病。随着研究的不断深入，发现越来越多的疾病与mtDNA损伤突变有关，如Kearns-Sayre综合征、Leber's遗传性神经病、Parkinson's病、慢性遗传性舞蹈病等。mtDNA损伤与衰老关系也已成为目前生命科学研究的热点。所以，阐明mtDNA氧化损伤的机制在理论上和临床实践上都具有重要意义。
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然而在这一领域内还需要进一步开展大量的研究工作，mtDNA氧化在整个细胞氧化应激中重要性，mtDNA损伤突变与线粒体功能缺陷、细胞凋亡关系如何，mtDNA损伤突变与衰老孰因孰果等等问题都有待于解决。
【作者简介】 王琳琳(1976-)，女，安徽泗县人，在读硕士研究生
凌文华(1956-)，男，安徽巢湖人，教授，博士，博士生导师，院长，主要研究方向：营养与疾病，1989～1997年在芬兰、加拿大、美国留学与工作。
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(收稿日期 1999-12-22), 百拇医药
单位：王琳琳(中山医科大学公共卫生学院医学营养系， 广东 广州 510089)；凌文华(中山医科大学公共卫生学院医学营养系， 广东 广州 510089)
关键词：mtDNA；氧化损伤；自由基；抗氧化作用；修复
疾病控制杂志000131
【摘 要】 线粒体中呼吸链产生的自由基是体内自由基主要来源。在一定的生理(如年老)或/和病理条件下，自由基可以突破人体防御机制，损伤机体。由于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)结构功能特殊性，导致其成为自由基攻击的最主要最脆弱的靶目标，从而引起线粒体功能障碍，最终造成细胞的衰老与死亡。在此将探讨mtDNA氧化损伤的形成、防御及修复机制。
【分类号】 Q244； Q751 【文献标识码】 A
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【文章编号】 1008-6013(2000)01-0079-04
Study on the mechanisms of oxidative damage to mitochondrial DNA
WANG Lin-lin LING Wen-hua
(Department of Medical Nutrition， Public Health College, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
【Abstract】 Mitochondrial respiratory chain is a major site for the generation of endogenous free radicals. The free radicals may break through the antioxidative defense systems and harm body under a certain physiological and/or pathological conditions. Due to its specific structure and function, mtDNA is the most fragile target attacked by free radicals, which results in mitochondria dysfunction and ultimately cell in death. This article concentrates on the mechanisms of the formation, prevention and repair of oxidative damage to mtDNA.
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【Key words】 mtDNA; oxidative damage; free radical; antioxidation; repair
自由基可以广泛攻击体内生物大分子，受损的蛋白质、脂类可经降解，再重新合成；但核酸分子损伤后一般不被降解而直接修复，未被修复的损伤DNA片段可积累下来，造成进一步更大的损害[1]。由于mtDNA缺乏组蛋白，与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，复制快速且无校读功能(proofreading)以及缺乏有效的DNA修复机制，所以mtDNA较易受自由基攻击，氧化损伤而引起突变，其突变率是核DNA的10倍[2]。由于线粒体是机体的“动力工厂”，mtDNA损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞能量不足而造成细胞的衰老与死亡。大量研究发现mtDNA氧化损伤与线粒体肌病、神经变性疾病和衰老密切相关。本文就这一氧化损伤发生、发展及防御机制的研究情况综述如下。
1 mtDNA的结构功能特征
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mtDNA呈闭环双链状，独立存在于核外。每个细胞含数百个线粒体，每个线粒体含2～10个基因组DNA。人类mtDNA含16 569 bp，其全部序列已被测定。它包含22个tRNA基因，2个rRNA基因，13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质基因[3]。
与核DNA相比，mtDNA在结构和功能上有着自己独特的特征：①mtDNA是裸露的，缺乏组蛋白和DNA结合蛋白的保护；②mtDNA与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，又直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，因此极易受自由基的攻击；③mtDNA复制快速且催化复制的DNA聚合酶γ不具有校读功能，复制错误率高；④mtDNA与核DNA相比缺乏有效的修复机制；⑤每个细胞中含有数百个线粒体，每个线粒体含多个DNA分子，所以细胞中可同时存在正常mtDNA和突变mtDNA，即异质性；⑥mtDNA无内含子，所以mtDNA的突变很容易影响到其基因组内的一些重要功能区域；⑦突变mtDNA是否在组织产生表型效应，这要依突变mtDNA与正常mtDNA相对比例和该组织对线粒体产生的ATP依赖程度而定；⑧线粒体是半自主性细胞器，mtDNA基因的复制、转录和翻译受核DNA的制约；⑨线粒体位于胞质中，故mtDNA的遗传方式是细胞质遗传(母系遗传)，相应地有些线粒体病亦为母系遗传，如线粒体脑肌病、糖尿病等。因此，在研究mtDNA损伤过程中必须要考虑到这些特征[3，4]。
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2 mtDNA氧化损伤的形成
2.1 自由基的产生与Fenton反应 自由基主要来源于线粒体氧化磷酸化过程，它是指任何含有一个或多个不成对电子并能独立存在的基因，如H.、
、OH.、RO.、RO2.、NO.等。约1%～2%线粒体呼吸链消耗的氧被转化为，CoQ与NADH脱氢酶是这一转化过程发生的主要位点[5]；来源于线粒体外膜的单胺氧化酶-A/B对生物胺的氧化可以产生H2O2，这比复合物Ⅱ介导的琥珀酸氧化生成H2O2量要高48倍[6]。, 百拇医药
Fenton反应是针对于过渡性金属而言，过渡性金属除了一种基本状态外，还可形成不止一种的氧化态，这样就允许一个电子的氧化还原反应[7]。Fenton与后来的Haber和Weiss研究建立了Fenton反应基本方程式[8]：MeN++H2O2→Me(N+1)++HO.+H2O
细胞内Fe较Cu、Co的相对优势以及其与螯合配体高亲和力表明：Fe在体内Fenton反应中起重要作用[8]。经Fenton反应生成的Fenton氧化剂是以.OH为典型代表，羟基化和夺取氢是其两种最常见的反应形式[9]。
金属螯合剂由于占用了金属螯合位点而可阻止Fenton反应。在哺乳动物细胞中，去Fe制剂(desferal)和啡啉(o-phenanthroline金属螯合剂)可防止H2O2引起的姐妹染色体交换、DNA单链断裂及细胞损伤[8]。
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2.2 Fenton氧化剂导致mtDNA损伤机理 在H2O2依赖性的DNA损伤中，自由基攻击对象及性质取决于Fe附着于DNA的位点而非羟自由基。Fe介导的Fenton氧化剂按DNA损伤机制至少可分为两种截然不同的类型[10]，类型Ⅰ氧化剂对H2O2、乙醇中度敏感，并选择性裂解DNA的碱基T；类型Ⅱ氧化剂对H2O2、乙醇高度敏感，并选择性裂解DNA的碱基G。这些自由基迥然不同的损伤特征主要是由于介导产生它们的Fe所附着位置不同。
自由基攻击碱基主要导致*OH加合于富含电子的DNA双链，尤其在嘌呤N-7-C-8位点和嘧啶5、6-位点上[9]，一般地，Fenton氧化剂可攻击DNA碱基，也可攻击糖基。攻击糖基时，首先脱氧核糖链上一核糖被夺取氢，然后导致链断裂，碱基逸失。自由基攻击碱基部分并不能引起糖基改变或链断裂，除非修饰的碱基改变了N-糖苷键以允许无碱基位点形成[11]。在被修饰的碱基中，7、8-二氢-8-氧鸟嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-oxo-Gua)和乙二醇胸腺嘧啶(thymine glycol，及其羟化物)受到广泛的关注。可能由于同时存在独特切除酶的缘故，另外还可能由于8-oxo-Gua有高突变性和易于分离与定量[7]。在mtDNA复制过程中8-氧脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(8-oxodeoxyguanosine triphosphate, 8-oxo-dGTP)有高突变率，与其在核中表现的一样，应与8-oxo-dGTP配对的A很容易被C置换，这种错配mtDNA的稳定存在为一些变性疾病奠定基因水平的基础[12]。
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对于mtDNA而言，这些碱基、糖基的改变最终可导致点突变、缺失和插入突变，其中以片段缺失多见。至今已发现老年人不同组织的mtDNA缺失类型有十几种，其中某些缺失只见于某类组织，而另一些缺失却可能在不同组织或器官中出现，4 977 bp缺失是这些缺失中最普遍和研究最多的类型[13]。对应大鼠mtDNA的常缺失是4 834 bp缺失。
2.3 不依赖于Fenton反应的自由基致mtDNA氧化损伤 氮氧自由基的产生不需Fenton反应，
与NO.快速反应生成ONOO-，另外ONOO-也可能与H2O2形成1O2，这种氮氧自由基可以使DNA脱氨基并诱导其突变，还可以增强线粒体氧化应激，及细胞对过氧化物介导损伤的敏感性[7]。存在着与Fenton反应无关的毒作用，如巴豆毒醇诱导白血球产生，并同时引起DNA单链断裂，这种损伤对H2O2水解酶不敏感，且被啡啉诱发而不是抑制[14]。, 百拇医药
单线态氧的产生同样不通过Fenton/H-W。例如，Cl-与H2O2反应生成OCl-，后者再与H2O2生成单线态氧，前一反应在体外被氯过氧化酶催化，在含有丰富H2O2和氯过氧化酶的嗜中性细胞中可见单线态氧的产生[7]。单线态氧容易氧化DNA的鸟嘌呤。上述这些自由基对mtDNA的氧化损伤机理需要进一步研究。
2.4 脂类过氧化导致mtDNA损伤机理 已有证据支持膜脂过氧化作用与自由基诱导的mtDNA损伤密切相关。Nakayama等在1984年发现α-生育酚可通过将氢给予脂质自由基而抑制DNA自由基的形成。两年后，他又发现α-生育酚可以阻止甲基亚麻酸过氧化氢(methyl linoleate hydroperoxide)诱导的DNA损伤。Andrew M.H.于1988年观察到作为使脂自由基失活的抗氧化剂α-生育酚可同时阻止脂质过氧化和DNA损伤；而作为自由基
、H2O2、.OH清除剂的SOD、CAT和甘露醇却无此保护作用；如果说是因为这些清除剂不能进入线粒体发挥作用的话，那么对于另一具有高度膜通透性的自由基清除剂二甲基亚砜，仍不能发现其有阻止脂质过氧化和DNA损伤作用[15]。, http://www.100md.com
尽管脂质过氧化作用诱导mtDNA损伤的确切机制并未得以阐明，但可以推测脂质过氧化过程中产生的LO.、LOO.等自由基可以发挥*OH相似DNA攻击作用，进一步研究仍需继续[15]。
2.5 Cu诱导的mtDNA损伤 由于Cu可在氧化态和还原态之间反复改变，所以它是一种强的致氧化剂(prooxidant)，可产生.OH等自由基，同时Cu能够形成Cu-DNA复合物，在DNA附近生产的自由基很容易攻击这个靶目标，因此Cu能引起核DNA单、双链断裂，碱基交联、氧化、置换等。可推测在Cu过载状态下，线粒体内选择性积累的Cu会以易受氧化损伤的mtDNA为靶目标。而分布于胞浆与溶酶体的Fe即便在过载状态下，亦不会积聚到线粒体，故不能诱导上述作用。若Cu清除途径发生障碍，如编码Cu-转运ATP酶的核基因发生突变，就会产生Wilson's疾病，其特征性体征就是与mtDNA损伤有关的微血管脂肪变性[16]。
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3 机体抗氧化防御系统
3.1 抗氧化酶类 常见的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)等。哺乳动物细胞在胞浆产生Cu、Zn-SOD,在线粒体内产生Mn-SOD。SOD可将
转化为H2O2。当Cu、Zn-SOD、CAT、GSH-PX活性随年龄增大而降低时，Mn-SOD活性却不断增高直至60岁，而后才开始下降，而且Mn-SOD/CAT、Mn-SOD/GSH-PX活性比随年龄增大而增加，这表明自由基清除酶在60岁以前可以有效清除自由基，但60岁后，自由基的产生与清除就会失衡，而产生氧化应激，可见，自由基清除酶的功能下降与氧化应激的不断增强，对于人类衰老进程中发生中的mtDNA氧化损伤起着重要的作用[17]。, http://www.100md.com
然而有研究发现在低浓度或高浓度SOD状态下，脂质过氧化均明显，而在中度浓度SOD状态下，脂质过氧化降低到最小程度，这可能由于
在脂质链式氧化过程中，可同时起启动与终止的作用。所以固然SOD抗氧化作用良好，但体内SOD浓度并非愈高愈好[18]。CAT与GSH-PX同时起着水解H2O2作用。在哺乳动物细胞中，CAT大多存在于过氧化物酶体中，且分泌较少，而GSP-PX则可广泛存在于线粒体、胞浆、过氧化物酶体，且作用强于CAT，特异性低于CAT，故可降解有机过氧化物，氧化的谷胱甘肽可由NADPH依赖的GSH还原酶还原[7]。
SOD、CAT、GSH-PX三者相对水平的高低对于它们抗氧化作用的有效发挥很重要。例如，增加的SOD消耗了
，但增多了H2O2，过多的H2O2若不能被CAT、GSH-PX及时清除，就会有害于机体，然而过多的GSH-PX并不必要，它过分消耗了GSH和NADPH，尽管存在着足量的CAT[7]。, 百拇医药
白细胞内还含有硫醇特异性抗氧化酶，在低浓度H2O2(～50 μm)状态下发挥硫醇依赖的过氧化物酶的作用：高浓度H2O2(～10 mm)时，这种酶可以阻止由于硫醇/金属催化氧化造成的DNA损伤，然而这种保护作用在过氧化物酶体中并未发现[7]。
对DNA而言，唯一有效防御自由基的措施是非酶性的，组蛋白和紧密完整的染色体结构可以有效地保护DNA，然而mtDNA却缺乏组蛋白的保护及其它DNA结合蛋白，这是mtDNA对氧化损伤敏感性较核DNA高的重要原因之一。
3.2 抗氧化剂 大量研究已证实，VitE、VitC在体内具有强的抗氧化特性。近年研究也发现，VitE、VitC可以延缓mtDNA遭受与衰老相关的损伤。在研究AZT(一种治疗AIDS的药物)对骨骼肌mtDNA氧化损伤作用时发现，饮食中补允VitE、VitC的病人，服用AZT的副作用明显减弱[19]。β-胡萝卜素也具有清除自由基的作用。氧自由基连锁反应过程及其与抗氧化系统的关系可概括如下[22]，见图1。
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图1 氧自由基连锁反应过程及其与抗氧化系统的关系
Figure 1 Chain reaction of oxygen free radical and its
relationship with antioxidation
RO. organic free radical ROO. organic peroxide free radical
4 mtDNA氧化损伤的修复
正常状态下，机体抗氧化系统完全可以抵御自由基的攻击，一旦由于各种原因，抗氧化防御系统作用减弱或自由基产生过多而突破机体防御系统，那么mtDNA就会很容易发生损伤，这时，mtDNA的损伤修复系统就要启动。以前多数研究者认为，mtDNA缺乏有效的修复机制，然而近年来，不断的研究发现线粒体还是具有一定的DNA氧化损伤修复能力的。
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4.1 碱基切除修复 碱基切除修复被证实是通过一种DNA糖基酶，这种酶可以识别损伤的碱基，裂解其糖苷键。在细菌与哺乳动物细胞中有三种蛋白质参与G损伤修复：8-oxo-Gua DNA糖基酶/AP水解酶(Fpg Pro.或MutM)；A DNA糖基酶(MutY)，这种酶可以识别并切除与8-oxo-Gua错配的碱基A；8-oxo-dGTP酶(MutT)，此酶可以水解8-oxo-dGTP，生成8-oxo-dGMP。这样，损伤的G就不会再插入新合成的DNA中。目前，Fpg Pro.与MutT类似物已经从线粒体中分离出来，线粒体中是否存在MutY类似物仍需进一步探讨[20]。
对于单线态氧诱导的DNA碱基损伤，在线粒体中也存在着快速而有效的修复，另外线粒体内还存在AP内切酶、尿嘧啶DNA糖基酶等。
4.2 核苷切除修复 这一过程需要多种酶复合体同时参与，最终导致一段寡核苷酸链的切除。这一复杂的修复过程目前还未在线粒体中发现。已证实对于UV诱导的二聚体，线粒体缺乏修复能力。然而线粒体却可以修复4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)诱导的DNA损伤，而在核内4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)的损伤是通过核苷切除修复途径修复的，是否有核苷切除修复蛋白质与线粒体修复过程还未知[21]。
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4.3 重组修复 田鼠的mtDNA可以通过重组修复去除Cisplatin(含重金属化合物)引起的链内交联；Thyagrajan B等在体外用人体线粒体蛋白质抽提物可以在质粒间建立重组，此实验有力地支持了这一假设：哺乳动物线粒体可以利用同质性碱基重组修复损伤的DNA。
综上述所，mtDNA拥有一定的自我修复能力，然而大量研究显示mtDNA遭受比核DNA高数十倍的突变率，是否线粒体中氧化应激水平太高了，以致于即便具有效的修复系统，也不能维持一种低损伤水平?或者根本上，mtDNA的氧化损伤并不高于核DNA，而以前报告的8-oxo-dG水平偏高，可能由于分离过程中人工氧化所致?
5 结束语
mtDNA的氧化损伤可导致线粒体氧化磷酸化功能障碍，从而引起细胞能量代谢削弱，造成细胞坏死和凋亡，对能量需求较高的中枢神经系统及肌肉组织会因此受到累及，而出现功能障碍甚至疾病。随着研究的不断深入，发现越来越多的疾病与mtDNA损伤突变有关，如Kearns-Sayre综合征、Leber's遗传性神经病、Parkinson's病、慢性遗传性舞蹈病等。mtDNA损伤与衰老关系也已成为目前生命科学研究的热点。所以，阐明mtDNA氧化损伤的机制在理论上和临床实践上都具有重要意义。
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然而在这一领域内还需要进一步开展大量的研究工作，mtDNA氧化在整个细胞氧化应激中重要性，mtDNA损伤突变与线粒体功能缺陷、细胞凋亡关系如何，mtDNA损伤突变与衰老孰因孰果等等问题都有待于解决。
【作者简介】 王琳琳(1976-)，女，安徽泗县人，在读硕士研究生
凌文华(1956-)，男，安徽巢湖人，教授，博士，博士生导师，院长，主要研究方向：营养与疾病，1989～1997年在芬兰、加拿大、美国留学与工作。
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(收稿日期 1999-12-22), 百拇医药