糠秕孢子菌对培养角质形成细胞产生细胞因子的影响及电镜观察
作者：罗东辉 王侠生 何芳德
单位：罗东辉 何芳德(华东医院皮肤科，上海200040)；王侠生 (华山医院皮肤科，上海)
关键词：糠秕孢子菌细胞因子角质形成细胞电镜
临床皮肤科杂志000101
摘要 研究糠秕孢子菌对培养角质形成细胞产生细胞因子的影响及电镜观察。结果发现糠秕孢子菌能刺激角质形成细胞分泌IL-1α的量逐渐增加。与对照组相比均有显著差异。但IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等的分泌量与对照组相比，统计学处理无显著性差异。电镜观察显示，共同培养24h后，角质形成细胞发生变性坏死。
Effect of Pityrosporum orbiculare on the production of cytokines and electron microscope observation of co-cultured keratinocytes
, http://www.100md.com
Luo Donghui Wang Xiasheng He Fangde
(Department of Dermatology, Hua Dong Hospital, Shanghai, 200040)
Abstract The production of cytokines by the keratinocytes co-cultured with P.orbiculare were studied, and the structure of keratinocytes was observed by electron microscope(EM). The results showed that P. orbiculare could stimulate the co-cultured keratinocytes to produce IL-1α which increased significantly, but the production of IL-2,IL-4,IL-10,TNF-α ,IFN-γ showed no significant changes. Degenerative necrosis of the co-cultured keratinocytes was observed 12h after co-culture with P.orbiculare uuder EM.
, 百拇医药
Key words Pityrosporum orbicular Cytokines Keratinocytes Electron Microscope
糠秕孢子菌为嗜脂性酵母菌，属人体皮肤正常的菌群，亦是一种条件致病真菌。已有的研究已证实，它可以引起花斑癣、败血症、浆膜炎、骨关节炎，并与头皮屑、脂溢性皮炎、异位性皮炎、银屑病有密切关系[1]。近来的研究[2]还表明，糠秕孢子菌可使培养角质形成细胞分泌IL-1α、bFGF的量显著性地增加。但总的讲，从不同侧面研究糠秕孢子菌对角质形成细胞影响的报道还很少。本文将从细胞因子、电镜等方面进行研究，力图更多地了解糠秕孢子菌的致病机制。
1材料和方法
1.1菌种
一株圆形糠秕孢子菌标准菌株(ATCC44344)购自美国，其余菌株由华山医院皮肤科真菌室提供。先将糠秕孢子菌接种在富含脂质的特种琼脂培养基上，37℃孵育1周，备用。
, 百拇医药
1.2含菌细胞培养液的制备
在超净台用不含二性霉素B的角质形成细胞培养液配制成含菌悬液，用滴管反复吹打孢子均匀分散于培养液中，调节菌液浓度为1×106/mL，备用。
1.3角质形成细胞培养及处理
1.3.1培养液：参考文献[3]的方法采用DMEM∶Ham'sF-12(1∶1)培养液，内含15%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，EGF10ng/mL(Sigma)，霍乱毒素50ng/mL(Sigma)，胰岛素5μg/mL，氢化可的松0.5μg/mL，青霉素100u/mL，两性霉素B0.5μg/mL。
1.3.2角质形成细胞的分离：参考文献[4]的方法，从外科手术取得的皮肤用0.25%胰酶溶液消化，收集细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清，加入细胞培养液使成悬液，血球计数板计数细胞数为1.5×106/mL，台盼蓝染色测细胞活力，活细胞一般在90%以上。
, 百拇医药
1.3.3角质形成细胞的培养：将上述细胞悬液以1.5×106/皿接种于一次性使用的培养皿(60mm;Corning)中，加入3mLDMEM∶Ham'sF-12(1∶1)培养液。置培养皿于含5%CO2、37℃的培养箱中培养。每周换液2次，当角质形成细胞单层平铺满培养皿时进行传代培养。
图1与糠秕孢子菌共同培养48h的角质形成细胞形
态改变，胞膜破损，细胞核消失，胞质内细胞器
结构不清(×5000)
表1糠秕孢子菌(P.orb)对角质形成细胞(KC)分泌细胞因子的影响(pg/mL) 细胞因子
6h
, 百拇医药
12h
24h
48h
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
IL1α
17.7±2.3
, 百拇医药
41.7±4.0
32.8±1.1
50.7±7.8
73.3±6.8
167.3±4
114.1±8
184.7±9
IL2
69.3±4.9
71.3±4.2
74±6
68±3.1
, 百拇医药
71.1±5.6
69.3±3.0
71.5±5.2
65.9±16
IL4
19.5±2.2
23±3.3
18±2
20.8±3.8
23.5±2.6
25.8±3.7
23±1.7
, 百拇医药
23±1
IL10
29.8±4.4
29.8±3.7
38.6±5.0
28.5±3.3
29.8±7.2
23.9±7.4
35.4±4.6
36.9±6.7
TNFα
24.1±13.2
, http://www.100md.com
22±7.5
18.3±8.6
26.2±12
18±8.3
27.7±11
18.6±8.7
27.2±12
IFNγ
15.8±1.3
12±3.5
12.5±2.5
12.5±2.5
, http://www.100md.com
15.8±1.3
20.5±6.5
15.1±1.1
15.8±1.3
1.3.4传代培养角质形成细胞的处理：当传代培养角质形成细胞单层平铺满培养皿时，每皿加入前面制备的含菌细胞培养液2mL，对照皿仍加2mL正常的细胞培养液，置培养皿于含5%CO2、37℃的培养箱中分别培养6h、12h、24h、48h。收集培养上清液1500r/min离心5min，分装备测。培养细胞由上海医科大学电镜室按常规操作取材。
1.4细胞因子检测
培养上清液中细胞因子含量的测定分别用商售ELISAKIT，其中IL-1α和TNF-αELISAKIT购自Sigma公司，IL-10ELISAKIT购自BoehringerMannehein,IL-2，IL-4，IFN-γELISAKIT购自深圳晶美生物工程公司。步骤、方法及测定值换算依产品说明书进行(作复孔取均值)。
, 百拇医药
1.5制片及电镜观察
培养细胞由上海医科大学电镜室按常规操作取材及制片，JEM-1200EX透射电镜观察、拍片。
2结果
培养的角质形成细胞能自泌IL-1α，随培养时间的延长，培养上清液中IL-1α的量逐渐增加。从培养6h的17.7pg/mL增加到培养48h的114.1pg/mL。糠秕孢子菌能刺激培养的角质形成细胞分泌IL-1α的量增加，其分泌量随培养时间的延长而逐渐增加，从培养6h的41.7pg/mL增加到培养48h的184.7pg/mL。经统计学处理，在不同的培养时间内，加入糠秕孢子菌共同培养刺激角质形成细胞产生IL-1α的增加量与对照组相比均有显著差异(6hP<0.01,12hP<0.05,24hP<0.01,48hP<0.01)。培养的角质形成细胞能自泌少量IL2、IL4、IL10、TNFα、IFNγ等。随培养时间的延长，培养上清液中IL2、IL4、IL10、TNFα、IFNγ等的含量有小幅波动。与糠秕孢子菌共同培养的角质形成细胞的分泌量与对照组相比，统计学处理无显著性差异，P均>0.05，详见表1。
, 百拇医药
电镜观察发现：正常培养的角质形成细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形。胞质内细胞器丰富，可见高尔基复合体、线粒体、核糖体和糖原颗粒。相邻细胞间有桥粒连接，桥粒间有1～4μm不等的间隙，间隙内有微绒毛样胞质突起。与糠秕孢子菌共同培养6～12h的角质形成细胞，细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整。核糖体、线粒体数目增多，多量的脂滴。共同培养24h的角质形成细胞，胞膜结构完整者，细胞形态仍呈梭形，细胞核呈椭圆形，核膜完整，常染色质丰富，两桥粒间缝隙增大，细胞间非连接面微绒毛样胞质突起数目增多。亦可见细胞结构不完整的角质形成细胞，其细胞形态改变，折曲，细胞核消失，胞质内细胞器结构不清。共同培养48h的角质形成细胞，细胞膜缺损，细胞核消失，胞质内细胞器破坏、消失，为变性的角质形成细胞(见图1)。
3讨论
角质形成细胞在一定的条件下，能产生多种细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF、IFN等。IL-1能刺激角质形成细胞产生IL-2、IL-6、IL-8。TNF能刺激角质形成细胞产生IL-8。IL-10能抑制角质形成细胞产生各种细胞因子。可见角质形成细胞产生的细胞因子形成相互影响的网络。这些细胞因子在皮肤病的病理生理过程中起着十分重要的作用。关于糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养研究角质形成细胞产生细胞因子的报道较少。Walters等[5]发现糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养后，角质形成细胞释放的IL-1α变动在0～136pg/mL，72h达到峰值,但活性检测发现释放的IL-1α无活性。冉玉平[2]报道糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培育24h后，角质形成细胞释放的IL-1α与对照相比有显著增高(P<0.01)。我们的结果显示，糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培育后，角质形成细胞释放的IL1α从共同培育6h的41.7pg/mL上升到48h的184.7pg/mL，与对照组相比有显著的统计学差异。但除此之外，其它细胞因子的分泌量的改变无统计学差异。考虑到有活性的IL1的增加常常伴随IL2、IL4、IL6、IL10、TNF、IFN等的增加，所以本实验仅有IL1α增加的结果支持Walters等人的发现，即IL1α是无活性的。本实验说明糠秕孢子菌致病的机制并不是通过刺激角质形成细胞产生一系列具有生物活性的细胞因子来介导。
, 百拇医药
与糠秕孢子菌共同培养6～12h的角质形成细胞，其细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整，胞质内细胞器丰富，核糖体、线粒体、脂滴数目增多，表明细胞功能活跃。与糠秕孢子菌共同培养24～48h的角质形成细胞，部分细胞的细胞膜缺损，细胞核消失，胞质内细胞器破坏、消失。部分角质形成细胞其胞膜结构及形态完整，细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整。这表明随糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养时间的延长，糠秕孢子菌可引起角质形成细胞的破坏、死亡。
P＆G公司资助课题
参考文献
1，Faergemann J. Lipophilic yeasts in skin disease. Semin Dermatol, 1985, 4(2):173
2，冉玉平，周光平，坪井良治，等.糠秕孢子菌与培养角朊细胞的相互作用.中华皮肤科杂志，1997，30(5)：294～298
, http://www.100md.com
3，Kiesewetter F, Arai A, Sche11 H. Sex hormones and antiandrogens influence in vitro growth of derma1 papilla cells and outer root sheath keratinocytes of himan hair follicles. J Invest Dermatol, 1993, 101(supple 1):98～105u
4，郑志忠，侯兰娣.人表皮角朊细胞的分离、培养和鉴定.中华皮肤科杂志，1990，23(3)：156～158
5，Walters CE, Ingham E, Eady EA, et al. In vitro modulation of keratinocytes-derived interleukin-1α (IL-1α ) and peripheral blood mononuclear cell-derived IL-1β release in response to cutaneous commensal microorganisims. Infect Immun, 1995, 63(4):1223～1228, 百拇医药
单位：罗东辉 何芳德(华东医院皮肤科，上海200040)；王侠生 (华山医院皮肤科，上海)
关键词：糠秕孢子菌细胞因子角质形成细胞电镜
临床皮肤科杂志000101
摘要 研究糠秕孢子菌对培养角质形成细胞产生细胞因子的影响及电镜观察。结果发现糠秕孢子菌能刺激角质形成细胞分泌IL-1α的量逐渐增加。与对照组相比均有显著差异。但IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等的分泌量与对照组相比，统计学处理无显著性差异。电镜观察显示，共同培养24h后，角质形成细胞发生变性坏死。
Effect of Pityrosporum orbiculare on the production of cytokines and electron microscope observation of co-cultured keratinocytes
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Luo Donghui Wang Xiasheng He Fangde
(Department of Dermatology, Hua Dong Hospital, Shanghai, 200040)
Abstract The production of cytokines by the keratinocytes co-cultured with P.orbiculare were studied, and the structure of keratinocytes was observed by electron microscope(EM). The results showed that P. orbiculare could stimulate the co-cultured keratinocytes to produce IL-1α which increased significantly, but the production of IL-2,IL-4,IL-10,TNF-α ,IFN-γ showed no significant changes. Degenerative necrosis of the co-cultured keratinocytes was observed 12h after co-culture with P.orbiculare uuder EM.
, 百拇医药
Key words Pityrosporum orbicular Cytokines Keratinocytes Electron Microscope
糠秕孢子菌为嗜脂性酵母菌，属人体皮肤正常的菌群，亦是一种条件致病真菌。已有的研究已证实，它可以引起花斑癣、败血症、浆膜炎、骨关节炎，并与头皮屑、脂溢性皮炎、异位性皮炎、银屑病有密切关系[1]。近来的研究[2]还表明，糠秕孢子菌可使培养角质形成细胞分泌IL-1α、bFGF的量显著性地增加。但总的讲，从不同侧面研究糠秕孢子菌对角质形成细胞影响的报道还很少。本文将从细胞因子、电镜等方面进行研究，力图更多地了解糠秕孢子菌的致病机制。
1材料和方法
1.1菌种
一株圆形糠秕孢子菌标准菌株(ATCC44344)购自美国，其余菌株由华山医院皮肤科真菌室提供。先将糠秕孢子菌接种在富含脂质的特种琼脂培养基上，37℃孵育1周，备用。
, 百拇医药
1.2含菌细胞培养液的制备
在超净台用不含二性霉素B的角质形成细胞培养液配制成含菌悬液，用滴管反复吹打孢子均匀分散于培养液中，调节菌液浓度为1×106/mL，备用。
1.3角质形成细胞培养及处理
1.3.1培养液：参考文献[3]的方法采用DMEM∶Ham'sF-12(1∶1)培养液，内含15%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，EGF10ng/mL(Sigma)，霍乱毒素50ng/mL(Sigma)，胰岛素5μg/mL，氢化可的松0.5μg/mL，青霉素100u/mL，两性霉素B0.5μg/mL。
1.3.2角质形成细胞的分离：参考文献[4]的方法，从外科手术取得的皮肤用0.25%胰酶溶液消化，收集细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清，加入细胞培养液使成悬液，血球计数板计数细胞数为1.5×106/mL，台盼蓝染色测细胞活力，活细胞一般在90%以上。
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1.3.3角质形成细胞的培养：将上述细胞悬液以1.5×106/皿接种于一次性使用的培养皿(60mm;Corning)中，加入3mLDMEM∶Ham'sF-12(1∶1)培养液。置培养皿于含5%CO2、37℃的培养箱中培养。每周换液2次，当角质形成细胞单层平铺满培养皿时进行传代培养。
图1与糠秕孢子菌共同培养48h的角质形成细胞形
态改变，胞膜破损，细胞核消失，胞质内细胞器
结构不清(×5000)
表1糠秕孢子菌(P.orb)对角质形成细胞(KC)分泌细胞因子的影响(pg/mL) 细胞因子
6h
, 百拇医药
12h
24h
48h
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
KC组
P.orb+KC组
IL1α
17.7±2.3
, 百拇医药
41.7±4.0
32.8±1.1
50.7±7.8
73.3±6.8
167.3±4
114.1±8
184.7±9
IL2
69.3±4.9
71.3±4.2
74±6
68±3.1
, 百拇医药
71.1±5.6
69.3±3.0
71.5±5.2
65.9±16
IL4
19.5±2.2
23±3.3
18±2
20.8±3.8
23.5±2.6
25.8±3.7
23±1.7
, 百拇医药
23±1
IL10
29.8±4.4
29.8±3.7
38.6±5.0
28.5±3.3
29.8±7.2
23.9±7.4
35.4±4.6
36.9±6.7
TNFα
24.1±13.2
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22±7.5
18.3±8.6
26.2±12
18±8.3
27.7±11
18.6±8.7
27.2±12
IFNγ
15.8±1.3
12±3.5
12.5±2.5
12.5±2.5
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15.8±1.3
20.5±6.5
15.1±1.1
15.8±1.3
1.3.4传代培养角质形成细胞的处理：当传代培养角质形成细胞单层平铺满培养皿时，每皿加入前面制备的含菌细胞培养液2mL，对照皿仍加2mL正常的细胞培养液，置培养皿于含5%CO2、37℃的培养箱中分别培养6h、12h、24h、48h。收集培养上清液1500r/min离心5min，分装备测。培养细胞由上海医科大学电镜室按常规操作取材。
1.4细胞因子检测
培养上清液中细胞因子含量的测定分别用商售ELISAKIT，其中IL-1α和TNF-αELISAKIT购自Sigma公司，IL-10ELISAKIT购自BoehringerMannehein,IL-2，IL-4，IFN-γELISAKIT购自深圳晶美生物工程公司。步骤、方法及测定值换算依产品说明书进行(作复孔取均值)。
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1.5制片及电镜观察
培养细胞由上海医科大学电镜室按常规操作取材及制片，JEM-1200EX透射电镜观察、拍片。
2结果
培养的角质形成细胞能自泌IL-1α，随培养时间的延长，培养上清液中IL-1α的量逐渐增加。从培养6h的17.7pg/mL增加到培养48h的114.1pg/mL。糠秕孢子菌能刺激培养的角质形成细胞分泌IL-1α的量增加，其分泌量随培养时间的延长而逐渐增加，从培养6h的41.7pg/mL增加到培养48h的184.7pg/mL。经统计学处理，在不同的培养时间内，加入糠秕孢子菌共同培养刺激角质形成细胞产生IL-1α的增加量与对照组相比均有显著差异(6hP<0.01,12hP<0.05,24hP<0.01,48hP<0.01)。培养的角质形成细胞能自泌少量IL2、IL4、IL10、TNFα、IFNγ等。随培养时间的延长，培养上清液中IL2、IL4、IL10、TNFα、IFNγ等的含量有小幅波动。与糠秕孢子菌共同培养的角质形成细胞的分泌量与对照组相比，统计学处理无显著性差异，P均>0.05，详见表1。
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电镜观察发现：正常培养的角质形成细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形。胞质内细胞器丰富，可见高尔基复合体、线粒体、核糖体和糖原颗粒。相邻细胞间有桥粒连接，桥粒间有1～4μm不等的间隙，间隙内有微绒毛样胞质突起。与糠秕孢子菌共同培养6～12h的角质形成细胞，细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整。核糖体、线粒体数目增多，多量的脂滴。共同培养24h的角质形成细胞，胞膜结构完整者，细胞形态仍呈梭形，细胞核呈椭圆形，核膜完整，常染色质丰富，两桥粒间缝隙增大，细胞间非连接面微绒毛样胞质突起数目增多。亦可见细胞结构不完整的角质形成细胞，其细胞形态改变，折曲，细胞核消失，胞质内细胞器结构不清。共同培养48h的角质形成细胞，细胞膜缺损，细胞核消失，胞质内细胞器破坏、消失，为变性的角质形成细胞(见图1)。
3讨论
角质形成细胞在一定的条件下，能产生多种细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF、IFN等。IL-1能刺激角质形成细胞产生IL-2、IL-6、IL-8。TNF能刺激角质形成细胞产生IL-8。IL-10能抑制角质形成细胞产生各种细胞因子。可见角质形成细胞产生的细胞因子形成相互影响的网络。这些细胞因子在皮肤病的病理生理过程中起着十分重要的作用。关于糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养研究角质形成细胞产生细胞因子的报道较少。Walters等[5]发现糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养后，角质形成细胞释放的IL-1α变动在0～136pg/mL，72h达到峰值,但活性检测发现释放的IL-1α无活性。冉玉平[2]报道糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培育24h后，角质形成细胞释放的IL-1α与对照相比有显著增高(P<0.01)。我们的结果显示，糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培育后，角质形成细胞释放的IL1α从共同培育6h的41.7pg/mL上升到48h的184.7pg/mL，与对照组相比有显著的统计学差异。但除此之外，其它细胞因子的分泌量的改变无统计学差异。考虑到有活性的IL1的增加常常伴随IL2、IL4、IL6、IL10、TNF、IFN等的增加，所以本实验仅有IL1α增加的结果支持Walters等人的发现，即IL1α是无活性的。本实验说明糠秕孢子菌致病的机制并不是通过刺激角质形成细胞产生一系列具有生物活性的细胞因子来介导。
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与糠秕孢子菌共同培养6～12h的角质形成细胞，其细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整，胞质内细胞器丰富，核糖体、线粒体、脂滴数目增多，表明细胞功能活跃。与糠秕孢子菌共同培养24～48h的角质形成细胞，部分细胞的细胞膜缺损，细胞核消失，胞质内细胞器破坏、消失。部分角质形成细胞其胞膜结构及形态完整，细胞形态仍呈梭形，细胞膜完整。这表明随糠秕孢子菌与角质形成细胞共同培养时间的延长，糠秕孢子菌可引起角质形成细胞的破坏、死亡。
P＆G公司资助课题
参考文献
1，Faergemann J. Lipophilic yeasts in skin disease. Semin Dermatol, 1985, 4(2):173
2，冉玉平，周光平，坪井良治，等.糠秕孢子菌与培养角朊细胞的相互作用.中华皮肤科杂志，1997，30(5)：294～298
, http://www.100md.com
3，Kiesewetter F, Arai A, Sche11 H. Sex hormones and antiandrogens influence in vitro growth of derma1 papilla cells and outer root sheath keratinocytes of himan hair follicles. J Invest Dermatol, 1993, 101(supple 1):98～105u
4，郑志忠，侯兰娣.人表皮角朊细胞的分离、培养和鉴定.中华皮肤科杂志，1990，23(3)：156～158
5，Walters CE, Ingham E, Eady EA, et al. In vitro modulation of keratinocytes-derived interleukin-1α (IL-1α ) and peripheral blood mononuclear cell-derived IL-1β release in response to cutaneous commensal microorganisims. Infect Immun, 1995, 63(4):1223～1228, 百拇医药