广州地区淋病奈瑟菌的耐药性监测
作者：徐德兴 王露霞 熊剑辉 陈惠玲 叶惠芬 张惠莲 吕苏成
单位：徐德兴 王露霞(广州军区广州总医院检验科 510010)；熊剑辉 陈惠玲 叶惠芬 张惠莲(广东省广州市第一人民医院检验科)；吕苏成(第一军医大学珠江医院检验科)
关键词：淋病奈瑟菌；耐药监测
广东医学000103
【摘要】 目的 了解广州地区淋病奈瑟菌的耐药趋势，为防治淋病提供用药指导。方法 对分离到的124株淋病奈瑟菌选用青霉素、环丙沙星、四环素、壮观霉素和头孢曲松进行K-B法药敏试验，选用青霉素、环丙沙星、壮观霉素和头孢曲松进行E-test法药敏试验，同时用头孢硝噻吩进行β-内酰胺酶测定。结果 淋病奈瑟菌β-内酰胺酶阳性株(PPNG)有11.3%。K-B法耐药率：青霉素68.5%、环丙沙星85.5%、四环素47.6%、壮观霉素1.6%、头孢曲松6.5%。E-test法耐药率：青霉素33.9%、环丙沙星89.5%、壮观霉素1.6%、头孢曲松0.8%。结论 目前广州地区PPNG为11.3%，四环素耐药率未见明显上升，环丙沙星耐药率明显高于1996年南京、重庆、合肥、福州等地的耐药率，表明氟喹诺酮类也已不能作为治疗淋病的首选药物。耐青霉素、四环素和环丙沙星的多重耐药菌株已达41.9%，明显高于1996年国内10.26%水平。头孢曲松、壮观霉素仍是治疗淋病有效药物，但也应加强对其耐药性的监测，及时掌握耐药的趋势。比较K-B法与E-test法检测方法比较，二种方法对4种抗生素的敏感率无明显差异，但在青霉素检测中二法在耐药与中介的划分上差异有显著性。
, 百拇医药
淋病奈瑟菌(NGO)引起的淋病多年来一直是我国目前流行的性传播疾病中发病率最高的病种之一。近年来，NGO的耐药问题日益严重，已引起人们高度重视。其中多重耐药菌株的出现，成为淋病防治工作中的一个较突出的难题。NGO对抗生素的耐药模式随时间及地区有一定的差异。为了解广州地区NGO的耐药趋势，为防治淋病提供实验室的用药依据，我们将广州四家医疗单位分离到的124株NGO进行K-B法及E-test法药敏监测。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 从1998年5月至1999年4月分别由广州市第一人民医院、广州军区广州总医院、珠江医院和广州市皮肤病防治所等提供菌种，按照全国临床检验操作规程进行鉴定，确诊为NGO后，分纯、洗脱到脱纤维羊血中，-80℃冰箱保存。质控菌株是淋病奈瑟菌ATCC49226。
1.2 抗生素 药敏纸片由英国Oxoid公司出品，品种有青霉素(PEN)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、壮观霉素(SPE)和头孢曲松(CRO)。E-test药敏试条由瑞士AB Boidistk公司生产，品种有青霉素(PEN)、环丙沙星(CIP)、壮观霉素(SPE)和头孢曲松(CRO)。
, 百拇医药
1.3 培养基 选用含10 g/L生长补充剂的GC琼脂，K-B法制备厚4 mm、直径9 cm平皿，E-test法选用直径15 cm平皿。
1.4 药敏方法 药敏测定前先将菌种复苏、用巧克力琼脂传代培养3次，然后直接按照全国临床检验操作规程进行K-B法药敏试验，E-test操作按试剂条使用说明书进行。
本课题为广州市科委重点科研项目(科研批文 98-Z-01-022)，组长单位：广州市第一人民医院
1.5 β-内酰胺酶测定 于微量稀释板内加1滴头孢硝噻吩基质溶液，再加入浓菌液与之混合，如细菌产生β-内酰胺酶，则在室温10 min内液体由黄色变成红色，黄色不变为阴性。
1.6 资料分析 用WHONET4进行。按NCCLS药敏判断标准判读。
2 结果
, 百拇医药
2.1 β-内酰胺酶测定结果 在124株淋病奈瑟菌中β-内酰胺酶阳性株(PPNG)14株(11.3%)。4家医院阳性分布是广州市第一人民医院10/45(22.2%)、广州军区总医院3/37(8.1%)、珠江医院1/15(6.7%)、广州市皮肤病防治所0/27(0)。
2.2 K-B法测定5种抗生素对124株NGO的敏感性 见表1。
2.3 E-test法测定4种抗生素对124株NGO的敏感性 见表2。
2.4 K-B法与E-test法药敏结果比较 见表3。
表1 K-B法测定5种抗生素药敏检测统计表 抗生素
折点范围
菌株数
, 百拇医药
?R(%)
?I(%)
?S(%)
PEN
27～46
124
68.5
31.5
0.0
CIP
S≥36
124
85.5
, 百拇医药
0.0
14.5
TET
31～37
124
47.6
41.9
10.5
SPE
15～17
124
1.6
0.0
, 百拇医药
98.4
CRO
S≥35
124
6.5
0.0
93.5
表2 E-test法测定4种抗生素药敏检测统计表 抗生素
折点范围
菌株数
?R(%)
I(%)
, 百拇医药 S(%)
?MIC50
MIC90
PEN
S≤0.064, R≥2
124
33.9
65.3
0.8
1
3
CIP
S≤0.064, R≥0.12
, 百拇医药
124
89.5
0.0
10.5
6
32
SPE
S≤32, R≥128
124
1.6
0.0
98.4
8
, 百拇医药
12
CRO
S≤0.25,?R≥0.5
124
0.8
0.0
99.2
0.016
0.047
表3 K-B法与E-test法药敏结果比较% 抗生素
K-B法
E-test法
, http://www.100md.com
?R
I
?S
R
I
?S
PEN
68.5
31.5
0.0
33.9
65.3
0.8
, 百拇医药 CIP
85.5
0.0
14.5
89.5
0.0
10.5
SPE
1.6
0.0
98.4
1.6
0.0
, 百拇医药
98.4
CRO
6.5
0.0
93.5
0.8
0.0
99.2
3 讨论
近20 a来，淋病奈瑟菌耐药问题在全球日益严重。我国1995年PPNG的流行率还比较低，在0.1%～4.19%左右[1]。本组资料显示，1998年广州地区PPNG为11.3%，明显高于我国1995年的水平。结合青霉素对淋病奈瑟菌的MIC值分析，有33.9%的菌株落在耐药区，65.3%落在中介区，只有0.8%在敏感区域内，表明PPNG在广州的流行将日益严重。本文资料显示，淋球菌对环丙沙星的耐药率为各抗生素之首，两种药敏测试耐药率均在85%以上、敏感率在15%以下，虽然目前青霉素和四环素不再作为治疗淋病的首选药物，但对这两种药物进行耐药监测，仍然具有流行病学意义。作者未对四环素进行MIC的测定，但从K-B法药敏试验结果分析，本组耐四环素的菌株有47.6%， 与文献报道[1～3]比较，耐药率未见明显上升。近年来国外报道，随着氟喹诺酮药物的广泛应用，淋球菌对环丙沙星等氟喹诺酮类药物的耐药株不断增多[4，5]。本资料中无论E-test法还是K-B法测到的对环丙沙星的耐药率均在85%以上，明显高于1996年南京、重庆、合肥、福州等地和1997年镇江地区的耐药率[1，3]，表明氟喹诺酮类也已不能作为治疗淋病的首选药物。耐青霉素菌株同时对四环素和环丙沙星等其他抗生素交叉耐药的现象也明显可见，本资料中同时耐青霉素、四环素和环丙沙星的多重耐药菌株达41.9%(52/124)，明显高于1996年国内10.26%水平[1]。壮观霉素已广泛用于治疗淋病，国外已有发现耐壮观霉素淋球菌株[7]，1993年青岛地区还未出现MIC大于64 μg/ml菌株，1995年苏晓红等检测了南京、重庆、合肥和福州390株淋球菌结果仅在合肥地区检到1株MIC为64 μg/ml菌株，1996年王震等在镇江地区检测165株中检到2株MIC为64 μg/ml，但均未检到MIC≥128 μg/ml的菌株[1，3，6]。1995年叶顺章等检测200株淋球菌，其中有9株MIC为64 μg/ml、2株为128 μg/ml[8]，按当时MIC≥64 μg/ml为耐药折点分析，耐药率为5.5%，如按现在NCCLS标准则为1.0%。本文所测的壮观霉素的耐药率为1.6%(2/124)、敏感率为98.4%(122/124)，表明壮观霉素仍是治疗淋病的首选药物之一，但其耐药菌株的出现，应引起我们高度重视。
, 百拇医药
头孢曲松也是治疗淋病的常用药物。1995年苏晓红等[1]在四市检测到的均为头孢曲松敏感株，1996年王震等[3]在镇江地区检测到98.8%为敏感株，也未检测到耐药株。本文检测头孢曲松E-test法耐药率为0.8%、敏感率为99.2%，K-B法的耐药率为6.5%、敏感率为93.5%。 表明头孢曲松仍是治疗淋病有效药物，但也应加强对其的耐药性监测，及时掌握耐药的趋势。
本文将青霉素、环丙沙星、壮观霉素和头孢曲松同时进行了K-B法与E-test法药敏测试，分析两种方法的药敏试验差异。结果显示，两种方法对壮观霉素的药敏测试结果完全一致。环丙沙星的药敏结果K-B法85.5%耐药、14. 5%敏感，E-test法98.5%耐药、14. 5%敏感，两种方法差异无显著性(χ2＝0. 719，P>0.05)。头孢曲松K-B法的耐药率为6.5%、敏感率为93.5%，E-test法耐药率为0.8%、敏感率为99.2%，两种方法差异无显著性(χ2＝0.331 9，P>0.05)。虽然两种方法对青霉素耐药和中介差异有非常显著性(χ2＝23.490，P<0.005)，但敏感率却十分接近。比较两法的峰值范围我们发现：K-B法抑菌圈的峰值在22～26 mm之内，刚好落在耐药区；而E-test法MIC的几何平均值为0.91，属于中介范围，表明有部分K-B法耐药的菌株， 实际在MIC处于中介范围。如果将耐药和中介值划在一起与敏感株进行统计分析，那么差异无显著性(χ2＝0.803，P>0.05)。
, http://www.100md.com
WHO推荐的K-B法适用于肠杆菌科和一些快生长的细菌，但不适用于嗜血杆菌、肺炎链球菌和奈瑟菌。稀释法的MIC繁琐工作量大；而E-test法虽简便准确，但试剂条的价格贵，都不便用于常规检测。本文通过K-B法与E-test法比较，我们感到K-B法作为日常对淋球菌的耐药性检测，了解总的耐药趋势，在指导临床用药方面，其检测结果仍然是可以参考的。但对淋球菌进行流行病学检测的时候，仍是MIC法或E-test法显得更为可信可靠。
参考文献
1，苏晓红, 叶顺章, 陈，平,等. 淋球菌对五种抗菌药物敏感性测定及营养型分布. 中华皮肤科杂志, 1996,29: 163
2，吴，红，朱道银. 淋球菌营养型与耐药性及质粒的关系. 中华皮肤科杂志，1998,31: 163
3，王，震，张文昭，陈金梅.165株淋病奈瑟氏菌药敏试验结果分析.，临床检验杂志，1997，6359
, 百拇医药
4，Kam KM， Lo KK，Ho NKY，et al. Rapid decline in peni-cillinase-producing Neisseria gonorrhoease in Hong Kong associ-ated with emerging of 4-fluoroquinolone resistance.Genitourin Med，1995，71：141
5，Tanaka M，Kumazawa J，Matsumoto T，et al.High provalence of Neisseria gonorrhoeae strains with reduced susceptibility to fluoroquinolones in Japan.Genitourin Med，1994，70：90
6，王英才，张世芬，王成波，等. 1989年至1993年青岛地区淋球菌对壮观霉素和氟哌酸的敏感度测定. 中华皮肤科杂志，1995，28：117
7，Clendennen TE. Echeverria P， Saengeur S， et al. Antibiotic ausceptibility survey of Neisseria gonorrhoeae in Tailand.Antimicrob Agents Chemother，1992，36：1682
8，叶顺章，陈，平，王 海，等. 淋球菌对壮观霉素的敏感性测定. 中华皮肤科杂志，1995，28：203
(收稿日期：1999-11-30), 百拇医药
单位：徐德兴 王露霞(广州军区广州总医院检验科 510010)；熊剑辉 陈惠玲 叶惠芬 张惠莲(广东省广州市第一人民医院检验科)；吕苏成(第一军医大学珠江医院检验科)
关键词：淋病奈瑟菌；耐药监测
广东医学000103
【摘要】 目的 了解广州地区淋病奈瑟菌的耐药趋势，为防治淋病提供用药指导。方法 对分离到的124株淋病奈瑟菌选用青霉素、环丙沙星、四环素、壮观霉素和头孢曲松进行K-B法药敏试验，选用青霉素、环丙沙星、壮观霉素和头孢曲松进行E-test法药敏试验，同时用头孢硝噻吩进行β-内酰胺酶测定。结果 淋病奈瑟菌β-内酰胺酶阳性株(PPNG)有11.3%。K-B法耐药率：青霉素68.5%、环丙沙星85.5%、四环素47.6%、壮观霉素1.6%、头孢曲松6.5%。E-test法耐药率：青霉素33.9%、环丙沙星89.5%、壮观霉素1.6%、头孢曲松0.8%。结论 目前广州地区PPNG为11.3%，四环素耐药率未见明显上升，环丙沙星耐药率明显高于1996年南京、重庆、合肥、福州等地的耐药率，表明氟喹诺酮类也已不能作为治疗淋病的首选药物。耐青霉素、四环素和环丙沙星的多重耐药菌株已达41.9%，明显高于1996年国内10.26%水平。头孢曲松、壮观霉素仍是治疗淋病有效药物，但也应加强对其耐药性的监测，及时掌握耐药的趋势。比较K-B法与E-test法检测方法比较，二种方法对4种抗生素的敏感率无明显差异，但在青霉素检测中二法在耐药与中介的划分上差异有显著性。
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淋病奈瑟菌(NGO)引起的淋病多年来一直是我国目前流行的性传播疾病中发病率最高的病种之一。近年来，NGO的耐药问题日益严重，已引起人们高度重视。其中多重耐药菌株的出现，成为淋病防治工作中的一个较突出的难题。NGO对抗生素的耐药模式随时间及地区有一定的差异。为了解广州地区NGO的耐药趋势，为防治淋病提供实验室的用药依据，我们将广州四家医疗单位分离到的124株NGO进行K-B法及E-test法药敏监测。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 从1998年5月至1999年4月分别由广州市第一人民医院、广州军区广州总医院、珠江医院和广州市皮肤病防治所等提供菌种，按照全国临床检验操作规程进行鉴定，确诊为NGO后，分纯、洗脱到脱纤维羊血中，-80℃冰箱保存。质控菌株是淋病奈瑟菌ATCC49226。
1.2 抗生素 药敏纸片由英国Oxoid公司出品，品种有青霉素(PEN)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、壮观霉素(SPE)和头孢曲松(CRO)。E-test药敏试条由瑞士AB Boidistk公司生产，品种有青霉素(PEN)、环丙沙星(CIP)、壮观霉素(SPE)和头孢曲松(CRO)。
, 百拇医药
1.3 培养基 选用含10 g/L生长补充剂的GC琼脂，K-B法制备厚4 mm、直径9 cm平皿，E-test法选用直径15 cm平皿。
1.4 药敏方法 药敏测定前先将菌种复苏、用巧克力琼脂传代培养3次，然后直接按照全国临床检验操作规程进行K-B法药敏试验，E-test操作按试剂条使用说明书进行。
本课题为广州市科委重点科研项目(科研批文 98-Z-01-022)，组长单位：广州市第一人民医院
1.5 β-内酰胺酶测定 于微量稀释板内加1滴头孢硝噻吩基质溶液，再加入浓菌液与之混合，如细菌产生β-内酰胺酶，则在室温10 min内液体由黄色变成红色，黄色不变为阴性。
1.6 资料分析 用WHONET4进行。按NCCLS药敏判断标准判读。
2 结果
, 百拇医药
2.1 β-内酰胺酶测定结果 在124株淋病奈瑟菌中β-内酰胺酶阳性株(PPNG)14株(11.3%)。4家医院阳性分布是广州市第一人民医院10/45(22.2%)、广州军区总医院3/37(8.1%)、珠江医院1/15(6.7%)、广州市皮肤病防治所0/27(0)。
2.2 K-B法测定5种抗生素对124株NGO的敏感性 见表1。
2.3 E-test法测定4种抗生素对124株NGO的敏感性 见表2。
2.4 K-B法与E-test法药敏结果比较 见表3。
表1 K-B法测定5种抗生素药敏检测统计表 抗生素
折点范围
菌株数
, 百拇医药
?R(%)
?I(%)
?S(%)
PEN
27～46
124
68.5
31.5
0.0
CIP
S≥36
124
85.5
, 百拇医药
0.0
14.5
TET
31～37
124
47.6
41.9
10.5
SPE
15～17
124
1.6
0.0
, 百拇医药
98.4
CRO
S≥35
124
6.5
0.0
93.5
表2 E-test法测定4种抗生素药敏检测统计表 抗生素
折点范围
菌株数
?R(%)
I(%)
, 百拇医药 S(%)
?MIC50
MIC90
PEN
S≤0.064, R≥2
124
33.9
65.3
0.8
1
3
CIP
S≤0.064, R≥0.12
, 百拇医药
124
89.5
0.0
10.5
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32
SPE
S≤32, R≥128
124
1.6
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98.4
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12
CRO
S≤0.25,?R≥0.5
124
0.8
0.0
99.2
0.016
0.047
表3 K-B法与E-test法药敏结果比较% 抗生素
K-B法
E-test法
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?R
I
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R
I
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PEN
68.5
31.5
0.0
33.9
65.3
0.8
, 百拇医药 CIP
85.5
0.0
14.5
89.5
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10.5
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1.6
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1.6
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, 百拇医药
98.4
CRO
6.5
0.0
93.5
0.8
0.0
99.2
3 讨论
近20 a来，淋病奈瑟菌耐药问题在全球日益严重。我国1995年PPNG的流行率还比较低，在0.1%～4.19%左右[1]。本组资料显示，1998年广州地区PPNG为11.3%，明显高于我国1995年的水平。结合青霉素对淋病奈瑟菌的MIC值分析，有33.9%的菌株落在耐药区，65.3%落在中介区，只有0.8%在敏感区域内，表明PPNG在广州的流行将日益严重。本文资料显示，淋球菌对环丙沙星的耐药率为各抗生素之首，两种药敏测试耐药率均在85%以上、敏感率在15%以下，虽然目前青霉素和四环素不再作为治疗淋病的首选药物，但对这两种药物进行耐药监测，仍然具有流行病学意义。作者未对四环素进行MIC的测定，但从K-B法药敏试验结果分析，本组耐四环素的菌株有47.6%， 与文献报道[1～3]比较，耐药率未见明显上升。近年来国外报道，随着氟喹诺酮药物的广泛应用，淋球菌对环丙沙星等氟喹诺酮类药物的耐药株不断增多[4，5]。本资料中无论E-test法还是K-B法测到的对环丙沙星的耐药率均在85%以上，明显高于1996年南京、重庆、合肥、福州等地和1997年镇江地区的耐药率[1，3]，表明氟喹诺酮类也已不能作为治疗淋病的首选药物。耐青霉素菌株同时对四环素和环丙沙星等其他抗生素交叉耐药的现象也明显可见，本资料中同时耐青霉素、四环素和环丙沙星的多重耐药菌株达41.9%(52/124)，明显高于1996年国内10.26%水平[1]。壮观霉素已广泛用于治疗淋病，国外已有发现耐壮观霉素淋球菌株[7]，1993年青岛地区还未出现MIC大于64 μg/ml菌株，1995年苏晓红等检测了南京、重庆、合肥和福州390株淋球菌结果仅在合肥地区检到1株MIC为64 μg/ml菌株，1996年王震等在镇江地区检测165株中检到2株MIC为64 μg/ml，但均未检到MIC≥128 μg/ml的菌株[1，3，6]。1995年叶顺章等检测200株淋球菌，其中有9株MIC为64 μg/ml、2株为128 μg/ml[8]，按当时MIC≥64 μg/ml为耐药折点分析，耐药率为5.5%，如按现在NCCLS标准则为1.0%。本文所测的壮观霉素的耐药率为1.6%(2/124)、敏感率为98.4%(122/124)，表明壮观霉素仍是治疗淋病的首选药物之一，但其耐药菌株的出现，应引起我们高度重视。
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头孢曲松也是治疗淋病的常用药物。1995年苏晓红等[1]在四市检测到的均为头孢曲松敏感株，1996年王震等[3]在镇江地区检测到98.8%为敏感株，也未检测到耐药株。本文检测头孢曲松E-test法耐药率为0.8%、敏感率为99.2%，K-B法的耐药率为6.5%、敏感率为93.5%。 表明头孢曲松仍是治疗淋病有效药物，但也应加强对其的耐药性监测，及时掌握耐药的趋势。
本文将青霉素、环丙沙星、壮观霉素和头孢曲松同时进行了K-B法与E-test法药敏测试，分析两种方法的药敏试验差异。结果显示，两种方法对壮观霉素的药敏测试结果完全一致。环丙沙星的药敏结果K-B法85.5%耐药、14. 5%敏感，E-test法98.5%耐药、14. 5%敏感，两种方法差异无显著性(χ2＝0. 719，P>0.05)。头孢曲松K-B法的耐药率为6.5%、敏感率为93.5%，E-test法耐药率为0.8%、敏感率为99.2%，两种方法差异无显著性(χ2＝0.331 9，P>0.05)。虽然两种方法对青霉素耐药和中介差异有非常显著性(χ2＝23.490，P<0.005)，但敏感率却十分接近。比较两法的峰值范围我们发现：K-B法抑菌圈的峰值在22～26 mm之内，刚好落在耐药区；而E-test法MIC的几何平均值为0.91，属于中介范围，表明有部分K-B法耐药的菌株， 实际在MIC处于中介范围。如果将耐药和中介值划在一起与敏感株进行统计分析，那么差异无显著性(χ2＝0.803，P>0.05)。
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WHO推荐的K-B法适用于肠杆菌科和一些快生长的细菌，但不适用于嗜血杆菌、肺炎链球菌和奈瑟菌。稀释法的MIC繁琐工作量大；而E-test法虽简便准确，但试剂条的价格贵，都不便用于常规检测。本文通过K-B法与E-test法比较，我们感到K-B法作为日常对淋球菌的耐药性检测，了解总的耐药趋势，在指导临床用药方面，其检测结果仍然是可以参考的。但对淋球菌进行流行病学检测的时候，仍是MIC法或E-test法显得更为可信可靠。
参考文献
1，苏晓红, 叶顺章, 陈，平,等. 淋球菌对五种抗菌药物敏感性测定及营养型分布. 中华皮肤科杂志, 1996,29: 163
2，吴，红，朱道银. 淋球菌营养型与耐药性及质粒的关系. 中华皮肤科杂志，1998,31: 163
3，王，震，张文昭，陈金梅.165株淋病奈瑟氏菌药敏试验结果分析.，临床检验杂志，1997，6359
, 百拇医药
4，Kam KM， Lo KK，Ho NKY，et al. Rapid decline in peni-cillinase-producing Neisseria gonorrhoease in Hong Kong associ-ated with emerging of 4-fluoroquinolone resistance.Genitourin Med，1995，71：141
5，Tanaka M，Kumazawa J，Matsumoto T，et al.High provalence of Neisseria gonorrhoeae strains with reduced susceptibility to fluoroquinolones in Japan.Genitourin Med，1994，70：90
6，王英才，张世芬，王成波，等. 1989年至1993年青岛地区淋球菌对壮观霉素和氟哌酸的敏感度测定. 中华皮肤科杂志，1995，28：117
7，Clendennen TE. Echeverria P， Saengeur S， et al. Antibiotic ausceptibility survey of Neisseria gonorrhoeae in Tailand.Antimicrob Agents Chemother，1992，36：1682
8，叶顺章，陈，平，王 海，等. 淋球菌对壮观霉素的敏感性测定. 中华皮肤科杂志，1995，28：203
(收稿日期：1999-11-30), 百拇医药