肺癌基因组nm23-H1基因的扩增及异常分析
作者：于景翠 李晓敏 傅松滨
单位：于景翠(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)； 李晓敏(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)； 傅松滨(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：nm23-H1基因；基因突变；肺癌；PCR-SSCP
哈尔滨医科大学学报000103 摘 要：目的 探讨nm23-H1基因突变与人类肺癌发生和转移的关系。方法 常规提取肺癌基因组DNA作为模板，PCR扩增nm23-H1基因，变性PCR产物，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染后分析结果。结果 成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因，并发现1例(转移淋巴结+++)存在23nm-H1基因突变。结论 nm23-H1基因是转移抑制基因，此基因的突变与肺癌转移相关。
分类号：R734.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-1905(2000)01-0006-02
PCR-SSCP analysis of tumor anti-metastatic gene nm23-H1 in human lung carcinomas
YU Jing-cui LI Xiao-min FU Song-bin
(Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To explore the relationship between nm23-H1 gene mutation and metastasis of human lung cancers.Methods Human genomic DNA was extracted from the samples of human lung cancers and the controls.And nm23-H1 gene was amplfied by polymerase chain reaction.PCR products (10μl) were generated by amplification (30 cycles) using standard conditions 5μl～10μl aliquots of PCR mixture were withdrawn and mixed with 25μl of loading buffer (95% formamide,10mmol/L EDTA,0.05% BPB,and 0.05% XC) and heated at 98℃ for 10min.5μl of this mixture was loaded onto a 6% homogenous polyacrylamide gel having N,N-methylenebisacrylamide to acrylamide ratio of 1∶49 in 45 mmol/L tris-borate (pH8.3),1mmol/L EDTA,and 5% glycerol.Electrophoresis was performed at 20V/cm～40V/cm and 15℃ for 5～6 hours.The gels were then silver stained. Results The results of PCR-SSCP analysis explored that one of 11 cases (case 5) showed a abnormal mobility shift of single strand nm23-H1 gene.Conclusion It was suggested that there was mutation of nm23-H1 gene in the genome of this case.Nm23-H1 gene maybe play a role in the metastasis of human lung carcinomas.
, 百拇医药
Key words：nm23-H1 gene;gene mutation;lung cancer;PCR-SSCP▲
肿瘤转移是一个复杂而有序的过程，可能与多个相关基因发生激活与失活密切相关。Steeg等报道了nm23-H1基因表达水平下降与具有高度转移特性的几个啮齿类肿瘤细胞系模型[1]和人乳腺癌相关[2]。应用原位杂交技术已将nm23-H1基因定位于17p11-q11之间，它仅含有一个外显子，长570bp，编码的蛋白质分子量约17KD，在一级结构上与多种属的NDP激酶和果蝇awd蛋白有同源性[3]，但它的功能尚不清楚。Leone等报道了42%肺癌基因组中存在nm23-H1等位基因缺失[4]，而对于肺癌基因组中nm23-H1基因突变的研究还未见报道。本实验应用非同位素PCR-SSCP(nonisotopic polymerase chain reaction-single-stranded conformation polymorphism)对11例肺癌基因组中nm23-H1基因变异进行了分析，以便对nm23-H1基因在肺癌中的突变情况有更深一步的了解。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 肿瘤及正常组织基因组DNA的提取
应用常规方法提取肿瘤标本及正常组织基因组DNA。
1.2 肺癌及对照正常组织基因组DNA中nm23-H1基因PCR扩增
以肺癌及对应正常肺组织基因组DNA为模板，PCR扩增基因组DNA中nm23-H1基因。10μl反应体系含：模板DNA100ng，Taq DNA聚合酶0.5U，4×dNTP各50μmol/L，引物各10pmol/L,MgCl2 1.5mmol/L,Tris-HCl(pH8.3)20μmol/L,KCl 25mmol/L,0.05%Tween 20,牛血清白蛋白100μg/ml。样品95℃变性7min，经30周期循环(94℃ 50s变性，58℃ 50s退火，72℃ 90s延伸)。
, 百拇医药
1.3 肺癌nm23-H1基因PCR-SSCP分析
1.3.1 制备 6%聚丙烯酰胺凝胶 胶联比为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=49∶1，凝胶大小100mm×130mm×0.5mm，每孔宽1cm，胶中含5%甘油；0.5×TBE为电泳缓冲液。
1.3.2 样品变性 5～10μl PCR反应产物中加入25μl加样缓冲液(95%甲酰胺，10mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝)，混匀后98℃加热变性10min，冰水中冷却后上样。
1.3.3 电泳 循环水恒温15℃，恒压20V/cm条件下电泳3h，然后在40V/cm下电泳2h，结束电泳。
1.4 银染分析
1.4.1 固定 凝胶用固定液固定10～20min后，回收固定液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
, 百拇医药
1.4.2 染色 将凝胶浸泡在银染液中振荡，染色8～10min，回收染色液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.3 显影 将凝胶置于显影液中，轻轻晃动，待显出浅棕色条带时，立即终止反应。
1.4.4 分析 应用凝胶自动成像系统进行分析。
2 结果
本研究成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因(图1)。同时SSCP分析发现11例肺癌中1例(转移淋巴结)存在nm23-H1基因突变(图2)。
图1 nm23-H1基因PCR结果
图2 肺癌中nm23-H1基因PCR-SSCP结果
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箭头所示为出现泳动变位的变异单链带位置
3 讨论
很多早期基因转染实验，有关细胞系nm23基因的相关研究，以及乳腺癌中nm23基因mRNA表达的研究均支持nm23基因是一个肿瘤转移抑制基因。具有突破性的是发现了nm23基因编码的蛋白质是一种具有酶活性的NDPK，随之对NDPK与细胞分化的研究证实其通过参与微管聚合及纺锤体形成来调节细胞分裂，并提出此机制的异常是肿瘤细胞的遗传学研究。已证实肿瘤细胞中染色体异常的发展与肿瘤的浸润与转移成正相关。可以确信nm23基因是一种肿瘤转移抑制基因。
nm23基因突变可导致nm23蛋白的改变，一方面可能使微管聚合异常而引起有丝分裂时纺锤体的异常，从而导致癌细胞染色体非整倍性形成，进而促进肿瘤的发展；另一方面可能通过影响细胞骨架而影响细胞运动，从而参与浸润转移过程。NDPK的第二个功能是在信号转导过程中使GDP还原为GTP，从而间接地使G蛋白激活，可以设想nm23以这种方式能调节大量 的G蛋白介导细胞信号传导反应，进而参与肿瘤发展。
, 百拇医药
本研究成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因。同时，发现11例肺癌中1例存在nm23-H1基因突变，其中患者已有淋巴结转移，支持nm23-H1基因是转移抑制基因的观点。此外，扩大样本量，同时研究肺癌原发灶、转移灶nm23-H1基因的变异情况，可进一步确定nm23-H1基因与癌转移的密切关系。■
基金项目：中国博士后基金
作者简介：于景翠(1960-)，女，硕士
参考文献：
[1]Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene asso ciated with low tumor metastatic potential[J].J Natl Cancer Inst,1998,80:200.
, 百拇医药
[2]Hennessy C,Henry JA,May FE,et al.Expression of the antimetastatic gene nm23 in human breast cancer:an association with good prognosis[J].J Natl Cancer Inst,1991,83:281.
[3]Biggs J,Hersperger E,Steeg PS,et al.A drosophila gene that is homologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for a mucleoside diphosphate kinase[J].Cell,1990,63:933.
[4]Leone A,McBride OW,Weston A,et al.Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer[J].Cancer Res,1991,51:2490.
收稿日期：1999-08-28, http://www.100md.com
单位：于景翠(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)； 李晓敏(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)； 傅松滨(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：nm23-H1基因；基因突变；肺癌；PCR-SSCP
哈尔滨医科大学学报000103 摘 要：目的 探讨nm23-H1基因突变与人类肺癌发生和转移的关系。方法 常规提取肺癌基因组DNA作为模板，PCR扩增nm23-H1基因，变性PCR产物，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染后分析结果。结果 成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因，并发现1例(转移淋巴结+++)存在23nm-H1基因突变。结论 nm23-H1基因是转移抑制基因，此基因的突变与肺癌转移相关。
分类号：R734.2 文献标识码：A
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文章编号：1000-1905(2000)01-0006-02
PCR-SSCP analysis of tumor anti-metastatic gene nm23-H1 in human lung carcinomas
YU Jing-cui LI Xiao-min FU Song-bin
(Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To explore the relationship between nm23-H1 gene mutation and metastasis of human lung cancers.Methods Human genomic DNA was extracted from the samples of human lung cancers and the controls.And nm23-H1 gene was amplfied by polymerase chain reaction.PCR products (10μl) were generated by amplification (30 cycles) using standard conditions 5μl～10μl aliquots of PCR mixture were withdrawn and mixed with 25μl of loading buffer (95% formamide,10mmol/L EDTA,0.05% BPB,and 0.05% XC) and heated at 98℃ for 10min.5μl of this mixture was loaded onto a 6% homogenous polyacrylamide gel having N,N-methylenebisacrylamide to acrylamide ratio of 1∶49 in 45 mmol/L tris-borate (pH8.3),1mmol/L EDTA,and 5% glycerol.Electrophoresis was performed at 20V/cm～40V/cm and 15℃ for 5～6 hours.The gels were then silver stained. Results The results of PCR-SSCP analysis explored that one of 11 cases (case 5) showed a abnormal mobility shift of single strand nm23-H1 gene.Conclusion It was suggested that there was mutation of nm23-H1 gene in the genome of this case.Nm23-H1 gene maybe play a role in the metastasis of human lung carcinomas.
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Key words：nm23-H1 gene;gene mutation;lung cancer;PCR-SSCP▲
肿瘤转移是一个复杂而有序的过程，可能与多个相关基因发生激活与失活密切相关。Steeg等报道了nm23-H1基因表达水平下降与具有高度转移特性的几个啮齿类肿瘤细胞系模型[1]和人乳腺癌相关[2]。应用原位杂交技术已将nm23-H1基因定位于17p11-q11之间，它仅含有一个外显子，长570bp，编码的蛋白质分子量约17KD，在一级结构上与多种属的NDP激酶和果蝇awd蛋白有同源性[3]，但它的功能尚不清楚。Leone等报道了42%肺癌基因组中存在nm23-H1等位基因缺失[4]，而对于肺癌基因组中nm23-H1基因突变的研究还未见报道。本实验应用非同位素PCR-SSCP(nonisotopic polymerase chain reaction-single-stranded conformation polymorphism)对11例肺癌基因组中nm23-H1基因变异进行了分析，以便对nm23-H1基因在肺癌中的突变情况有更深一步的了解。
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1 材料与方法
1.1 肿瘤及正常组织基因组DNA的提取
应用常规方法提取肿瘤标本及正常组织基因组DNA。
1.2 肺癌及对照正常组织基因组DNA中nm23-H1基因PCR扩增
以肺癌及对应正常肺组织基因组DNA为模板，PCR扩增基因组DNA中nm23-H1基因。10μl反应体系含：模板DNA100ng，Taq DNA聚合酶0.5U，4×dNTP各50μmol/L，引物各10pmol/L,MgCl2 1.5mmol/L,Tris-HCl(pH8.3)20μmol/L,KCl 25mmol/L,0.05%Tween 20,牛血清白蛋白100μg/ml。样品95℃变性7min，经30周期循环(94℃ 50s变性，58℃ 50s退火，72℃ 90s延伸)。
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1.3 肺癌nm23-H1基因PCR-SSCP分析
1.3.1 制备 6%聚丙烯酰胺凝胶 胶联比为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=49∶1，凝胶大小100mm×130mm×0.5mm，每孔宽1cm，胶中含5%甘油；0.5×TBE为电泳缓冲液。
1.3.2 样品变性 5～10μl PCR反应产物中加入25μl加样缓冲液(95%甲酰胺，10mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝)，混匀后98℃加热变性10min，冰水中冷却后上样。
1.3.3 电泳 循环水恒温15℃，恒压20V/cm条件下电泳3h，然后在40V/cm下电泳2h，结束电泳。
1.4 银染分析
1.4.1 固定 凝胶用固定液固定10～20min后，回收固定液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
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1.4.2 染色 将凝胶浸泡在银染液中振荡，染色8～10min，回收染色液，用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2～3min。
1.4.3 显影 将凝胶置于显影液中，轻轻晃动，待显出浅棕色条带时，立即终止反应。
1.4.4 分析 应用凝胶自动成像系统进行分析。
2 结果
本研究成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因(图1)。同时SSCP分析发现11例肺癌中1例(转移淋巴结)存在nm23-H1基因突变(图2)。
图1 nm23-H1基因PCR结果
图2 肺癌中nm23-H1基因PCR-SSCP结果
, http://www.100md.com
箭头所示为出现泳动变位的变异单链带位置
3 讨论
很多早期基因转染实验，有关细胞系nm23基因的相关研究，以及乳腺癌中nm23基因mRNA表达的研究均支持nm23基因是一个肿瘤转移抑制基因。具有突破性的是发现了nm23基因编码的蛋白质是一种具有酶活性的NDPK，随之对NDPK与细胞分化的研究证实其通过参与微管聚合及纺锤体形成来调节细胞分裂，并提出此机制的异常是肿瘤细胞的遗传学研究。已证实肿瘤细胞中染色体异常的发展与肿瘤的浸润与转移成正相关。可以确信nm23基因是一种肿瘤转移抑制基因。
nm23基因突变可导致nm23蛋白的改变，一方面可能使微管聚合异常而引起有丝分裂时纺锤体的异常，从而导致癌细胞染色体非整倍性形成，进而促进肿瘤的发展；另一方面可能通过影响细胞骨架而影响细胞运动，从而参与浸润转移过程。NDPK的第二个功能是在信号转导过程中使GDP还原为GTP，从而间接地使G蛋白激活，可以设想nm23以这种方式能调节大量 的G蛋白介导细胞信号传导反应，进而参与肿瘤发展。
, 百拇医药
本研究成功地从11例肺癌肿瘤组织及相应正常组织基因组中扩增出nm23-H1基因。同时，发现11例肺癌中1例存在nm23-H1基因突变，其中患者已有淋巴结转移，支持nm23-H1基因是转移抑制基因的观点。此外，扩大样本量，同时研究肺癌原发灶、转移灶nm23-H1基因的变异情况，可进一步确定nm23-H1基因与癌转移的密切关系。■
基金项目：中国博士后基金
作者简介：于景翠(1960-)，女，硕士
参考文献：
[1]Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene asso ciated with low tumor metastatic potential[J].J Natl Cancer Inst,1998,80:200.
, 百拇医药
[2]Hennessy C,Henry JA,May FE,et al.Expression of the antimetastatic gene nm23 in human breast cancer:an association with good prognosis[J].J Natl Cancer Inst,1991,83:281.
[3]Biggs J,Hersperger E,Steeg PS,et al.A drosophila gene that is homologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for a mucleoside diphosphate kinase[J].Cell,1990,63:933.
[4]Leone A,McBride OW,Weston A,et al.Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer[J].Cancer Res,1991,51:2490.
收稿日期：1999-08-28, http://www.100md.com