乳母增乳冲剂细菌数测定方法的实验比较
作者：汤扬 黄武光
单位：汤扬(贵州省药品检验所 贵阳 550004)；黄武光(贵州省药品检验所 贵阳 550004)
关键词：乳母增乳冲剂；集落计数，微生物；回收率
贵阳医学院学报000157 中国图书馆分类法分类号 R286.0
乳母增乳冲剂是用于产后气血不足，乳络阻滞，分泌低下引起的乳汁缺乏、质差的常用中成药。按部颁“药品卫生标准”的规定必须进行微生物限度检查。在进行细菌数检测时，我们发现该品种经常污染一类生长缓慢的细菌，而且由于该药品含有不溶于水的药物成分，细菌培养时其沉降物的大小、色泽、形态与生长缓慢的细菌菌落极相似，因此生长在培养基内的细菌易与沉降物发生混淆，采用药典常规细菌培养方法(培养48 h)，计数时极易产生漏计或误计，检测结果误差较大，不能客观反映该药物被细菌污染的情况。为此我们采用了沉降法、加氧化还原指示剂(TTC)的方法，并且增加细菌培养时间进行检测，其结果与常规法进行分析比较，同时作了回收实验，以寻求适合该品种的细菌检测方法，提高检验结果的准确性，现报道如下。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 材料及培养基 乳母增乳冲剂(贵阳中医学院药厂生产)9个批号；营养琼脂(中国药品生物制品检定所)、2.3.5-氯化三苯四氮唑(TTC)为分析纯。
1.2 方法 常规法(1)：按《中国药典》95版附录P.82细菌数测定法；沉降法(2)：取1∶10供试液充分混匀，静置5 min，取上清液注皿、稀释，其他操作与上法相同；TTC法[1，2](3)：TTC作为氧化还原指示剂，当细菌体内含有的多种脱氢酶与相应的作用物发生氧化时TTC被还原成红色，故在(1)法进行细菌培养时，于营养琼脂中加入一定量的TTC，使培养出的细菌菌落呈红色，而沉降物不变色。由于TTC具有一定的抑菌作用，实验中加入2种浓度TTC，以进行比较。即在常规营养琼脂中加入0.001%TTC(3)法、0.005%TTC(4)法。以上各法对同一批号样品同时进行检测，培养48 h、72 h、96 h，分别计数结果。
, 百拇医药
2 细菌数测定结果及回收实验
2.1 4种方法及不同培养时间细菌数测定结果8批乳母增乳冲剂测定结果见表1。
表1 各批号4种方法48 h、72 h、96 h细菌数测定结果(个/g)
Tab.1 The results of bacterial number test in different batches at 48, 72,96 h by four methods 方 法
950422
960501
960521
960518
48
, http://www.100md.com
72
96
48
72
96
48
72
96
48
72
96
(1)
760
900
, 百拇医药
960
720
990
1 000
220
300
380
840
1 100
1 200
(2)
1 000
1 200
, 百拇医药
1 200
900
1 100
1 100
120
180
220
700
920
1 000
(3)
1 500
1 600
, 百拇医药
1 700
1 100
1 100
1 100
290
390
430
2 600
3 800
3 900
(4)
1 500
1 600
, 百拇医药
1 700
920
1 100
1 200
280
422
460
2 100
3 800
4 000
方 法
970907
970106
, 百拇医药
950427
970108
48
72
96
48
72
96
48
72
96
48
72
, 百拇医药 96
(1)
340
1 400
1 400
440
1 400
1 500
260
370
420
340
1 200
, 百拇医药
1 300
(2)
600
1 700
3 300
530
1 500
1 700
160
230
240
520
1 600
, 百拇医药
2 000
(3)
2 200
3 300
3 600
2 400
3 600
3 800
340
460
480
1 900
2 700
, 百拇医药
3 100
(4)
2 400
3 600
4 000
320
480
510
2 000
2 800
3 300
2.2 回收实验 从上述样品细菌数测定中培养的细菌，经分离纯化得到3株菌落形态和镜下形态染色不同的细菌即革兰阳性球菌、革兰阳性双球菌、革兰阳性杆菌，按1∶2.5∶2混合制成菌悬液，测得浓度为40 000个/ml。取样品(980803)经121℃20 min高压灭菌烘干。在无菌样品2份中加入上述菌液，使细菌含量分别为4 000个/g、2 500个/g，按(1)～(4)法48 h、72 h测定，回收实验结果与回收率见表2。表2 回收实验结果及回收率
, 百拇医药
Tab.2 The results of recovery and recovory test rate 方 法
浓度(个/g)
(1)
(2)
(3)
(4)
4 000
2 500
4 000
2 500
4 000
2 500
, http://www.100md.com
4 000
2 500
48 h
1 800
320
2 800
500
3 800
1 900
2 600
1 900
回收率
0.29
, http://www.100md.com
0.45
0.95
0.70
72 h
2 400
1 300
3 100
1 800
4 100
2 700
4 500
2 600
回收率
, 百拇医药
0.56
0.75
1.05
1.08
3 测定结果的统计分析
对4种方法及不同时间细菌数测定结果用方差分析，t检验进行统计分析比较，见表3，4，5。
表3 4种方法不同时间细菌数测定结果的方差分析
Tab.3 Analysis of bacterial number test results at the different time by four methods 变异来源
自由度
, 百拇医药
离均差平方和
均方
F值
F0.05
P
总变异
92
1.112 622 E+08
批间变异
3
2.416 621 E+07
6 041 552.0
, 百拇医药
6.59
2.71
<0.05
组间变异
2
8 233 280
416 640.0
4.49
3.10
<0.05
误 差
86
7.886 272 E+07
, 百拇医药
917 008.4
表4 t值法组间(方法间)两两对比(方差不齐用t′值)
Tab.4 The comparison of method T value between two groups 组号
N
均数
标准差
t,t′值
1
24
822.50
431.15
, 百拇医药
(2)
0.91'(1)
4.19'(2)
3.58'(2)
2
24
975.87
701.21
0.91'(1)
(3)
3.36'(2)
, 百拇医药
2.79'(2)
3
24
1 974.63
1 276.94
4.19'(2)
3.36'(2)
(3)
0.37(1)
4
21
, 百拇医药
1 832.83
1 304.00
3.58'(2)
2.79'(2)
0.37(1)
(3)
(1)P>0.05；(2)P<0.01；(3)对照组
表5 t值(方差不齐用t'值)法组间(时间)两两对比
Tab.5 The comparison of time T value between two groups 组 号
, 百拇医药
N
均数
标准差
t,t'值
1(48 h)
31
977.45
755.77
(4)
2.17'(2)
2.64'(2)
2(72 h)
, http://www.100md.com
31
1 510.99
1 128.55
2.17'(2)
(4)
0.54(1)
3(96 h)
31
1 674.20
1 248.54
2.64'(2)
, http://www.100md.com
0.54'(1)
(4)
(1) P>0.05；(2)P<0.05；(3)P<0.01；(4)对照组
4 讨论
4.1 从表1可见各批号样品采用不同方法及不同时间测定的细菌数，结果均有不同程度的差异，其中采用(3)、(4)法(培养72 h、96 h)较(1)、(2)法(培养48 h)检出细菌数明显增多。
4.2 经统计分析，从表3结果看，各方法批间变异，各培养时间组间变异均有显著性差异，各培养时间组间变异均有显著性差异(P<0.05)。表4各方法间两两比较(1)、(2)法较(3)、(4)法均有非常显著性差异(P<0.01)；(3)法较(4)法无显著性差异(P>0.05)。表5各培养时间组间两两比较，48 h较72 h、96 h，均有显著性差异(P<0.05)，72 h较96 h无显著性差异。
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4.3 通过回收实验结果表明，常规法及沉降法的回收率均较差，原因是由于该品种含有的不溶于水并且与细菌菌落相似的药物成分难于区别，干扰细菌计数，且细菌菌落生长缓慢，采用(3)、(4)法，解决了干扰细菌计数的因素，但在培养48 h回收率分别为95%、70%；将培养时间延长至72 h，回收率分别达105%、108%。
综合8批样品的细菌数测定结果并经过统计分析比较及回收实验，可见采用(3)法并延长培养时间至72 h能够较客观地检测出乳母增乳冲剂被细菌污染的数据。而从微生物限度检查各项检验看，细菌数测定延至72 h与霉菌数测定时间同步，未延长检验周期。(3)法细菌菌落呈红色使肉眼能区别药物沉降物与细菌，大大减小人为误差，延长培养时间至72 h，使生长缓慢的菌落生长并肉眼能确认，增加了检验结果的准确性。(3)法较(4)法生长的菌落红色较深而且均匀，(4)法有部分菌落不呈色，而且(3)法检出的菌数的均数略高，即说明采用(3)法，其TTC的用量对细菌的抑制作用可忽略不计。因此在常规法的基础上加0.001%TTC并延长培养时间至72小时对乳母增乳冲剂的细菌数测定是切实可行的。
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典一九九五版(二部)附录.北京：化学工业出版社，1995.82
2，郑均镛，王光宝主编.药品微生物学及检验技术.北京：人民卫生出版社，1989.268
(1999-07-09收稿，1999-11-20修回), 百拇医药
单位：汤扬(贵州省药品检验所 贵阳 550004)；黄武光(贵州省药品检验所 贵阳 550004)
关键词：乳母增乳冲剂；集落计数，微生物；回收率
贵阳医学院学报000157 中国图书馆分类法分类号 R286.0
乳母增乳冲剂是用于产后气血不足，乳络阻滞，分泌低下引起的乳汁缺乏、质差的常用中成药。按部颁“药品卫生标准”的规定必须进行微生物限度检查。在进行细菌数检测时，我们发现该品种经常污染一类生长缓慢的细菌，而且由于该药品含有不溶于水的药物成分，细菌培养时其沉降物的大小、色泽、形态与生长缓慢的细菌菌落极相似，因此生长在培养基内的细菌易与沉降物发生混淆，采用药典常规细菌培养方法(培养48 h)，计数时极易产生漏计或误计，检测结果误差较大，不能客观反映该药物被细菌污染的情况。为此我们采用了沉降法、加氧化还原指示剂(TTC)的方法，并且增加细菌培养时间进行检测，其结果与常规法进行分析比较，同时作了回收实验，以寻求适合该品种的细菌检测方法，提高检验结果的准确性，现报道如下。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 材料及培养基 乳母增乳冲剂(贵阳中医学院药厂生产)9个批号；营养琼脂(中国药品生物制品检定所)、2.3.5-氯化三苯四氮唑(TTC)为分析纯。
1.2 方法 常规法(1)：按《中国药典》95版附录P.82细菌数测定法；沉降法(2)：取1∶10供试液充分混匀，静置5 min，取上清液注皿、稀释，其他操作与上法相同；TTC法[1，2](3)：TTC作为氧化还原指示剂，当细菌体内含有的多种脱氢酶与相应的作用物发生氧化时TTC被还原成红色，故在(1)法进行细菌培养时，于营养琼脂中加入一定量的TTC，使培养出的细菌菌落呈红色，而沉降物不变色。由于TTC具有一定的抑菌作用，实验中加入2种浓度TTC，以进行比较。即在常规营养琼脂中加入0.001%TTC(3)法、0.005%TTC(4)法。以上各法对同一批号样品同时进行检测，培养48 h、72 h、96 h，分别计数结果。
, 百拇医药
2 细菌数测定结果及回收实验
2.1 4种方法及不同培养时间细菌数测定结果8批乳母增乳冲剂测定结果见表1。
表1 各批号4种方法48 h、72 h、96 h细菌数测定结果(个/g)
Tab.1 The results of bacterial number test in different batches at 48, 72,96 h by four methods 方 法
950422
960501
960521
960518
48
, http://www.100md.com
72
96
48
72
96
48
72
96
48
72
96
(1)
760
900
, 百拇医药
960
720
990
1 000
220
300
380
840
1 100
1 200
(2)
1 000
1 200
, 百拇医药
1 200
900
1 100
1 100
120
180
220
700
920
1 000
(3)
1 500
1 600
, 百拇医药
1 700
1 100
1 100
1 100
290
390
430
2 600
3 800
3 900
(4)
1 500
1 600
, 百拇医药
1 700
920
1 100
1 200
280
422
460
2 100
3 800
4 000
方 法
970907
970106
, 百拇医药
950427
970108
48
72
96
48
72
96
48
72
96
48
72
, 百拇医药 96
(1)
340
1 400
1 400
440
1 400
1 500
260
370
420
340
1 200
, 百拇医药
1 300
(2)
600
1 700
3 300
530
1 500
1 700
160
230
240
520
1 600
, 百拇医药
2 000
(3)
2 200
3 300
3 600
2 400
3 600
3 800
340
460
480
1 900
2 700
, 百拇医药
3 100
(4)
2 400
3 600
4 000
320
480
510
2 000
2 800
3 300
2.2 回收实验 从上述样品细菌数测定中培养的细菌，经分离纯化得到3株菌落形态和镜下形态染色不同的细菌即革兰阳性球菌、革兰阳性双球菌、革兰阳性杆菌，按1∶2.5∶2混合制成菌悬液，测得浓度为40 000个/ml。取样品(980803)经121℃20 min高压灭菌烘干。在无菌样品2份中加入上述菌液，使细菌含量分别为4 000个/g、2 500个/g，按(1)～(4)法48 h、72 h测定，回收实验结果与回收率见表2。表2 回收实验结果及回收率
, 百拇医药
Tab.2 The results of recovery and recovory test rate 方 法
浓度(个/g)
(1)
(2)
(3)
(4)
4 000
2 500
4 000
2 500
4 000
2 500
, http://www.100md.com
4 000
2 500
48 h
1 800
320
2 800
500
3 800
1 900
2 600
1 900
回收率
0.29
, http://www.100md.com
0.45
0.95
0.70
72 h
2 400
1 300
3 100
1 800
4 100
2 700
4 500
2 600
回收率
, 百拇医药
0.56
0.75
1.05
1.08
3 测定结果的统计分析
对4种方法及不同时间细菌数测定结果用方差分析，t检验进行统计分析比较，见表3，4，5。
表3 4种方法不同时间细菌数测定结果的方差分析
Tab.3 Analysis of bacterial number test results at the different time by four methods 变异来源
自由度
, 百拇医药
离均差平方和
均方
F值
F0.05
P
总变异
92
1.112 622 E+08
批间变异
3
2.416 621 E+07
6 041 552.0
, 百拇医药
6.59
2.71
<0.05
组间变异
2
8 233 280
416 640.0
4.49
3.10
<0.05
误 差
86
7.886 272 E+07
, 百拇医药
917 008.4
表4 t值法组间(方法间)两两对比(方差不齐用t′值)
Tab.4 The comparison of method T value between two groups 组号
N
均数
标准差
t,t′值
1
24
822.50
431.15
, 百拇医药
(2)
0.91'(1)
4.19'(2)
3.58'(2)
2
24
975.87
701.21
0.91'(1)
(3)
3.36'(2)
, 百拇医药
2.79'(2)
3
24
1 974.63
1 276.94
4.19'(2)
3.36'(2)
(3)
0.37(1)
4
21
, 百拇医药
1 832.83
1 304.00
3.58'(2)
2.79'(2)
0.37(1)
(3)
(1)P>0.05；(2)P<0.01；(3)对照组
表5 t值(方差不齐用t'值)法组间(时间)两两对比
Tab.5 The comparison of time T value between two groups 组 号
, 百拇医药
N
均数
标准差
t,t'值
1(48 h)
31
977.45
755.77
(4)
2.17'(2)
2.64'(2)
2(72 h)
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31
1 510.99
1 128.55
2.17'(2)
(4)
0.54(1)
3(96 h)
31
1 674.20
1 248.54
2.64'(2)
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0.54'(1)
(4)
(1) P>0.05；(2)P<0.05；(3)P<0.01；(4)对照组
4 讨论
4.1 从表1可见各批号样品采用不同方法及不同时间测定的细菌数，结果均有不同程度的差异，其中采用(3)、(4)法(培养72 h、96 h)较(1)、(2)法(培养48 h)检出细菌数明显增多。
4.2 经统计分析，从表3结果看，各方法批间变异，各培养时间组间变异均有显著性差异，各培养时间组间变异均有显著性差异(P<0.05)。表4各方法间两两比较(1)、(2)法较(3)、(4)法均有非常显著性差异(P<0.01)；(3)法较(4)法无显著性差异(P>0.05)。表5各培养时间组间两两比较，48 h较72 h、96 h，均有显著性差异(P<0.05)，72 h较96 h无显著性差异。
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4.3 通过回收实验结果表明，常规法及沉降法的回收率均较差，原因是由于该品种含有的不溶于水并且与细菌菌落相似的药物成分难于区别，干扰细菌计数，且细菌菌落生长缓慢，采用(3)、(4)法，解决了干扰细菌计数的因素，但在培养48 h回收率分别为95%、70%；将培养时间延长至72 h，回收率分别达105%、108%。
综合8批样品的细菌数测定结果并经过统计分析比较及回收实验，可见采用(3)法并延长培养时间至72 h能够较客观地检测出乳母增乳冲剂被细菌污染的数据。而从微生物限度检查各项检验看，细菌数测定延至72 h与霉菌数测定时间同步，未延长检验周期。(3)法细菌菌落呈红色使肉眼能区别药物沉降物与细菌，大大减小人为误差，延长培养时间至72 h，使生长缓慢的菌落生长并肉眼能确认，增加了检验结果的准确性。(3)法较(4)法生长的菌落红色较深而且均匀，(4)法有部分菌落不呈色，而且(3)法检出的菌数的均数略高，即说明采用(3)法，其TTC的用量对细菌的抑制作用可忽略不计。因此在常规法的基础上加0.001%TTC并延长培养时间至72小时对乳母增乳冲剂的细菌数测定是切实可行的。
参考文献
1，中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典一九九五版(二部)附录.北京：化学工业出版社，1995.82
2，郑均镛，王光宝主编.药品微生物学及检验技术.北京：人民卫生出版社，1989.268
(1999-07-09收稿，1999-11-20修回), 百拇医药