山莨菪碱对急性肺损伤肿瘤坏死因子-α的影响及意义
作者：尹文 梁继河 蔡春 张松涛 虎晓岷 张金山
单位：尹文(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；蔡春(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；张松涛(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；梁继河(胸心外科) 虎晓岷(胸心外科)；张金山(第四军医大学基础部组织胚胎教研室)
关键词：山莨菪碱；急性肺损伤；肿瘤坏死因子；免疫组织化学；原位定量
中国急救医学000103 摘 要：目的 研究创伤性急性肺损伤(ALI)家兔体内肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化，探讨山莨菪碱(654-2)对创伤性ALI及多器官功能障碍(MODS)的防治作用及可能机制。方法 采用家兔创伤性ALI模型，实验动物随机分为正常对照组(8只)、创伤模型组(10只)、654-2治疗组(10只)。用ELISA方法检测不同时相点血浆中TNF-α的含量。用免疫组织化学法结合原位定量分析检测肺、肝、心、肾组织TNF-α分布及相对含量，并进行各组织的病理学光镜检查。结果 654-2降低创伤性ALI家兔血浆中TNF-α含量，抑制肺、肝、心、肾组织TNF-α的蛋白表达，减轻内脏组织的损伤程度。结论 654-2能减少组织及血浆TNF-α的生成及含量，在一定程度上阻碍ALI的发生和发展，降低TNF-α等细胞因子介导的多器官组织损害。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 282.71；R 563 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)01-0008-02
Effect and significance of Anisodamine on tumor necrosis factor-α in acute lung injury
YIN Wen
(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
LIANG Ji-he
(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
, 百拇医药
CAI Chun(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
Abstract：Objective In order to explore the preventine and therapeutic effects of anisodamine(654-2) on acute lung injury (ALI) and multiple organic dysfunction (MODS) and their mechanism, the changes of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the rabbits with ALI were observed.Methods Rabbit models of traumatic ALI were randomly divided into the normal control group(group M, n=10) and 654-2 treatment group(group T, n=10). Plasma TNF-α contents at various time point were analyzed by ELISA method. By using immunohistochemistry combined with in situ quantitative analysis, the distrbution and relative contents of TNF-α in lung, liver, heart and kidney were determined. And the pathological changes were examined with light microseope in various tissues.Results 654-2 could decrease the contents of TNF-α of plasme in the traumatic ALI rabbits, inhibit the protein production of TNF-α in lung, liver, heart and kidney tissues, and relieve the injury severity of visceral tissues.Conclusion 654-2 can inhibit the produetion of TNF-α in tissues and plasma retard the development and progression of ALI, and decrease the injury severity of multiple organ and tissues mediated by the cytokines.
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Key words：Anisodamine; Acute lung injury; Tumor necrosis factor-α; Immunohistochemistry; In situ quantitative determination▲
急性肺损伤的病理机制错综复杂，国内外研究趋向性认为是由被激活的多核形白细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞、肺毛细血管内皮细胞、单核-巨噬细胞和血小板等效应细胞释放TNF-α等细胞因子和炎性介质，引起的全身炎症反应综合征(SIRS)。因此，目前研究急性肺损伤(ALI)或多器官功能障碍(MODS)发病机制的焦点集中在探讨全身炎症反应失控的机制上。随着对ALI发病机制认识的深入，有“广谱炎性介质”之称的TNF-α已成为治疗的靶心。本实验采用复制创伤性ALI模型[1]，观察654-2治疗前后血浆中TNF-α含量和内脏组织病理损害程度以及肺、肝、心、肾TNF-α蛋白表达的相对含量及分布的变化，探讨654-2对ALI及MODS的保护作用及可行性机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组 健康大耳白兔(本校动物中心提供)28只，6个月龄，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，3%戊巴比妥钠25 mg/kg静脉麻醉，随机分为3组：①创伤模型(M)组，n=10只，兔仰卧固定于撞击台上，以冲击速度5.7 m/S，力75.8 N/cm2，冲撞能量约204 J使胸壁压缩40%，约3 cm，兔非撞击侧胸壁被硬板支撑，兔体只可挤压，不能移位。随后静脉注射大肠杆菌内毒素50 μg/kg。②654-2治疗(T)组，n=10只，按M组制成创伤性ALI后，即刻给予654-2
2 mg/kg静脉注射。0.5 h后以1 mg。kg-1。h-1静脉滴注维持。③正常对照(C)组，无特殊处理。
1.2 观察指标及方法 ①各组动物于撞击后0.5、1、1.5、2、4、6、12 h经颈动脉采血，用酶联免疫方法(ELISA试剂盒由我校免疫教研室提供)测定TNF-α含量。②病理学检查：各组动物于创伤后12 h处死取肺、肝、心、肾经HE染色常规光镜检查。③按免疫组织化学ABC法进行各组动物肺、肝、心、肾的免疫组织化学染色(ABC药盒购自武汉博士德生物制品公司、TNF-α单克隆抗体由我校免疫教研室提供)，观察TNF-α在各组织中的蛋白表达、定位与分布。④原位定量分析(TNF-α免疫反应物质的原位定量)：用Q-500图像分析仪(美国Leica公司)对M及T组动物的内脏组织TNF-α免疫反应阳性物质的相对含量进行定量，2组动物的每只家兔的肺、肝、心、肾随机各测20个细胞，每组动物的肺、肝、心、肾分别各测200个细胞，用计算机打出每个细胞TNF-α含量的平均值及标准差。
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1.3 数据统计学处理 各参数以
±s表示，用我校统计教研室统计软件在微机上行单因素分析，t检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
2.1 血浆TNF-α含量变化(见表1)。
表1 撞击后血浆TNF-α含量的变化(±s，ng/ml) 级别
撞击后时间(h)
0.5
1
1.5
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2
4
6
12
M
0.56±0.20
0.86±0.28**＃
1.27±0.28**＃
0.85±0.30**＃
0.38±0.20*
0.26±0.11
, 百拇医药
0.21±0.11
T
0.31±0.12
0.38±0.10*
0.33±0.10*
0.34±0.12*
0.31±0.11
0.28±0.14
0.28±0.10
C
0.17±0.10
, 百拇医药
0.15±0.11
0.15±0.11
0.16±0.12
0.18±0.11
0.20±0.10
0.17±0.01
与C组比较*P<0.05，**P<0.01 与T组比较＃P<0.05
2.2 病理学检查 模型组肺体积增大变实，表面有大小不等散在红色斑片，切面呈红色实样变，似牛肝样。光镜下肺泡壁破坏严重，肺间质及肺泡腔严重水肿，渗出，出血，大量粒细胞浸润，肺泡腔内透明膜形成。肝汇管区有大量白细胞浸润，部分肝细胞呈气球样变及嗜酸性变，伴灶性坏死。肾小管上皮细胞肿胀，腔内见蛋白管型，肾小球白细胞浸润。心肌间质毛细血管扩张，血管周围有少量白细胞浸润，可见透明血栓形成。治疗组双肺脏胸膜点片状出血呈花斑状，双肺重量体积轻度增大，未见明显饱满，肿胀。光镜下肺泡壁多数完整，腔内少许出血，渗出及细胞浸润，间质白细胞浸润明显。肝汇管区有少量白细胞浸润，少部分肝细胞呈气球样变及嗜酸性变，未见坏死灶，肾小管上皮细胞肿胀，未见管型。心肌间质毛细血管少量扩张，血管周围白细胞浸润明显减少。C组肺、肝、心、肾为正常病理形态。
, 百拇医药
2.3 免疫组织化学结果 TNF-α免疫反应阳性产物呈标黄色，背底不着色，反差明显，易于识别。阳性反应产物分布在胞质内，胞核阴性。正常肺肝心肾组织及细胞无阳性染色。创伤组肺、肝组织细胞呈强阳性免疫反应，心肾组织细胞呈阳性免疫反应，多分布在内脏组织的Mψ、枯否细胞、PMN和VEC中。治疗组肺肝心肾的阳性产物较模型组明显减少(P<0.05)。
2.4 创伤组和654-2治疗组肺、肝、心、肾TNF-α阳性反应物质的相对含量(见表2)。
表2 不同组织TNF-α阳性反应产物的相对含量 组 织
相对含量/细胞(±s)
模型组
654-2治疗组
, 百拇医药
肺
0.1343±0.0089*
0.08923±0.0035
肝
0.1024±0.0087*
0.0718±0.0062
心
0.0968±0.0118*
0.0687±0.0020
肾
0.0823±0.0046*
, 百拇医药
0.0601±0.0049
*P<0.05
3 讨论
近年来研究表明，ALI和MODS患者或动物模型均存在多器官的微血管内皮细胞损害及炎性介质释放增加，提示在ALI或MODS的发生发展过程中，存在着共同发病机制—失控性全身炎症反应。TNF-α参与机体炎症反应和免疫过程[2，3]，被认为是具有代表性的炎性介质，是介导机体炎症反应的关键因子，在ALI和MODS中起着重要的作用。
本实验结果显示：家兔胸部受到撞击后，外周血TNF-α含量显著升高，肺、肝、心、肾均发生不同程度的病理损害。可见ALI可启动全身其它组织器官的损伤，说明TNF-α等炎性介质参与了创伤后内脏功能损害的发生、发展过程。与Svoboda等[4]报道基本一致。因此，对ALI的理解不能局限于肺脏本身的疾病，而应认识到SIRS是ALI和MODS的共同发病基础，ALI是MODS的重要组成部分。可见，救治ALI或MODS的趋势应该是阻断机体自身的炎症反应，以避免其过度激活反应引起的介质瀑布样连锁反应而诱发组织细胞的失控损伤[5]。多器官功能障碍综合征时TNF-α的升高程度和疾病死亡率成正相关。设法阻止TNF-α的效应作用，已成为研究的热点。
, 百拇医药
654-2是从植物中提取的一种生物碱类药物，近些年来，在防治ALI及MODS方面，显示出良好的作用[5，6]。先前的研究发现：654-2能减少TNF-α mRNA在肺、肝、心、肾组织的表达，从而起到对ALI的防治作用，但作用机理不明[6]。本实验654-2治疗组动物肺、肝、心、肾组织病理损害较创伤组有不同程度的减轻。免疫组织化学及原位定量结果显示：治疗组各内脏TNF-α蛋白表达及组织中含量、分布也显著减少(P<0.05)。说明654-2能有效的降低TNF-α的水平，减轻创伤性ALI所致的多脏器损伤。但654-2在ALI治疗作用中的机理尚需进一步探讨。本研究为创伤性ALI及ARDS的发病机制、早期诊断和治疗提供了实验依据。■
基金来源：国家自然科学基金资助(No.39770736)
参考文献：
[1]胡建才，刘维永，梁继河，等.肿瘤坏死因子和白介素-6在肺挫伤急性呼吸窘迫综合征中的变化及意义[J].解放军医学杂志，1997，22：287-288.
, http://www.100md.com
[2]Welbourn CRB, Young Y. Endotoxin, septic shock and acute lung injury：neutrophils macrophages and inflammary meadiators[J]. Br J Surg, 1992, 79:998-1003.
[3]Soichiro I,Akimass N,Kishimo W,et al.Anti-neturophil antibody attenuates the severity of acute lung injury in rats with experimental acute pancreatitis[J].Arch Surg,1995,130:93-98.
[4]Svoboda P,Kantorova I,Ochmann J.Dynamics of interleukin 1,2 and 6 and tumor necrosis factor alpha in multiple trauma patients[J].J Trauma,1994,36:336.
[5]岳茂兴，李成林，李新元，等.大剂量山莨菪碱及地塞米松对兔MODS时TNF-α及LPO作用研究[J].急诊医学，1999，8：14-16.
[6]梁继河，朱云喜，李琦，等.山莨菪碱对创伤性急性肺损伤防治作用的实验研究[J].中华创伤杂志，1998，14：284-287.
收稿日期：1999-09-25
修回日期：1999-12-17, 百拇医药
单位：尹文(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；蔡春(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；张松涛(第四军医大学西京医院急诊科，西安 710032)；梁继河(胸心外科) 虎晓岷(胸心外科)；张金山(第四军医大学基础部组织胚胎教研室)
关键词：山莨菪碱；急性肺损伤；肿瘤坏死因子；免疫组织化学；原位定量
中国急救医学000103 摘 要：目的 研究创伤性急性肺损伤(ALI)家兔体内肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化，探讨山莨菪碱(654-2)对创伤性ALI及多器官功能障碍(MODS)的防治作用及可能机制。方法 采用家兔创伤性ALI模型，实验动物随机分为正常对照组(8只)、创伤模型组(10只)、654-2治疗组(10只)。用ELISA方法检测不同时相点血浆中TNF-α的含量。用免疫组织化学法结合原位定量分析检测肺、肝、心、肾组织TNF-α分布及相对含量，并进行各组织的病理学光镜检查。结果 654-2降低创伤性ALI家兔血浆中TNF-α含量，抑制肺、肝、心、肾组织TNF-α的蛋白表达，减轻内脏组织的损伤程度。结论 654-2能减少组织及血浆TNF-α的生成及含量，在一定程度上阻碍ALI的发生和发展，降低TNF-α等细胞因子介导的多器官组织损害。
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中图分类号：R 282.71；R 563 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)01-0008-02
Effect and significance of Anisodamine on tumor necrosis factor-α in acute lung injury
YIN Wen
(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
LIANG Ji-he
(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
, 百拇医药
CAI Chun(Department of Emergency，Xijing Hospital Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
Abstract：Objective In order to explore the preventine and therapeutic effects of anisodamine(654-2) on acute lung injury (ALI) and multiple organic dysfunction (MODS) and their mechanism, the changes of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the rabbits with ALI were observed.Methods Rabbit models of traumatic ALI were randomly divided into the normal control group(group M, n=10) and 654-2 treatment group(group T, n=10). Plasma TNF-α contents at various time point were analyzed by ELISA method. By using immunohistochemistry combined with in situ quantitative analysis, the distrbution and relative contents of TNF-α in lung, liver, heart and kidney were determined. And the pathological changes were examined with light microseope in various tissues.Results 654-2 could decrease the contents of TNF-α of plasme in the traumatic ALI rabbits, inhibit the protein production of TNF-α in lung, liver, heart and kidney tissues, and relieve the injury severity of visceral tissues.Conclusion 654-2 can inhibit the produetion of TNF-α in tissues and plasma retard the development and progression of ALI, and decrease the injury severity of multiple organ and tissues mediated by the cytokines.
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Key words：Anisodamine; Acute lung injury; Tumor necrosis factor-α; Immunohistochemistry; In situ quantitative determination▲
急性肺损伤的病理机制错综复杂，国内外研究趋向性认为是由被激活的多核形白细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞、肺毛细血管内皮细胞、单核-巨噬细胞和血小板等效应细胞释放TNF-α等细胞因子和炎性介质，引起的全身炎症反应综合征(SIRS)。因此，目前研究急性肺损伤(ALI)或多器官功能障碍(MODS)发病机制的焦点集中在探讨全身炎症反应失控的机制上。随着对ALI发病机制认识的深入，有“广谱炎性介质”之称的TNF-α已成为治疗的靶心。本实验采用复制创伤性ALI模型[1]，观察654-2治疗前后血浆中TNF-α含量和内脏组织病理损害程度以及肺、肝、心、肾TNF-α蛋白表达的相对含量及分布的变化，探讨654-2对ALI及MODS的保护作用及可行性机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型与分组 健康大耳白兔(本校动物中心提供)28只，6个月龄，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，3%戊巴比妥钠25 mg/kg静脉麻醉，随机分为3组：①创伤模型(M)组，n=10只，兔仰卧固定于撞击台上，以冲击速度5.7 m/S，力75.8 N/cm2，冲撞能量约204 J使胸壁压缩40%，约3 cm，兔非撞击侧胸壁被硬板支撑，兔体只可挤压，不能移位。随后静脉注射大肠杆菌内毒素50 μg/kg。②654-2治疗(T)组，n=10只，按M组制成创伤性ALI后，即刻给予654-2
2 mg/kg静脉注射。0.5 h后以1 mg。kg-1。h-1静脉滴注维持。③正常对照(C)组，无特殊处理。
1.2 观察指标及方法 ①各组动物于撞击后0.5、1、1.5、2、4、6、12 h经颈动脉采血，用酶联免疫方法(ELISA试剂盒由我校免疫教研室提供)测定TNF-α含量。②病理学检查：各组动物于创伤后12 h处死取肺、肝、心、肾经HE染色常规光镜检查。③按免疫组织化学ABC法进行各组动物肺、肝、心、肾的免疫组织化学染色(ABC药盒购自武汉博士德生物制品公司、TNF-α单克隆抗体由我校免疫教研室提供)，观察TNF-α在各组织中的蛋白表达、定位与分布。④原位定量分析(TNF-α免疫反应物质的原位定量)：用Q-500图像分析仪(美国Leica公司)对M及T组动物的内脏组织TNF-α免疫反应阳性物质的相对含量进行定量，2组动物的每只家兔的肺、肝、心、肾随机各测20个细胞，每组动物的肺、肝、心、肾分别各测200个细胞，用计算机打出每个细胞TNF-α含量的平均值及标准差。
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1.3 数据统计学处理 各参数以
±s表示，用我校统计教研室统计软件在微机上行单因素分析，t检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。2 结果
2.1 血浆TNF-α含量变化(见表1)。
表1 撞击后血浆TNF-α含量的变化(
±s，ng/ml) 级别撞击后时间(h)
0.5
1
1.5
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2
4
6
12
M
0.56±0.20
0.86±0.28**＃
1.27±0.28**＃
0.85±0.30**＃
0.38±0.20*
0.26±0.11
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0.21±0.11
T
0.31±0.12
0.38±0.10*
0.33±0.10*
0.34±0.12*
0.31±0.11
0.28±0.14
0.28±0.10
C
0.17±0.10
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0.15±0.11
0.15±0.11
0.16±0.12
0.18±0.11
0.20±0.10
0.17±0.01
与C组比较*P<0.05，**P<0.01 与T组比较＃P<0.05
2.2 病理学检查 模型组肺体积增大变实，表面有大小不等散在红色斑片，切面呈红色实样变，似牛肝样。光镜下肺泡壁破坏严重，肺间质及肺泡腔严重水肿，渗出，出血，大量粒细胞浸润，肺泡腔内透明膜形成。肝汇管区有大量白细胞浸润，部分肝细胞呈气球样变及嗜酸性变，伴灶性坏死。肾小管上皮细胞肿胀，腔内见蛋白管型，肾小球白细胞浸润。心肌间质毛细血管扩张，血管周围有少量白细胞浸润，可见透明血栓形成。治疗组双肺脏胸膜点片状出血呈花斑状，双肺重量体积轻度增大，未见明显饱满，肿胀。光镜下肺泡壁多数完整，腔内少许出血，渗出及细胞浸润，间质白细胞浸润明显。肝汇管区有少量白细胞浸润，少部分肝细胞呈气球样变及嗜酸性变，未见坏死灶，肾小管上皮细胞肿胀，未见管型。心肌间质毛细血管少量扩张，血管周围白细胞浸润明显减少。C组肺、肝、心、肾为正常病理形态。
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2.3 免疫组织化学结果 TNF-α免疫反应阳性产物呈标黄色，背底不着色，反差明显，易于识别。阳性反应产物分布在胞质内，胞核阴性。正常肺肝心肾组织及细胞无阳性染色。创伤组肺、肝组织细胞呈强阳性免疫反应，心肾组织细胞呈阳性免疫反应，多分布在内脏组织的Mψ、枯否细胞、PMN和VEC中。治疗组肺肝心肾的阳性产物较模型组明显减少(P<0.05)。
2.4 创伤组和654-2治疗组肺、肝、心、肾TNF-α阳性反应物质的相对含量(见表2)。
表2 不同组织TNF-α阳性反应产物的相对含量 组 织
相对含量/细胞(
±s)模型组
654-2治疗组
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肺
0.1343±0.0089*
0.08923±0.0035
肝
0.1024±0.0087*
0.0718±0.0062
心
0.0968±0.0118*
0.0687±0.0020
肾
0.0823±0.0046*
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0.0601±0.0049
*P<0.05
3 讨论
近年来研究表明，ALI和MODS患者或动物模型均存在多器官的微血管内皮细胞损害及炎性介质释放增加，提示在ALI或MODS的发生发展过程中，存在着共同发病机制—失控性全身炎症反应。TNF-α参与机体炎症反应和免疫过程[2，3]，被认为是具有代表性的炎性介质，是介导机体炎症反应的关键因子，在ALI和MODS中起着重要的作用。
本实验结果显示：家兔胸部受到撞击后，外周血TNF-α含量显著升高，肺、肝、心、肾均发生不同程度的病理损害。可见ALI可启动全身其它组织器官的损伤，说明TNF-α等炎性介质参与了创伤后内脏功能损害的发生、发展过程。与Svoboda等[4]报道基本一致。因此，对ALI的理解不能局限于肺脏本身的疾病，而应认识到SIRS是ALI和MODS的共同发病基础，ALI是MODS的重要组成部分。可见，救治ALI或MODS的趋势应该是阻断机体自身的炎症反应，以避免其过度激活反应引起的介质瀑布样连锁反应而诱发组织细胞的失控损伤[5]。多器官功能障碍综合征时TNF-α的升高程度和疾病死亡率成正相关。设法阻止TNF-α的效应作用，已成为研究的热点。
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654-2是从植物中提取的一种生物碱类药物，近些年来，在防治ALI及MODS方面，显示出良好的作用[5，6]。先前的研究发现：654-2能减少TNF-α mRNA在肺、肝、心、肾组织的表达，从而起到对ALI的防治作用，但作用机理不明[6]。本实验654-2治疗组动物肺、肝、心、肾组织病理损害较创伤组有不同程度的减轻。免疫组织化学及原位定量结果显示：治疗组各内脏TNF-α蛋白表达及组织中含量、分布也显著减少(P<0.05)。说明654-2能有效的降低TNF-α的水平，减轻创伤性ALI所致的多脏器损伤。但654-2在ALI治疗作用中的机理尚需进一步探讨。本研究为创伤性ALI及ARDS的发病机制、早期诊断和治疗提供了实验依据。■
基金来源：国家自然科学基金资助(No.39770736)
参考文献：
[1]胡建才，刘维永，梁继河，等.肿瘤坏死因子和白介素-6在肺挫伤急性呼吸窘迫综合征中的变化及意义[J].解放军医学杂志，1997，22：287-288.
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[2]Welbourn CRB, Young Y. Endotoxin, septic shock and acute lung injury：neutrophils macrophages and inflammary meadiators[J]. Br J Surg, 1992, 79:998-1003.
[3]Soichiro I,Akimass N,Kishimo W,et al.Anti-neturophil antibody attenuates the severity of acute lung injury in rats with experimental acute pancreatitis[J].Arch Surg,1995,130:93-98.
[4]Svoboda P,Kantorova I,Ochmann J.Dynamics of interleukin 1,2 and 6 and tumor necrosis factor alpha in multiple trauma patients[J].J Trauma,1994,36:336.
[5]岳茂兴，李成林，李新元，等.大剂量山莨菪碱及地塞米松对兔MODS时TNF-α及LPO作用研究[J].急诊医学，1999，8：14-16.
[6]梁继河，朱云喜，李琦，等.山莨菪碱对创伤性急性肺损伤防治作用的实验研究[J].中华创伤杂志，1998，14：284-287.
收稿日期：1999-09-25
修回日期：1999-12-17, 百拇医药