肝炎患者血清中经输血传播病毒的核酸检测
作者：唐漾波 谭奕洲 蔡晓莉
单位：广东省广州市第八人民医院传染病研究所 510060
关键词：经输血传播病毒；半巢式聚合酶链反应；病毒性肝炎，非；甲-庚型；病毒性肝炎，乙型
广东医学000119
【摘要】 目的 了解肝炎患者中经输血传播病毒(TTV)的感染情况 及流行特征。方法 采用半巢式聚合酶链反应方法检测肝炎患者血清中TTV DNA，特异性引物位于TTV基因组的ORF1保守区。结果 66例急慢性肝炎 患者血清中共检出10例TTV DNA阳性，总阳性率为15%，其中16例非甲-庚型肝炎中检出4 例阳 性(25%)，39例乙型肝炎中检出6例阳性(15%)，11例其他类型肝炎中未检出阳性病例。 结论 广州地区肝炎患者中存在TTV感染，其感染可能为非甲-庚型肝炎 较重要的致病源，并可以与其他类型肝炎病毒合并感染。
, 百拇医药
1997年10月Nishizawa等[1]运用代表性差异技术，首次从1 例不明原因的输血后肝炎患者血清中分离到一种肝炎相关基因，暂命名为经输血传播病毒(t ransfusion transmitted virus, TTV)。同年，Okzmoto等[2]完成了TTV全基因序 列测定。现已知TTV是一个3.7 kb的无包膜的单股DNA病毒，为了解肝炎患者中TTV的感染情 况及临床特点，笔者对16例非甲-庚型肝炎、39例乙型肝炎及11例其他类型肝炎的共66例 病例血清中的TTV DNA进行了检测，并对其临床及流行病学特点进行分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 66例急慢性肝炎病例均为我院1998年9月至1999年2月期间 的住院及门诊患者，其中非甲-庚型肝炎16例、急慢性乙型肝炎39例、慢性丙型肝炎6例 、慢性乙型肝炎合并HCV感染4例、慢性乙型肝炎合并HCV/HGV感染1例。以上病例血清检测中 抗-HAV、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用ELISA方法，HBV DNA、HCV RNA、 H EV RNA及HGV RNA检测分别采用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-巢式PCR方法。
, 百拇医药
1.2 TTV DNA检测
1.2.1 提取TTV DNA 血清100 μl溶于300 μl变性溶液[3] ，充分混匀后，冰浴15 min，依次加入水饱和酚500 μl、氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100 μl，混匀后静置5 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液加入等量的异丙醇，-20 ℃ 4 h后12 000 r/min离心15 min，真空抽干，加入去核酸水38 μl，反复指弹使之溶解。
1.2.2 PCR反应 采用半巢式聚合酶链反应方法，引物位于TTV ORF1 保守区，序列见表1。在上述DNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对外 引物及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第1次PCR循环，循环 参数为94℃ 45 s，50℃ 45 s， 72℃ 60 s，共35个循环，最后延伸5 min。于离心管中加 入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混 匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。
, 百拇医药
表1 半巢式PCR检测TTV DNA的引物序列 引物
序 列
外正链
5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAACAT-3′
外负链
5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT-3′
内正链
5′-GGCAACATGTTATGGATAGACTGG-3′
内负链
同外负链
1.2.3 产物检测 取第2次PCR产物10 μl进行20 g/L琼脂糖凝胶( 含EB 0.5 μg/μl)电泳，紫外线检测仪下观测结果，于356 bp处出现特异性荧光条带为阳性， 否则为阴性，检测过程中采用已知TTV DNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。2 结果
, http://www.100md.com
66例急慢性肝炎血清中共检出10例TTV DNA阳性，总阳性率为15%，其中16例非甲-庚型肝炎中检出4例阳性(25%)，39例乙型肝炎中检出6例阳性(15%)，11例其他合并感染 类型肝炎中未检出阳性病例。
3 讨论
本组资料显示急慢性肝炎血清中TTV DNA的阳性率为15%，说明肝炎患者中存在TT V 感染。另外，结果还显示非甲-庚型肝炎中TTV的感染率(25%)高于乙型肝炎患者中TTV的感染 率(15%)，16例非甲-庚型肝炎中检出的4例TTV DNA阳性病例中1例表现为急性无黄疸性 肝炎，症状较轻微，2例临床上表现为轻度慢性肝炎，1例表现为活动性肝炎后肝硬化。由于 此4例均为甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志均阴性的单独TTV DNA阳性病例，故TTV感染 可能为这些非甲-庚型肝炎的致病原，TTV可以与其他类型肝炎病毒合并感染。
至今普遍认为TTV主要经血传播，国内骆抗先等[4]从肝炎患者的急性期血清和潜 伏期粪便中检出一种与TTV有同源性的基因片段，说明TTV也可通过肠道途径传播。本组结果 中10例TTV DNA阳性病例中，5例无输血和血制品暴露史，5例有外科手术史，其中3例有 手术中输血史，另2例术中输血情况不详；说明除经血传播外，TTV感染尚存在其他感染途 径。
, 百拇医药
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi, et al. A novel DNA virus (TTV) associ ated with elevated transminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown et iology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92
2，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and character ization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998,10:1
3，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid-g uanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156
4，骆抗先，章，廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学及病 毒学的初步研究.中华肝脏病杂志，1998， 6(3)：161
(收稿日期：1999-02-26), 百拇医药
单位：广东省广州市第八人民医院传染病研究所 510060
关键词：经输血传播病毒；半巢式聚合酶链反应；病毒性肝炎，非；甲-庚型；病毒性肝炎，乙型
广东医学000119
【摘要】 目的 了解肝炎患者中经输血传播病毒(TTV)的感染情况 及流行特征。方法 采用半巢式聚合酶链反应方法检测肝炎患者血清中TTV DNA，特异性引物位于TTV基因组的ORF1保守区。结果 66例急慢性肝炎 患者血清中共检出10例TTV DNA阳性，总阳性率为15%，其中16例非甲-庚型肝炎中检出4 例阳 性(25%)，39例乙型肝炎中检出6例阳性(15%)，11例其他类型肝炎中未检出阳性病例。 结论 广州地区肝炎患者中存在TTV感染，其感染可能为非甲-庚型肝炎 较重要的致病源，并可以与其他类型肝炎病毒合并感染。
, 百拇医药
1997年10月Nishizawa等[1]运用代表性差异技术，首次从1 例不明原因的输血后肝炎患者血清中分离到一种肝炎相关基因，暂命名为经输血传播病毒(t ransfusion transmitted virus, TTV)。同年，Okzmoto等[2]完成了TTV全基因序 列测定。现已知TTV是一个3.7 kb的无包膜的单股DNA病毒，为了解肝炎患者中TTV的感染情 况及临床特点，笔者对16例非甲-庚型肝炎、39例乙型肝炎及11例其他类型肝炎的共66例 病例血清中的TTV DNA进行了检测，并对其临床及流行病学特点进行分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 66例急慢性肝炎病例均为我院1998年9月至1999年2月期间 的住院及门诊患者，其中非甲-庚型肝炎16例、急慢性乙型肝炎39例、慢性丙型肝炎6例 、慢性乙型肝炎合并HCV感染4例、慢性乙型肝炎合并HCV/HGV感染1例。以上病例血清检测中 抗-HAV、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用ELISA方法，HBV DNA、HCV RNA、 H EV RNA及HGV RNA检测分别采用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-巢式PCR方法。
, 百拇医药
1.2 TTV DNA检测
1.2.1 提取TTV DNA 血清100 μl溶于300 μl变性溶液[3] ，充分混匀后，冰浴15 min，依次加入水饱和酚500 μl、氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100 μl，混匀后静置5 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液加入等量的异丙醇，-20 ℃ 4 h后12 000 r/min离心15 min，真空抽干，加入去核酸水38 μl，反复指弹使之溶解。
1.2.2 PCR反应 采用半巢式聚合酶链反应方法，引物位于TTV ORF1 保守区，序列见表1。在上述DNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对外 引物及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第1次PCR循环，循环 参数为94℃ 45 s，50℃ 45 s， 72℃ 60 s，共35个循环，最后延伸5 min。于离心管中加 入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混 匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。
, 百拇医药
表1 半巢式PCR检测TTV DNA的引物序列 引物
序 列
外正链
5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAACAT-3′
外负链
5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT-3′
内正链
5′-GGCAACATGTTATGGATAGACTGG-3′
内负链
同外负链
1.2.3 产物检测 取第2次PCR产物10 μl进行20 g/L琼脂糖凝胶( 含EB 0.5 μg/μl)电泳，紫外线检测仪下观测结果，于356 bp处出现特异性荧光条带为阳性， 否则为阴性，检测过程中采用已知TTV DNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。2 结果
, http://www.100md.com
66例急慢性肝炎血清中共检出10例TTV DNA阳性，总阳性率为15%，其中16例非甲-庚型肝炎中检出4例阳性(25%)，39例乙型肝炎中检出6例阳性(15%)，11例其他合并感染 类型肝炎中未检出阳性病例。
3 讨论
本组资料显示急慢性肝炎血清中TTV DNA的阳性率为15%，说明肝炎患者中存在TT V 感染。另外，结果还显示非甲-庚型肝炎中TTV的感染率(25%)高于乙型肝炎患者中TTV的感染 率(15%)，16例非甲-庚型肝炎中检出的4例TTV DNA阳性病例中1例表现为急性无黄疸性 肝炎，症状较轻微，2例临床上表现为轻度慢性肝炎，1例表现为活动性肝炎后肝硬化。由于 此4例均为甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志均阴性的单独TTV DNA阳性病例，故TTV感染 可能为这些非甲-庚型肝炎的致病原，TTV可以与其他类型肝炎病毒合并感染。
至今普遍认为TTV主要经血传播，国内骆抗先等[4]从肝炎患者的急性期血清和潜 伏期粪便中检出一种与TTV有同源性的基因片段，说明TTV也可通过肠道途径传播。本组结果 中10例TTV DNA阳性病例中，5例无输血和血制品暴露史，5例有外科手术史，其中3例有 手术中输血史，另2例术中输血情况不详；说明除经血传播外，TTV感染尚存在其他感染途 径。
, 百拇医药
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi, et al. A novel DNA virus (TTV) associ ated with elevated transminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown et iology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92
2，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and character ization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998,10:1
3，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid-g uanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156
4，骆抗先，章，廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学及病 毒学的初步研究.中华肝脏病杂志，1998， 6(3)：161
(收稿日期：1999-02-26), 百拇医药