NAC对大鼠I/R心肌细胞凋亡及bad、bak、bax的影响
作者：刘兴德 陈运贞
单位：刘兴德(贵阳医学院附院心内科 贵阳 550004)；陈运贞(重庆医科大学附院心内科)
关键词：心肌再灌注；心肌缺血 细胞死亡；大鼠
贵阳医学院学报000101 摘 要 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的带萤光的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和免疫组化方法对N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响及其对凋亡促进基因bad、bak和bax蛋白表达的调节进行研究。结果：(1)NAC加IR组TUNEL法阳性心肌细胞核数量及阳性心肌细胞核占总心肌细胞核数的百分比均明显少于IR组(P<0.05)；(2)NAC加IR组表达bad、bak和bax蛋白阳性的心肌细胞数及阳性心肌细胞占心肌细胞总数的百分比均明显低于IR组(P<0.05)。提示：(1)NAC能够减少大鼠I/R心肌细胞凋亡；(2)NAC能够下调I/R心肌细胞凋亡的多个凋亡促进基因的蛋白表达，这可能是NAC抑制I/R心肌细胞凋亡的机制之一。
, http://www.100md.com
中国图书馆分类法分类号 R541.402
The Effect of N-acety-L-cysteine on Cardiac Myocyte
Apoptosis and the Regulation of NAC on bad，bak and bax
During Myocardial Ischemia/Reperfusion Course in Rat
Liu Xingde, Chen Yunzhen
Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College Department of Cindiology，The Affiliated Hospital
, 百拇医药
of Chongqing University of Medical Sciences
This study is, using TUNEL and immunohistochemichal methed, to explore the effect of NAC on cardiac myocyte apoptosis and the regulation of it on bad, bak and bax during myocardial ischemia/reprfusion course in rat. The results showed:(1) The number of positive cardiac myocyte nucleus and the percentage of positive cardiac myocyte nucleus in NAC+IR group decreased significantly (P<0.05) compared with that of IR group respectively;(2)The number of protein bad, bak and bax positive cardiomyocyte and the percentage of protein bad, bak and bax positive cardiomyocyte in NAC+IR group were low (P<0.05) compared with that of IR group respectively. The results suggested that:(1)NAC could decrease cardiomyocyte apoptosis significantly. (2)Down-regulating the protein expression of bad, bak and bax in cardiomyocytes during I/R course might be one of the mechanisms of NAC.
, 百拇医药
Key Words:myocardial reperfusion; cardiac ischemia; cell death; rats
以往认为，心肌I/R损伤不可逆的表现是心肌细胞坏死，并且这种坏死不是由于长期缺血、缺氧引起，而是由氧自由基等造成的[1]。近年来研究证实心肌I/R损伤最终不可逆的表现还包括心肌细胞凋亡，坏死和凋亡是引起I/R心肌细胞死亡的独立变量[2]。晚近，有研究发现氧自由基能够诱导H9c2心肌细胞凋亡[3]，提示抗氧自由基疗法可能减少I/R心肌细胞凋亡。本研究应用大鼠心肌I/R损伤模型，观察氧自由基清除剂NAC对I/R心肌细胞凋亡的影响及凋亡促进基因bad、bak、bax的调节，为临床寻找治疗I/R损伤的疗法提供基础研究资料。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 Wistar大鼠，150～250 g，雌雄不拘。实验分两组(每组大鼠6只)：①IR组：心肌缺血45 min后，再灌注24 h；②NAC+IR组：心肌缺血35 min时，腹腔注射NAC(160mg/kg)10 min，其后心肌再灌注24 h。
, 百拇医药
1.2 主要试剂 NAC(Sigma)，原位细胞凋亡检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，凋亡促进基因bad、bak、bax蛋白抗体(Santa Cruz)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(S-P)免疫组化染色试剂盒(福建迈新)，DAB显色试剂盒(福建迈新)。
1.3 在体大鼠局部心肌I/R模型制作 动物以20%乌拉坦腹腔注射(5 ml/kg)，行气管切开，用呼吸机(DH-30，浙江医科大学医学仪器厂生产)进行机械通气，通气频率60次/min，潮气量4～6 ml。左胸正中旁切口开胸，暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆椎处稍下方穿线结扎冠状动脉左支并于结扎线根部两侧埋置结扎松解线，将结扎和松解线引出胸壁外后关胸。以收紧结扎线后与肢体联接的心电图标准导联的ST-T抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上为模型成功。
1.4 心肌凋亡细胞的检测 实验大鼠达设定的I/R时限时，立即从左心室灌注生理盐水30 ml后，再以4%多聚甲醛60 ml进行活体再灌注，迅速取出心脏置于4%多聚甲醛中24 h，随后进行常规石蜡包埋并作心肌切片(5 μm)。切片经过常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇入水后，应用TUNEL法标记心肌凋亡细胞核中的DNA3’-OH末端，并以TUNEL POD法显示凋亡细胞的存在。
, 百拇医药
1.5 凋亡相关基因bad、bak、bax蛋白表达的检测 常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇入水后，采用S-P免疫组化法检测凋亡相关基因bad、bak、bax蛋白表达。
1.6 设立对照实验 ①阳性对照：以已知的阳性片作阳性对照；②阴性对照：检测凋亡细胞时，仅用带萤光的dUTP标记液而不加末端脱氧核苷酸转移酶溶液孵育组织切片70 min，余步骤同TUNEL法；检测凋亡基因的蛋白表达时，省去加入bad、bak和bax抗体的步骤，其余步骤同S-P免疫组化染色。
1.7 凋亡细胞核及含凋亡基因bad、bak和bax蛋白细胞的计数分析 正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核呈棕黄色；含凋亡相关基因bad、bak和bax蛋白的胞浆为棕黄色。在光学显微镜下，于心肌梗塞周边区计数5个高倍视野(HPF.400×)中的阳性细胞核(胞浆)数，求其均值。
1.8 统计学分析 所有数据均以
±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05有统计学差异，P<0.01具有显著性差异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 NAC对大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响 见表1。
表1 NAC对大鼠心肌缺血45 min
再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响(n=6)
Tab.1 The effect of NAC on cardiomyocyte
apoptosis during 24 h myocardial reperfusion
after 45 min of myocardial ischemia 组别
阳性心肌细
, http://www.100md.com 胞核数/HPF
阳性心肌细胞核数/
心肌细胞总核数(%)
IR
196.83±67.28
56.18±16.47
NAC+IR
103.33±36.83(1)
30.55±12.35(1)
(1)与IR组比较：P<0.05
结果显示，NAC加IR组TUNEL法染色阳性的心肌细胞核数以及阳性心肌细胞占心肌细胞总核数的百分比与IR组的相应时相点比较，明显降低(P<0.05)。表明NAC能够显著减少大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡。
, http://www.100md.com
2.2 NAC对心肌缺血45 min再灌注24 h时心肌细胞凋亡促进基因bad、bak和bax的影响 见表2。
表2 NAC对心肌缺血45 min再灌注24 h时心肌细胞
凋亡促进基因bad、bak、bax的影响(n=6)
Tab.2 The effect of NAC on the expression of protein bad，bak，bax during
24 h myocardial reperfusion after 45 min of myocardial ischemia 检测
指标
阳性心肌细胞数/HPF
, 百拇医药
阳性心肌细胞数/心肌细胞总数(%)
IR
NAC+IR
IR
NAC+IR
bad
182.67±38.24
110.33±38.82(2)
59.67±12.59
32.23±11.31(4)
bak
, http://www.100md.com
271.33±39.93
211.83±42.70(1)
72.52±15.30
53.48±10.77(3)
bax
126.50±22.33
90.67±18.06(1)
42.70±9.66
29.78±6.24(3)
与IR组阳性心肌细胞/HPF比较：(1)P<0.05，(2)P<0.01
, 百拇医药
与IR组阳性心肌细胞/心肌细胞总数比较：(3)P<0.05，(4)P<0.01
结果显示：与IR组比较，NAC加IR组心肌细胞表达凋亡促进基因bad、bak和bax蛋白的阳性心肌细胞数量以及阳性心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比均明显下降(P<0.05)，提示NAC能够明显下调大鼠心肌缺血45 min再灌注24h时心肌细胞中bad、bak和bax的蛋白表达。
3 讨论
NAC是一种小分子量的氧自由基清除剂，易进入细胞，脱乙酰基后成为合成GSH的前体，促进GSH的合成，提高细胞内GSH的含量，增强细胞抗自由基损伤的能力[4]。研究发现，NAC能够降低I/R损伤，可使缺血心肌水肿、细胞超微结构及组织形态学变化减轻；心肌收缩、舒张功能改善；心律失常发生率下降，心肌梗塞范围缩小。本实验显示给心肌缺血35 min时的大鼠腹腔注射NAC160 mg/kg，可使缺血45 min再灌注24 h的心肌细胞凋亡数量明显减低。提示NAC减少心肌I/R损伤的原因部分是由于减少心肌细胞凋亡。
, 百拇医药
关于NAC减低I/R心肌细胞凋亡的机制，目前还不很清楚。推测可能是多方面的[5～7]：①NAC作为巯基供体极易进入细胞内，经去乙酰化使细胞内巯醇增加，这类巯基化合物对防止I/R损伤具有重要作用。②经抑制钙超载而使血管平滑肌松驰、微血管扩张，从而使组织灌注、ATP和氧代谢改善而发挥细胞保护作用。③GSH是细胞内重要的内源性自由基清除体系之一，NAC进入细胞内直接给细胞提供合成GSH的前体物质半胱氨酸，使GSH增加而发挥抗氧化作用。④NAC可抑制ICAM-1的表达，从而使中性粒细胞与内皮细胞的粘附减少，组织损伤减轻。⑤直接对组织细胞产生保护作用：可能是对缺血组织中已激活浸润的中性粒细胞膜产生膜稳定作用，使其破坏性减少，而使细胞释放细胞因子及蛋白水解酶减少。本研究发现，NAC能显著减低缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡促进基因bad、bak和bax的蛋白表达。表明NAC能够下调I/R时心肌细胞中的多个凋亡促进基因，这可能是NAC抑制I/R时心肌细胞凋亡的机制之一。
参考文献
, 百拇医药
1，施长春综述.心肌缺血/再灌注损伤及其监护与防治.心血管病学进展，1997，18：76
2，Kajstura J, Cheng w,Reiss K,et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell death are independent contributing variables of infarct size in rat. Lab Invest, 1996,74:86
3，Turner NA,Xia F, Azhar G, et al. Oxidative stress induces DNA fragmentation and caspase activation via the c-jun NH2-terminal kinase pathway in H9c2 cardiac muscle cells.J Mol Cell Cardiol,1998,30:1789
, 百拇医药
4，Ceconi C,Currelos, Cargnoni A, et al. The role of gluthathione status in theprotection against ischemic and reperfusion damage:effects of N-aectyl-L-cysteine. J Mol Cardiol,1988,20:5
5，Hess DC,Zhao W, Carroll AJ, et al. Increased expression of ICAM-1 during reoxygenation in brain endothelial cells. Stroke,1994,25:1463
6，Nakano H,Boudiema K, Alexandre E, et al. Protective effects of N-acety-L-cysteine on hypothermic ischemia reperfusion injury of rat liver. Hepatology,1995,22:539
7，Knuckey NW,Palm D, Primrano M, et al. N-acety-L-cysteine enhances hippocampal neuronal survival after transient forebrain ischemia in rats. Stroke,1995,26:305
(1999—09—10收稿), 百拇医药
单位：刘兴德(贵阳医学院附院心内科 贵阳 550004)；陈运贞(重庆医科大学附院心内科)
关键词：心肌再灌注；心肌缺血 细胞死亡；大鼠
贵阳医学院学报000101 摘 要 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的带萤光的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和免疫组化方法对N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响及其对凋亡促进基因bad、bak和bax蛋白表达的调节进行研究。结果：(1)NAC加IR组TUNEL法阳性心肌细胞核数量及阳性心肌细胞核占总心肌细胞核数的百分比均明显少于IR组(P<0.05)；(2)NAC加IR组表达bad、bak和bax蛋白阳性的心肌细胞数及阳性心肌细胞占心肌细胞总数的百分比均明显低于IR组(P<0.05)。提示：(1)NAC能够减少大鼠I/R心肌细胞凋亡；(2)NAC能够下调I/R心肌细胞凋亡的多个凋亡促进基因的蛋白表达，这可能是NAC抑制I/R心肌细胞凋亡的机制之一。
, http://www.100md.com
中国图书馆分类法分类号 R541.402
The Effect of N-acety-L-cysteine on Cardiac Myocyte
Apoptosis and the Regulation of NAC on bad，bak and bax
During Myocardial Ischemia/Reperfusion Course in Rat
Liu Xingde, Chen Yunzhen
Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College Department of Cindiology，The Affiliated Hospital
, 百拇医药
of Chongqing University of Medical Sciences
This study is, using TUNEL and immunohistochemichal methed, to explore the effect of NAC on cardiac myocyte apoptosis and the regulation of it on bad, bak and bax during myocardial ischemia/reprfusion course in rat. The results showed:(1) The number of positive cardiac myocyte nucleus and the percentage of positive cardiac myocyte nucleus in NAC+IR group decreased significantly (P<0.05) compared with that of IR group respectively;(2)The number of protein bad, bak and bax positive cardiomyocyte and the percentage of protein bad, bak and bax positive cardiomyocyte in NAC+IR group were low (P<0.05) compared with that of IR group respectively. The results suggested that:(1)NAC could decrease cardiomyocyte apoptosis significantly. (2)Down-regulating the protein expression of bad, bak and bax in cardiomyocytes during I/R course might be one of the mechanisms of NAC.
, 百拇医药
Key Words:myocardial reperfusion; cardiac ischemia; cell death; rats
以往认为，心肌I/R损伤不可逆的表现是心肌细胞坏死，并且这种坏死不是由于长期缺血、缺氧引起，而是由氧自由基等造成的[1]。近年来研究证实心肌I/R损伤最终不可逆的表现还包括心肌细胞凋亡，坏死和凋亡是引起I/R心肌细胞死亡的独立变量[2]。晚近，有研究发现氧自由基能够诱导H9c2心肌细胞凋亡[3]，提示抗氧自由基疗法可能减少I/R心肌细胞凋亡。本研究应用大鼠心肌I/R损伤模型，观察氧自由基清除剂NAC对I/R心肌细胞凋亡的影响及凋亡促进基因bad、bak、bax的调节，为临床寻找治疗I/R损伤的疗法提供基础研究资料。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 Wistar大鼠，150～250 g，雌雄不拘。实验分两组(每组大鼠6只)：①IR组：心肌缺血45 min后，再灌注24 h；②NAC+IR组：心肌缺血35 min时，腹腔注射NAC(160mg/kg)10 min，其后心肌再灌注24 h。
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1.2 主要试剂 NAC(Sigma)，原位细胞凋亡检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，凋亡促进基因bad、bak、bax蛋白抗体(Santa Cruz)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(S-P)免疫组化染色试剂盒(福建迈新)，DAB显色试剂盒(福建迈新)。
1.3 在体大鼠局部心肌I/R模型制作 动物以20%乌拉坦腹腔注射(5 ml/kg)，行气管切开，用呼吸机(DH-30，浙江医科大学医学仪器厂生产)进行机械通气，通气频率60次/min，潮气量4～6 ml。左胸正中旁切口开胸，暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆椎处稍下方穿线结扎冠状动脉左支并于结扎线根部两侧埋置结扎松解线，将结扎和松解线引出胸壁外后关胸。以收紧结扎线后与肢体联接的心电图标准导联的ST-T抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上为模型成功。
1.4 心肌凋亡细胞的检测 实验大鼠达设定的I/R时限时，立即从左心室灌注生理盐水30 ml后，再以4%多聚甲醛60 ml进行活体再灌注，迅速取出心脏置于4%多聚甲醛中24 h，随后进行常规石蜡包埋并作心肌切片(5 μm)。切片经过常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇入水后，应用TUNEL法标记心肌凋亡细胞核中的DNA3’-OH末端，并以TUNEL POD法显示凋亡细胞的存在。
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1.5 凋亡相关基因bad、bak、bax蛋白表达的检测 常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇入水后，采用S-P免疫组化法检测凋亡相关基因bad、bak、bax蛋白表达。
1.6 设立对照实验 ①阳性对照：以已知的阳性片作阳性对照；②阴性对照：检测凋亡细胞时，仅用带萤光的dUTP标记液而不加末端脱氧核苷酸转移酶溶液孵育组织切片70 min，余步骤同TUNEL法；检测凋亡基因的蛋白表达时，省去加入bad、bak和bax抗体的步骤，其余步骤同S-P免疫组化染色。
1.7 凋亡细胞核及含凋亡基因bad、bak和bax蛋白细胞的计数分析 正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核呈棕黄色；含凋亡相关基因bad、bak和bax蛋白的胞浆为棕黄色。在光学显微镜下，于心肌梗塞周边区计数5个高倍视野(HPF.400×)中的阳性细胞核(胞浆)数，求其均值。
1.8 统计学分析 所有数据均以
±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05有统计学差异，P<0.01具有显著性差异。, 百拇医药
2 结果
2.1 NAC对大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响 见表1。
表1 NAC对大鼠心肌缺血45 min
再灌注24 h心肌细胞凋亡的影响(n=6)
Tab.1 The effect of NAC on cardiomyocyte
apoptosis during 24 h myocardial reperfusion
after 45 min of myocardial ischemia 组别
阳性心肌细
, http://www.100md.com 胞核数/HPF
阳性心肌细胞核数/
心肌细胞总核数(%)
IR
196.83±67.28
56.18±16.47
NAC+IR
103.33±36.83(1)
30.55±12.35(1)
(1)与IR组比较：P<0.05
结果显示，NAC加IR组TUNEL法染色阳性的心肌细胞核数以及阳性心肌细胞占心肌细胞总核数的百分比与IR组的相应时相点比较，明显降低(P<0.05)。表明NAC能够显著减少大鼠心肌缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡。
, http://www.100md.com
2.2 NAC对心肌缺血45 min再灌注24 h时心肌细胞凋亡促进基因bad、bak和bax的影响 见表2。
表2 NAC对心肌缺血45 min再灌注24 h时心肌细胞
凋亡促进基因bad、bak、bax的影响(n=6)
Tab.2 The effect of NAC on the expression of protein bad，bak，bax during
24 h myocardial reperfusion after 45 min of myocardial ischemia 检测
指标
阳性心肌细胞数/HPF
, 百拇医药
阳性心肌细胞数/心肌细胞总数(%)
IR
NAC+IR
IR
NAC+IR
bad
182.67±38.24
110.33±38.82(2)
59.67±12.59
32.23±11.31(4)
bak
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271.33±39.93
211.83±42.70(1)
72.52±15.30
53.48±10.77(3)
bax
126.50±22.33
90.67±18.06(1)
42.70±9.66
29.78±6.24(3)
与IR组阳性心肌细胞/HPF比较：(1)P<0.05，(2)P<0.01
, 百拇医药
与IR组阳性心肌细胞/心肌细胞总数比较：(3)P<0.05，(4)P<0.01
结果显示：与IR组比较，NAC加IR组心肌细胞表达凋亡促进基因bad、bak和bax蛋白的阳性心肌细胞数量以及阳性心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比均明显下降(P<0.05)，提示NAC能够明显下调大鼠心肌缺血45 min再灌注24h时心肌细胞中bad、bak和bax的蛋白表达。
3 讨论
NAC是一种小分子量的氧自由基清除剂，易进入细胞，脱乙酰基后成为合成GSH的前体，促进GSH的合成，提高细胞内GSH的含量，增强细胞抗自由基损伤的能力[4]。研究发现，NAC能够降低I/R损伤，可使缺血心肌水肿、细胞超微结构及组织形态学变化减轻；心肌收缩、舒张功能改善；心律失常发生率下降，心肌梗塞范围缩小。本实验显示给心肌缺血35 min时的大鼠腹腔注射NAC160 mg/kg，可使缺血45 min再灌注24 h的心肌细胞凋亡数量明显减低。提示NAC减少心肌I/R损伤的原因部分是由于减少心肌细胞凋亡。
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关于NAC减低I/R心肌细胞凋亡的机制，目前还不很清楚。推测可能是多方面的[5～7]：①NAC作为巯基供体极易进入细胞内，经去乙酰化使细胞内巯醇增加，这类巯基化合物对防止I/R损伤具有重要作用。②经抑制钙超载而使血管平滑肌松驰、微血管扩张，从而使组织灌注、ATP和氧代谢改善而发挥细胞保护作用。③GSH是细胞内重要的内源性自由基清除体系之一，NAC进入细胞内直接给细胞提供合成GSH的前体物质半胱氨酸，使GSH增加而发挥抗氧化作用。④NAC可抑制ICAM-1的表达，从而使中性粒细胞与内皮细胞的粘附减少，组织损伤减轻。⑤直接对组织细胞产生保护作用：可能是对缺血组织中已激活浸润的中性粒细胞膜产生膜稳定作用，使其破坏性减少，而使细胞释放细胞因子及蛋白水解酶减少。本研究发现，NAC能显著减低缺血45 min再灌注24 h心肌细胞凋亡促进基因bad、bak和bax的蛋白表达。表明NAC能够下调I/R时心肌细胞中的多个凋亡促进基因，这可能是NAC抑制I/R时心肌细胞凋亡的机制之一。
参考文献
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1，施长春综述.心肌缺血/再灌注损伤及其监护与防治.心血管病学进展，1997，18：76
2，Kajstura J, Cheng w,Reiss K,et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell death are independent contributing variables of infarct size in rat. Lab Invest, 1996,74:86
3，Turner NA,Xia F, Azhar G, et al. Oxidative stress induces DNA fragmentation and caspase activation via the c-jun NH2-terminal kinase pathway in H9c2 cardiac muscle cells.J Mol Cell Cardiol,1998,30:1789
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4，Ceconi C,Currelos, Cargnoni A, et al. The role of gluthathione status in theprotection against ischemic and reperfusion damage:effects of N-aectyl-L-cysteine. J Mol Cardiol,1988,20:5
5，Hess DC,Zhao W, Carroll AJ, et al. Increased expression of ICAM-1 during reoxygenation in brain endothelial cells. Stroke,1994,25:1463
6，Nakano H,Boudiema K, Alexandre E, et al. Protective effects of N-acety-L-cysteine on hypothermic ischemia reperfusion injury of rat liver. Hepatology,1995,22:539
7，Knuckey NW,Palm D, Primrano M, et al. N-acety-L-cysteine enhances hippocampal neuronal survival after transient forebrain ischemia in rats. Stroke,1995,26:305
(1999—09—10收稿), 百拇医药