聚合酶链反应与常规方法检测牙龈卟啉单胞菌的比较研究
作者：金笑一 杨圣辉 王申五 刘红 张春梅
单位：金笑一(首都医科大学附属北京口腔医院综合科 100050 北京)；杨圣辉 张春梅(口腔医学研究所)；王申五(北京医科大学附属人民医院中心实验室)；刘红(北京医科大学附属人民医院中心实验室)
关键词：聚合酶链反应；卟啉类；基因
中华口腔医学杂志000112 摘 要：目的 使用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)检测龈下菌斑的牙龈卟啉菌，并与常规的培养法和间接免疫荧光法相比较。方法 设计纤毛亚单位蛋白基因内的一对引物，用PCR对92个龈下菌斑标本进行扩增，与其他两种方法的检出率进行比较。结果 相同的菌斑标本，PCR的检出率为94.6%，培养法为48.9% ，间接免疫荧光法为68.5% ，前者明显高于后两者(P<0.001)。结论 对牙周病致病菌的检测，PCR较培养法和间接免疫荧光法具有较高的敏感性。本项研究建立了一种比较适合临床应用的牙周菌斑PCR检测方法。
, 百拇医药
A comparison of polymerase chain reaction with other two widely used methods in detection of Porphyromonas gingivalis
JIN Xiaoyi
(Beijing Stomatology Hospital , Capital University of Medical Science, Beijing 100050, China)
YANG Shenghui
WANG Shenwu
Abstract：Objective To compare the efficiency of polymerase chain reaction (PCR) with cultural method and indirect immunofluorescence(IF) in detection of Porphyromonas gingivalis (P.g) in oral plaque samples. Methods 92 subgingival plaque samples were collected from patients of three kinds of periodontal disease. A program using PCR to detect Fimbrilin gene (Fim A) was designed to detect P.g. The efficiency of this PCR method was compared with cultural method and IF. Results The positive-rate of PCR was 94.6%, while that of cultural method and IF was only 48.9% and 68.5% respectively. The difference was significant in statistical analysis (P<0.001). Conclusion PCR is more sensitive than culture method and IF in detecting pathogens of periodontal diseases. The study provides a simplified and efficient method for oral clinical use.
, 百拇医药
Key words：Polymerase chain reaction (PCR)；Porphyrins；Gene▲
牙周疾病是由细菌感染引起的，牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)是其重要的致病菌之一。P.g可产生多种毒力因子，包括纤毛素(fimbrilin)和各种蛋白酶(protease)[1]，但是其分离鉴定比较困难，临床常用方法的检测结果尚不能令人满意。近年来，聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)为在基因水平上检测P.g提供了有力的手段。本项研究运用PCR技术，检测了临床的92个样本并与培养法(culture method )和间接免疫荧光法(indirect immnofluorescence, IF)相比较，旨在探求一种适合于临床应用的、快速敏感的牙周菌斑检测方法。
材料和方法
, 百拇医药 1.引物合成 :根据Watanabe和Frommel等[2]报道的方法，由北京医科大学附属人民医院中心实验室合成。引物1为P1-5'ATAATGGAGAACAGC-AGGAA3'，引物2为P2-5'TCTTGCCAACCAGTTCC-ATTGC3',扩增片段为131 bp。
2.试剂: TaqDNA聚合酶,5×扩增缓冲液, 4×dNTP(脱氧核苷酸), PBR322DNA /Bst NI,P.g菌体抗体,荧光抗体, CDC非选择培养基(氯化血红素5 g/L,维生素K 10 g/L,脱纤维羊血5%),0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。
3.病例选择:88个龈下菌斑标本取自北京口腔医院35名门诊成人牙周炎(adult periodontitis,AP)和龈炎(gingivitis)患者,年龄20～60岁。4个龈下菌斑标本来自门诊 1例青少年牙周炎(juvenile periodontitis,JP)患者。本组病例均无全身系统性疾病,半年内无抗生素治疗史。研究对象的一般情况见表1。
, 百拇医药
表1 研究对象一般情况 组别
例数
样本数
PD(mm)
AL(mm)
龈炎
15
46
2.85±0.02
0
成人牙周炎
20
42
, 百拇医药
6.75±1.85
5.25±2.80
青少年牙周炎
1
4
6.50±1.50
4.05±1.25
注：PD：探诊深度，AL：附着丧失
4.标本收集：对每名受试者选 1～3个牙周袋或龈袋为取标本点。用标准小环法收集标本，参照杨圣辉等[3]的检测方法。将取出的标本稀释至1 ml,再等分为3份,分别以免疫荧光法、培养法和PCR扩增进行检测。
5. 培养法:标本用震荡器混匀30 s,以生理盐水10倍系列稀释,选择稀释度为10-3的浓度接种于CDC固体培养基上,常规厌氧培养5 d后,检查细菌生长情况。初步做生化实验鉴定,不分解糖的为卟啉菌属(porphyromonasa)或普氏菌属(prevotella)，再做直接血凝试验及间接免疫反应。
, 百拇医药
6.间接免疫荧光法:采用杨圣辉等[3]报道的检测方法。
7.PCR法:
(1)细菌DNA的提取:将混悬于装有0.1 ml生理盐水的 Ep管中的临床样本 ,在旋涡混合器上震荡混匀 ,弃上清 ,加入25 μl细菌裂解液(50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 μg/L明胶, 0.45% NP-40 , 0.45 % Tween 20)及蛋白酶K 10 μg/L,混匀,置于55 ℃水浴2 h,100 ℃10 min,0 ℃10 min,10 000 rpm离心 10 min ,保留上清,待用。
(2)PCR扩增 :总反应体积为25 μl,5×Buffer缓冲液5 μl,2.5 mmol/L dNTP(含4种脱氧核苷酸)2.0 μl, TaqDNA聚合酶1 μl(0.5 U/μl)、引物(P1, P2)各12.5 pmol/μl , 细菌DNA提取液1 μl,加三蒸水至25 μl,混匀后加10 μl石蜡油。反应按预变性 94℃4 min,变性 94℃ 45 s,退火 56℃45 s,延伸至72℃ 60 s, 经30个循环后,延伸72 ℃ 5 min。
, 百拇医药
(3)检测扩增产物 :取扩增产物10 μl,2.0%琼脂糖(0.5 mgEB/L)凝胶电泳,以PBR322DNA/BSTNT为参照物,紫外灯下观察[4]。如扩增产物与对照组产生相同的特异性扩增带,则表明为PCR阳性标本，否则为阴性标本，见图1。设置对照组:①ATCC33277为模板作阳性对照; ②加除ATCC33277模板以外的PCR系统所有其他成分;③加ATCC33277模板,但不加引物; ④分别以92样本DNA为模板。
图1 PCR扩增P.g特异性片段临床标本凝胶电泳图谱
结果
1.培养法、间接免疫荧光法及PCR阳性检出率结果：见表2。可看出PCR检出率最高。
表2 培养法、IF法及PCR法P.g阳性检出率(%) 组别
, 百拇医药
培养法
IF法
PCR法
龈炎
30.4
52.2
91.3
牙周炎
71.4
92.8
97.6
青少年牙周炎
25.0
, 百拇医药
50.0
100.0
2.PCR与培养法及间接免疫荧光法检测临床阳性标本的比较： PCR与培养法的比较结果见表3。经卡方检验， PCR的阳性检出率明显高于培养法者,P<0.001。相关性检验表明两种方法呈显著相关,P<0.05。
表3 PCR和培养法分析阳性结果比较 培养法
PCR阳性
PCR阴性
合计
阳性
45
0
, http://www.100md.com
45
阴性
42
5
47
合计
87
5
92
注：P<0.001,二者间差异有高度显著性
PCR与间接免疫荧光法的比较结果见表4。经卡方检验, PCR法显著高于荧光法，P<0.001。相关性检验表明，两种方法呈显著相关, P<0.01。
, 百拇医药
表4 PCR和IF分析阳性结果比较 IF法
PCR阳性
PCR阴性
合计
阳性
63
0
63
阴性
24
5
29
合计
, 百拇医药
87
5
92
注：P<0.001，二者间差异有高度显著性
讨论
牙周疾病是由细菌感染引起的，牙龈卟啉菌被认为是成年人主要致病菌[5]。由于该菌属于难以培养的厌养菌，其分离鉴定程序繁琐，不利于进一步研究。近年来，随着分子生物学的发展，基因检测技术在临床得以应用。国内在这方面的研究工作尚不多见。作者在以往的研究中，曾对分离牙龈卟啉菌株及异种标准菌株进行PCR扩增，发现分离菌株均获得131bp片段，其敏感性能达到最少检测到1 Pg细菌DNA，即相当于68个细菌；而异种菌(包括相关性较强的Pi、Cg等)中不能扩出产物。说明应用该方法检测出的细菌与其他结构类似的细菌无交叉反应。
, 百拇医药
用PCR直接检测牙周样本已有报道[6],但缺乏与常规方法的比较研究，其操作程序也有待于进一步简化。本项实验根据已报道的P.g fimA基因内的一对引物，设计PCR快速简便的检测方法。粗制的核酸可供直接检测，采用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，对扩增产物在紫外灯下观察其特征性DNA区带，这些都可使操作步骤简便化。从样本的获得到细菌的鉴定，只需5.5 h。
本项实验的PCR检测结果经与培养法和间接免疫荧光法相比，证实前者有更高的检出率。特别是对于后两种方法检测不到的阴性标本，PCR也可检测到。
综上所述，本项研究所提出的PCR检测方法具有快速、简便、高效的特点，可望成为口腔科临床致病菌检测的新方法，值得进一步深入研究。
参考文献：
[1]Mayrand D, Holt SC. Biology of a saccharolytic black-pigmented bacteroides species. Microbiol Rev, 1988, 52:134-152.
, http://www.100md.com
[2]Watanabe K, Frommel TO. Detection of porphyromonas gingivalis in oral plaque samples by use of the polymerase chain reaction. J Dent Res, 1993, 72:1040-1044.
[3]杨圣辉，张春梅，任蕾，等.用间接免疫荧光快速检测牙周袋 内牙龈类杆菌. 中华微生态学杂志, 1990, 2: 31-33.
[4]金笑一，杨圣辉, 张春梅，等. 多聚酶链反应检测牙龈卟啉单胞菌. 北京口腔医学, 1997, 5: 58-60.
[5]Slots J, Listgarten MA. Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius and Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal disease. J Clin Periodontol, 1988, 15: 85-93.
[6]Ashimoto A, Chen C, Bakker I, et al. Porphyromonas chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesion. Oral Microbiol Immunol, 1996, 11:266-273.
收稿日期：1999-05-24, 百拇医药
单位：金笑一(首都医科大学附属北京口腔医院综合科 100050 北京)；杨圣辉 张春梅(口腔医学研究所)；王申五(北京医科大学附属人民医院中心实验室)；刘红(北京医科大学附属人民医院中心实验室)
关键词：聚合酶链反应；卟啉类；基因
中华口腔医学杂志000112 摘 要：目的 使用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)检测龈下菌斑的牙龈卟啉菌，并与常规的培养法和间接免疫荧光法相比较。方法 设计纤毛亚单位蛋白基因内的一对引物，用PCR对92个龈下菌斑标本进行扩增，与其他两种方法的检出率进行比较。结果 相同的菌斑标本，PCR的检出率为94.6%，培养法为48.9% ，间接免疫荧光法为68.5% ，前者明显高于后两者(P<0.001)。结论 对牙周病致病菌的检测，PCR较培养法和间接免疫荧光法具有较高的敏感性。本项研究建立了一种比较适合临床应用的牙周菌斑PCR检测方法。
, 百拇医药
A comparison of polymerase chain reaction with other two widely used methods in detection of Porphyromonas gingivalis
JIN Xiaoyi
(Beijing Stomatology Hospital , Capital University of Medical Science, Beijing 100050, China)
YANG Shenghui
WANG Shenwu
Abstract：Objective To compare the efficiency of polymerase chain reaction (PCR) with cultural method and indirect immunofluorescence(IF) in detection of Porphyromonas gingivalis (P.g) in oral plaque samples. Methods 92 subgingival plaque samples were collected from patients of three kinds of periodontal disease. A program using PCR to detect Fimbrilin gene (Fim A) was designed to detect P.g. The efficiency of this PCR method was compared with cultural method and IF. Results The positive-rate of PCR was 94.6%, while that of cultural method and IF was only 48.9% and 68.5% respectively. The difference was significant in statistical analysis (P<0.001). Conclusion PCR is more sensitive than culture method and IF in detecting pathogens of periodontal diseases. The study provides a simplified and efficient method for oral clinical use.
, 百拇医药
Key words：Polymerase chain reaction (PCR)；Porphyrins；Gene▲
牙周疾病是由细菌感染引起的，牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)是其重要的致病菌之一。P.g可产生多种毒力因子，包括纤毛素(fimbrilin)和各种蛋白酶(protease)[1]，但是其分离鉴定比较困难，临床常用方法的检测结果尚不能令人满意。近年来，聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)为在基因水平上检测P.g提供了有力的手段。本项研究运用PCR技术，检测了临床的92个样本并与培养法(culture method )和间接免疫荧光法(indirect immnofluorescence, IF)相比较，旨在探求一种适合于临床应用的、快速敏感的牙周菌斑检测方法。
材料和方法
, 百拇医药 1.引物合成 :根据Watanabe和Frommel等[2]报道的方法，由北京医科大学附属人民医院中心实验室合成。引物1为P1-5'ATAATGGAGAACAGC-AGGAA3'，引物2为P2-5'TCTTGCCAACCAGTTCC-ATTGC3',扩增片段为131 bp。
2.试剂: TaqDNA聚合酶,5×扩增缓冲液, 4×dNTP(脱氧核苷酸), PBR322DNA /Bst NI,P.g菌体抗体,荧光抗体, CDC非选择培养基(氯化血红素5 g/L,维生素K 10 g/L,脱纤维羊血5%),0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。
3.病例选择:88个龈下菌斑标本取自北京口腔医院35名门诊成人牙周炎(adult periodontitis,AP)和龈炎(gingivitis)患者,年龄20～60岁。4个龈下菌斑标本来自门诊 1例青少年牙周炎(juvenile periodontitis,JP)患者。本组病例均无全身系统性疾病,半年内无抗生素治疗史。研究对象的一般情况见表1。
, 百拇医药
表1 研究对象一般情况 组别
例数
样本数
PD(mm)
AL(mm)
龈炎
15
46
2.85±0.02
0
成人牙周炎
20
42
, 百拇医药
6.75±1.85
5.25±2.80
青少年牙周炎
1
4
6.50±1.50
4.05±1.25
注：PD：探诊深度，AL：附着丧失
4.标本收集：对每名受试者选 1～3个牙周袋或龈袋为取标本点。用标准小环法收集标本，参照杨圣辉等[3]的检测方法。将取出的标本稀释至1 ml,再等分为3份,分别以免疫荧光法、培养法和PCR扩增进行检测。
5. 培养法:标本用震荡器混匀30 s,以生理盐水10倍系列稀释,选择稀释度为10-3的浓度接种于CDC固体培养基上,常规厌氧培养5 d后,检查细菌生长情况。初步做生化实验鉴定,不分解糖的为卟啉菌属(porphyromonasa)或普氏菌属(prevotella)，再做直接血凝试验及间接免疫反应。
, 百拇医药
6.间接免疫荧光法:采用杨圣辉等[3]报道的检测方法。
7.PCR法:
(1)细菌DNA的提取:将混悬于装有0.1 ml生理盐水的 Ep管中的临床样本 ,在旋涡混合器上震荡混匀 ,弃上清 ,加入25 μl细菌裂解液(50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 μg/L明胶, 0.45% NP-40 , 0.45 % Tween 20)及蛋白酶K 10 μg/L,混匀,置于55 ℃水浴2 h,100 ℃10 min,0 ℃10 min,10 000 rpm离心 10 min ,保留上清,待用。
(2)PCR扩增 :总反应体积为25 μl,5×Buffer缓冲液5 μl,2.5 mmol/L dNTP(含4种脱氧核苷酸)2.0 μl, TaqDNA聚合酶1 μl(0.5 U/μl)、引物(P1, P2)各12.5 pmol/μl , 细菌DNA提取液1 μl,加三蒸水至25 μl,混匀后加10 μl石蜡油。反应按预变性 94℃4 min,变性 94℃ 45 s,退火 56℃45 s,延伸至72℃ 60 s, 经30个循环后,延伸72 ℃ 5 min。
, 百拇医药
(3)检测扩增产物 :取扩增产物10 μl,2.0%琼脂糖(0.5 mgEB/L)凝胶电泳,以PBR322DNA/BSTNT为参照物,紫外灯下观察[4]。如扩增产物与对照组产生相同的特异性扩增带,则表明为PCR阳性标本，否则为阴性标本，见图1。设置对照组:①ATCC33277为模板作阳性对照; ②加除ATCC33277模板以外的PCR系统所有其他成分;③加ATCC33277模板,但不加引物; ④分别以92样本DNA为模板。
图1 PCR扩增P.g特异性片段临床标本凝胶电泳图谱
结果
1.培养法、间接免疫荧光法及PCR阳性检出率结果：见表2。可看出PCR检出率最高。
表2 培养法、IF法及PCR法P.g阳性检出率(%) 组别
, 百拇医药
培养法
IF法
PCR法
龈炎
30.4
52.2
91.3
牙周炎
71.4
92.8
97.6
青少年牙周炎
25.0
, 百拇医药
50.0
100.0
2.PCR与培养法及间接免疫荧光法检测临床阳性标本的比较： PCR与培养法的比较结果见表3。经卡方检验， PCR的阳性检出率明显高于培养法者,P<0.001。相关性检验表明两种方法呈显著相关,P<0.05。
表3 PCR和培养法分析阳性结果比较 培养法
PCR阳性
PCR阴性
合计
阳性
45
0
, http://www.100md.com
45
阴性
42
5
47
合计
87
5
92
注：P<0.001,二者间差异有高度显著性
PCR与间接免疫荧光法的比较结果见表4。经卡方检验, PCR法显著高于荧光法，P<0.001。相关性检验表明，两种方法呈显著相关, P<0.01。
, 百拇医药
表4 PCR和IF分析阳性结果比较 IF法
PCR阳性
PCR阴性
合计
阳性
63
0
63
阴性
24
5
29
合计
, 百拇医药
87
5
92
注：P<0.001，二者间差异有高度显著性
讨论
牙周疾病是由细菌感染引起的，牙龈卟啉菌被认为是成年人主要致病菌[5]。由于该菌属于难以培养的厌养菌，其分离鉴定程序繁琐，不利于进一步研究。近年来，随着分子生物学的发展，基因检测技术在临床得以应用。国内在这方面的研究工作尚不多见。作者在以往的研究中，曾对分离牙龈卟啉菌株及异种标准菌株进行PCR扩增，发现分离菌株均获得131bp片段，其敏感性能达到最少检测到1 Pg细菌DNA，即相当于68个细菌；而异种菌(包括相关性较强的Pi、Cg等)中不能扩出产物。说明应用该方法检测出的细菌与其他结构类似的细菌无交叉反应。
, 百拇医药
用PCR直接检测牙周样本已有报道[6],但缺乏与常规方法的比较研究，其操作程序也有待于进一步简化。本项实验根据已报道的P.g fimA基因内的一对引物，设计PCR快速简便的检测方法。粗制的核酸可供直接检测，采用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，对扩增产物在紫外灯下观察其特征性DNA区带，这些都可使操作步骤简便化。从样本的获得到细菌的鉴定，只需5.5 h。
本项实验的PCR检测结果经与培养法和间接免疫荧光法相比，证实前者有更高的检出率。特别是对于后两种方法检测不到的阴性标本，PCR也可检测到。
综上所述，本项研究所提出的PCR检测方法具有快速、简便、高效的特点，可望成为口腔科临床致病菌检测的新方法，值得进一步深入研究。
参考文献：
[1]Mayrand D, Holt SC. Biology of a saccharolytic black-pigmented bacteroides species. Microbiol Rev, 1988, 52:134-152.
, http://www.100md.com
[2]Watanabe K, Frommel TO. Detection of porphyromonas gingivalis in oral plaque samples by use of the polymerase chain reaction. J Dent Res, 1993, 72:1040-1044.
[3]杨圣辉，张春梅，任蕾，等.用间接免疫荧光快速检测牙周袋 内牙龈类杆菌. 中华微生态学杂志, 1990, 2: 31-33.
[4]金笑一，杨圣辉, 张春梅，等. 多聚酶链反应检测牙龈卟啉单胞菌. 北京口腔医学, 1997, 5: 58-60.
[5]Slots J, Listgarten MA. Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius and Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal disease. J Clin Periodontol, 1988, 15: 85-93.
[6]Ashimoto A, Chen C, Bakker I, et al. Porphyromonas chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesion. Oral Microbiol Immunol, 1996, 11:266-273.
收稿日期：1999-05-24, 百拇医药