肺泡表面张力与肿瘤坏死因子在急性低氧油酸性肺损伤时的变化
作者：崔社怀 郭先健 钱桂生
单位：崔社怀(第三军医大学西南医院呼吸科，重庆 400038)；郭先健(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺损伤；油酸；低氧；急性；肺泡表面活性物质；表面张力；肿瘤坏死因子-α
中国危重病急救医学000101 摘 要：目的：探讨急性低氧油酸肺损伤中肺泡表面活性物质(PS)系统改变的机制。方法：采用急性低氧肺损伤大鼠模型，分别观察血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量变化；采用人工智能的方法测定BALF中表面张力的变化；用高效液相色谱测定BALF中磷脂组分的改变。结果：静脉注入油酸后肺部很快出现中性粒细胞(PMN)的聚集，1小时即可达峰值(80.32%)；TNF-α在血浆和BALF中显著增加，以BALF中含量增加较显著，并随病程的延长而升高[(4 773.0±405.1)ng/L]；静脉注入油酸后磷脂酰胆碱(PC)含量显著降低，而磷脂酰乙醇胺(PE)含量显著升高；BALF的最小表面张力(STmin)迅速上升达到峰值，滞后环面积和稳定指数(SI)则进行性下降，并维持在一个较低水平(0.39±0.08)。己酮可可碱(PTX)可减轻油酸肺损伤肺部炎细胞浸润，减少TNF-α在血浆和BALF中的含量。结论：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性肺损伤时确有PC和PE及表面张力参数的改变；TNF-α不但参与了ARDS的发病机制，而且损害了肺部PS系统；PTX可明显改善动脉血氧分压，减轻肺水肿，尚可显著降低血浆和BALF中TNF-α的含量，对急性低氧油酸肺损伤有一定的治疗作用。
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分类号：R363.21 文献标识码：A
文章编号：1003-0603(2000)01-0003-04
Changes in pulmonary surface tension and tumor necrosis factorα after oleic acid induced lung injury during acute hyposia
CUI She-huai，GUO Xian-jian，QIAN Gui-sheng
(Department of Respiratory Disease,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract：Objective：To investigate changes in pulmonary surfactant system after oleic acid induced lung injury with acute hypoxia and their potential mechanism(s).Methods：A rat model of acute lung injury was produced by injected oleic acid into the superior vana cava.The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) were measured both in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and plasma.Pulmonary surface tension was determined in BALF by KD-Ⅱ instrument.Phosphalidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) levels were detected in BALF by high performance liquid chromatography.Results：TNF-α levels were significantly increased in BALF and plasma,which kept gradually elevation along with the prolonged acute lung injury.PC levels were markedly decreased while PE levels significantly increased following oleic acid challenge.Also,the value of minimum surface tension kept a high level,but stable index and surface area showed persistent decrease and maintained low values.Treatment with pentoxifylline (PTX) markedly reduced pulmonary infiltration of inflammatory cells and inhibited TNF-α formation both in BALF and plasma.Conclusions：Remarkable changes in PC,PE,and surface tension could be noted in animals with ARDS or acute lung injury.TNF-α might not only involve in the pathogenesis of acute lung,but also impair pulmonary surfactant system.PTX can improve PaO2 and attenuate pulmonary edema,and also decrease TNF-α levels in BALF and plasma,showing beneficial effect on the treatment of acute lung injury during acute hypoxia.
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Key words：acute lung injury;pulmonary surfactant;surface tension;tumor necrosis factor-α▲
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)时肺泡表面活性物质(PS)系统功能的异常及其作为肺损伤过程中的重要内在因素，目前已得到公认。本实验通过观察急性低氧油酸肺损伤大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中PS磷脂含量和表面张力的变化及影响因素、血浆和BALF中肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化，以期阐明在急性低氧油酸肺损伤中PS系统改变的机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组：雄性Wistar大鼠90只，体重210～280 g，平均(250±30)g，由本校动物所提供，分为3组：对照组30只，油酸组30只，己酮可可碱(PTX)组30只。具体步骤：大鼠放入低压舱，匀速减压至模拟海拔6000 m，维持12小时。从低压舱取出动物后，予3%戊巴比妥钠(0.3 ml/100g)麻醉。然后气管插管，颈总动脉和颈外静脉插管。术毕予大鼠吸入含9.78%O2的混合气体，30分钟后取动脉血样；油酸组动物由上腔静脉注入油酸100 μl/100 g，15分钟注完；对照组动物注入等量生理盐水；PTX组动物注入油酸后，立即给予PTX 2 mg/100 g，维持剂量1mg.100 g-1.h-1，观察1、2和4小时[1]。
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1.2 动脉血标本的采集：含抑肽酶的EDTA.Na2抗凝血，离心(1 500 r/min)15分钟取血浆，-70 ℃保存备测。
1.3 BALF的收集和细胞分类[2，3]：大鼠放血处死后，仰卧平放于手术台上，立即用硅化5 ml注射器抽吸0.9%氯化钠4 ml，将注射器连接气管插管，并将注射器垂直正立，使注射器活塞自然下降，向肺内灌注生理盐水。灌完后使液体在肺内停留30秒以上。然后放平注射器，把大鼠下半身向上抬高45°，慢慢收集肺内的液体。按上述步骤重复2次。3次总回收率91.06%±2.32%。将3次回收的BALF离心(800 r/min)10分钟，将上清液分装后，-70 ℃保存。离心后的细胞沉淀涂片，Giemsa染色。油镜下计数200个细胞进行分类。
1.4 血浆和BALF中TNFα含量的测定：按试剂盒说明书进行。放入ELISA酶标自动测试仪(美国BioRad公司)测定410 nm处吸光度。TNFα ELISA检测试剂盒由第四军医大学生产。
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1.5 BALF表面张力的测定[4]：采用重庆大学和西南医院烧伤研究所联合研制的KDⅡ型智能表面张力检测仪，测定BALF的表面张力。通过该仪器测定的BALF表面张力参数主要有3个，即最小表面张力(STmin)、最大表面张力(STmax)和滞后环面积(A)。并可通过下列公式分别计算出稳定指数(SI)：SI=2×(STmax-STmin)/(STmax+STmin)。SI反映的是PS单分子膜在低表面张力的稳定性，数值越大稳定性越好。
1.6 高效液相色谱法测定BALF中磷脂的组分[5]：
1.6.1 磷脂的提取：取2 ml BALF标本，加入2倍体积的氯仿甲醇提取液(2∶1，V∶V)，剧烈振荡1分钟，离心(3 000 r/min)10分钟，弃上清；再加入下层液相体积的1/4的甲醇水提取液(1∶1,V∶V)，剧烈振荡1分钟，离心(3000 r/min)10分钟。弃上层液体及杂质。下层液相用氮气吹干，密封后-70℃保存待测。测定时用20%氯仿流动相溶解后进样。
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1.6.2 色谱分析条件：HPLC系统(Gilson，法国)，色谱数据工作站(中国科学院大连化学物理研究所)，色谱柱为uPorasil Silica,4×300 mm，流动相为乙腈甲醇85%磷酸(V∶V为90∶3∶1)，流速为0.8 ml/min，进样量20 μl，室温检测，紫外线检测波长203 nm，工作站进行数据处理。
1.7 统计学方法：对实验数据进行方差分析。
2 结 果
2.1 对照组BALF镜检分类发现以巨噬细胞(AM)为主(占90%左右)，中性粒细胞(PMN)约占10%，尚有少许破碎或退化的上皮细胞；注入油酸后1小时大鼠BALF中PMN即已达到高峰，随着观察时间的延长，PMN并无明显改变，由于PMN的增加，BALF中AM百分比相应降低；在注入油酸后的2组(油酸组和PTX组)动物中PMN细胞分类均较对照组显著增加(P均<0.01)；组间比较PTX组PMN较油酸组显著降低，但并未降到对照组水平(表1)。
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表1 3组动物BALF中细胞分类 组别
动物数
(只)
AM(%)
PMN(%)
1小时
2小时
4小时
1小时
2小时
4小时
对照组
30
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86.43
91.20
90.25
12.96
8.01
8.36
油酸组
30
19.61**
21.22**
20.33*
80.32**
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78.11**
76.85**
PTX组
30
29.64**▲
34.66**▲
31.68**▲
70.26**▲
65.38**▲
64.88**▲
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注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与油酸组比较：▲P<0.05
2.2 血浆和BALF中TNFα含量：油酸组血浆TNFα含量较对照组显著增加(P<0.05或P<0.01)。PTX组第4小时TNFα含量较油酸组显著降低(P<0.05)，且PTX组第4小时显著低于第1小时(表2)。
表2 血浆TNFα含量变化(
±s)ng/L 组别
动物数(只)
1小时
2小时
4小时
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对照组
30
1507.3±114.3
1567.3±123.1
1401.3±201.5
油酸组
30
1711.5±154.3*
1685.9±211.2*
1819.4±392.3**
PTX组
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30
1673.4±182.1
1514.3±116.1
1429.1±113.7*△
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与同组1小时时间点比较：△P<0.05
2.3 BALF中TNFα含量的变化各时间点比较发现，油酸组第4小时显著高于第1和第2小时(P均<0.01)；第2小时显著高于第1小时(P<0.01)；PTX组第2、4小时显著低于第1小时(P<0.01，表3)。
表3 BALF中TNFα含量变化(±s)ng/L 组别
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动物数(只)
1小时
2小时
4小时
对照组
30
1589.0±121.4
1601.3±113.4
1506.0±163.4
油酸组
30
2101.0±218.8**
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3113.0±301.2**
4773.0±405.1**
PTX组
30
2068.0±184.0**
1558.0±96.0
1548.0±127.6
注：与对照组比较：**P<0.01
2.4 注入油酸后的2组动物(油酸组和PTX组)与对照组比，STmax之间无显著差异；但STmin迅速上升，1小时即达到对照组的5倍，此后持续在较高水平(P均<0.01)。与之相对，A和SI则进行性下降，并维持在较低水平(P<0.05或P<0.01)；PTX组反映肺表面张力变化的各参数均类似油酸组，经统计学处理各参数间无显著性差异(表4)。
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表4 BALF表面张力各参数变化比较(±s) 组别
动物数(只)
时间(h)
STmax(mN/m)
STmin(mN/m)
A(cm2)
SI
对照组
30
1
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58.81±2.63
7.15±1.29
37.62±6.82
1.56±0.11
2
56.44±3.54
8.42±1.43
36.44±5.20
1.48±0.23
4
58.62±4.35
6.47±2.68
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33.68±5.95
1.60±0.26
油酸组
30
1
53.72±4.42
34.35±2.53**
20.92±3.11*
0.44±0.06**
2
55.06±2.46
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35.06±3.07**
19.07±2.62*
0.45±0.07**
4
54.95±3.24
36.87±3.02**
18.19±1.95*
0.39±0.08**
PTX组
30
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1
55.12±2.52
36.42±3.17**
19.31±2.47*
0.41±0.03**
2
54.62±5.01
37.18±2.64**
18.76±3.50*
0.39±0.07**
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4
55.87±4.46
36.86±4.36**
19.88±2.24*
0.41±0.08**
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.5 BALF中磷脂成分的含量：油酸组与对照组比磷脂酰胆碱(PC)含量显著降低(P均<0.05)；PTX组与对照组比PC含量也显著降低(P均<0.05)；PTX组与油酸组比无差异(P均>0.05)。与对照组比磷脂酰乙醇胺(PE)含量在油酸组、PTX组均显著升高(P均<0.05，表5)。
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表5 BALF中PC和PE含量(±s)mg/g 组别
动物数(只)
时间(h)
PC
PE
对照组
30
1
8.15±0.55
1.38±0.34
2
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7.95±0.67
1.43±0.67
4
8.46±0.74
1.44±0.54
油酸组
30
1
6.15±1.17*
1.65±0.25*
2
6.70±1.13*
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1.98±0.31*
4
6.18±0.82*
1.89±0.17*
PTX组
30
1
6.14±0.86*
1.64±0.10*
2
6.88±0.90*
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1.91±0.08*
4
7.10±1.60*
1.86±0.11*
注：与对照组相应时间点比较：*P<0.05
PS的主要成分PC含量显著降低，膜成分磷脂PE含量显著升高，导致PS功能受损；PE的增加，说明含Ⅱ型肺泡上皮细胞在内的肺部细胞成分的分解增加。
3 讨 论
本研究结果显示：ARDS或急性肺损伤时确有PC和PE及表面张力参数的改变。主要表现在以下几个方面：
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3.1 表面张力的改变：本研究结果表明，急性低氧油酸肺损伤后STmin迅速上升达到峰值，A和SI则进行性下降，并维持在一个较低水平，提示PS生物活性功能降低。以往研究资料证明，ARDS时PS存在质量和形态结构的异常，包括STmin的显著增加及PS生物活性功能的降低[6]。一般认为，STmin<10 mN/m是维持肺泡扩张的基本条件；SI则可以评价低表面张力下PS是否稳定。而PS在肺泡腔从聚集到扩展成表面活性单分子层的过程，则可用表面活性面积环来反映，其值越大，PS的扩展性能也越好。我们认为急性肺损伤时，肺表面活性物质功能明显障碍，与Petty等[7]观察到ARDS患者的PS聚集形式发生改变(以小集合体形式为主)是引起肺功能障碍的主要因素的结果一致。
3.2 PS组成成分和比例的改变：在急性低氧油酸肺损伤中，静脉注入油酸后PC含量显著降低，而PE含量显著升高。本实验结果BALF中PC含量的减少，间接反映了PS含量的降低。然而本实验结果在PC含量下降的同时，PE含量明显增加。目前认为，PE在PS组成中仅占极小部分(在兔为3.2%，在人为5.3%)。PE主要参与组成细胞的膜性成分。显而易见，BALF中PE含量的增加，表明了细胞成分的分解代谢的增加，是肺组织细胞损伤的结果。尽管许多报道临床ARDS患者PS含量的结果不一，但多数作者认为，ARDS患者BALF中PS含量以降低为主[8]。我们认为，在BALF中，PC和PE组成比例的变化可能影响了PS的生物活性功能，说明PS中不同脂质组成及其相对含量的稳定对维持PS生物活性功能的重要性。
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引起PS含量、组成和比例变化的原因，目前尚不清楚。推测可能是急性肺损伤时肺毛细血管通透性增加，大量富含血浆蛋白的水肿液进入肺泡腔，稀释并改变了PS的组成成分；油酸的直接和间接毒性作用，以及毒性氧基等有毒因子对Ⅱ型肺泡上皮细胞损害，使之合成和分泌PS的功能降低，致使PS合成和分泌减少[9]；大量血浆蛋白进入肺泡腔，其中的纤维蛋白原和纤维蛋白单体抑制、灭活、甚至分解PS，可能是造成PS含量、组成和比例发生改变的又一因素。据文献[10]报道，在急性低氧实验中，模拟高原6000 m，5小时，即可使PS含量明显减少，说明单纯低氧就可造成肺部PS系统的损害。
本研究结果，尽管BALF表面张力滞后环面积减少，SI数值变小，PC和PE含量改变等异常与ARDS的发生尚有一定距离，但其反映的实质是PS系统障碍或功能低下，结果必然会导致肺顺应性降低，小气道闭塞，气道阻力和呼吸功增加。因此，PS系统异常除引起肺泡表面张力增加外，还引起小气道功能紊乱和低下，是导致呼吸衰竭的重要原因。
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3.3 本研究结果，TNFα在血浆和BALF中显著增加，以BALF中含量增加较显著，并随病程的延长而升高。文献[11]指出，ARDS患者血浆和BALF中TNFα显著升高；TNFα介导的ARDS机制十分复杂，涉及血管内皮细胞、PMN、单核巨噬细胞等。有报道[12]TNFα可直接影响磷脂的分泌和再摄取，或通过β肾上腺素能受体间接改变肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能。致使PS生成、代谢和生理活性功能降低，最后发生ARDS。故我们认为，TNFα不但参与了ARDS的发病机制，而且损害了肺部PS系统。
3.4 PTX可明显改善动脉血氧分压(PaO2)，减轻肺水肿，尚可显著降低血浆和BALF中TNFα的含量。PTX组在注油酸4小时内几乎可使升高的TNFα降至对照水平。PTX对急性低氧油酸肺损伤有一定的治疗作用。
在临床上，急性肺损伤或ARDS的早期诊断仍是一大难题。我们认为，PMN在BALF中所占比例在短时间内显著增加，AM减少与之相差悬殊，加之BALF中PC含量减少、PaO2显著降低及TNFα含量显著升高等变化，可作为ARDS或急性肺损伤的早期预警指标的重要参考。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670336)
作者简介：崔社怀(1955-)，男(汉族)，河北省人，博士，副教授，副主任医师。中华医学会重庆分会结核专业委员会委员。获军队科技进步三等奖2项，军队医疗成果三等奖1项；发表论文20多篇。
参考文献：
[1]崔社怀，郭先健.急性低氧复合油酸性大鼠肺损伤模型的复制及己酮可可碱的治疗作用.中国病理生理杂志，1999，15(2)：150-163.
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[4]许剑欧，刘志远.肺表面活性物质表面张力动态测试.第三军医大学学报，1987，9：50-52.
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[6]陈正堂，毛宝龄，董解菊，等.呼吸窘迫综合征肺表面活性物质变化的探讨.第三军医大学学报，1994，16：99-101.
[7]Petty T L,Ashbaugh D G.The adult respiratory distress syndrome:clinical features factors influencing prognosis and principles of management.Chest,1971,60:233-239.
[8]Paterson J F,Hammond M D,Montgomery M R,et al.Acute ozone induced lung injury in rats:structural functional relationships of developing alveolar edema.Toxicol Appl Pharmcol,1992,117:37-45.
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[10]孙秉庸，李楚杰，赵修竹，等主编.病理生理学进展.第1版.北京：科学技术文献出版社，1993.326-330.
[11]Hoch R C,Rodriguez R,Manning T,et al.Effects of accidental trauma on cytokine and endotoxin production.Crit Care Med,1993,21:839-845.
[12]Hertzog J H,Godinez M H,Godinez R I.Tumor necrosis factor-α alter phospholipid content in the bronchoalveolar lavage accessible space of isolated perfuse rat lungs.Crit Care Med,1994,22:1969-1975.
收稿日期：1999-01-27
修稿日期：1999-09-03, 百拇医药
单位：崔社怀(第三军医大学西南医院呼吸科，重庆 400038)；郭先健(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺损伤；油酸；低氧；急性；肺泡表面活性物质；表面张力；肿瘤坏死因子-α
中国危重病急救医学000101 摘 要：目的：探讨急性低氧油酸肺损伤中肺泡表面活性物质(PS)系统改变的机制。方法：采用急性低氧肺损伤大鼠模型，分别观察血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量变化；采用人工智能的方法测定BALF中表面张力的变化；用高效液相色谱测定BALF中磷脂组分的改变。结果：静脉注入油酸后肺部很快出现中性粒细胞(PMN)的聚集，1小时即可达峰值(80.32%)；TNF-α在血浆和BALF中显著增加，以BALF中含量增加较显著，并随病程的延长而升高[(4 773.0±405.1)ng/L]；静脉注入油酸后磷脂酰胆碱(PC)含量显著降低，而磷脂酰乙醇胺(PE)含量显著升高；BALF的最小表面张力(STmin)迅速上升达到峰值，滞后环面积和稳定指数(SI)则进行性下降，并维持在一个较低水平(0.39±0.08)。己酮可可碱(PTX)可减轻油酸肺损伤肺部炎细胞浸润，减少TNF-α在血浆和BALF中的含量。结论：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性肺损伤时确有PC和PE及表面张力参数的改变；TNF-α不但参与了ARDS的发病机制，而且损害了肺部PS系统；PTX可明显改善动脉血氧分压，减轻肺水肿，尚可显著降低血浆和BALF中TNF-α的含量，对急性低氧油酸肺损伤有一定的治疗作用。
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分类号：R363.21 文献标识码：A
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Changes in pulmonary surface tension and tumor necrosis factorα after oleic acid induced lung injury during acute hyposia
CUI She-huai，GUO Xian-jian，QIAN Gui-sheng
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Abstract：Objective：To investigate changes in pulmonary surfactant system after oleic acid induced lung injury with acute hypoxia and their potential mechanism(s).Methods：A rat model of acute lung injury was produced by injected oleic acid into the superior vana cava.The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) were measured both in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and plasma.Pulmonary surface tension was determined in BALF by KD-Ⅱ instrument.Phosphalidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) levels were detected in BALF by high performance liquid chromatography.Results：TNF-α levels were significantly increased in BALF and plasma,which kept gradually elevation along with the prolonged acute lung injury.PC levels were markedly decreased while PE levels significantly increased following oleic acid challenge.Also,the value of minimum surface tension kept a high level,but stable index and surface area showed persistent decrease and maintained low values.Treatment with pentoxifylline (PTX) markedly reduced pulmonary infiltration of inflammatory cells and inhibited TNF-α formation both in BALF and plasma.Conclusions：Remarkable changes in PC,PE,and surface tension could be noted in animals with ARDS or acute lung injury.TNF-α might not only involve in the pathogenesis of acute lung,but also impair pulmonary surfactant system.PTX can improve PaO2 and attenuate pulmonary edema,and also decrease TNF-α levels in BALF and plasma,showing beneficial effect on the treatment of acute lung injury during acute hypoxia.
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Key words：acute lung injury;pulmonary surfactant;surface tension;tumor necrosis factor-α▲
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)时肺泡表面活性物质(PS)系统功能的异常及其作为肺损伤过程中的重要内在因素，目前已得到公认。本实验通过观察急性低氧油酸肺损伤大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中PS磷脂含量和表面张力的变化及影响因素、血浆和BALF中肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化，以期阐明在急性低氧油酸肺损伤中PS系统改变的机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组：雄性Wistar大鼠90只，体重210～280 g，平均(250±30)g，由本校动物所提供，分为3组：对照组30只，油酸组30只，己酮可可碱(PTX)组30只。具体步骤：大鼠放入低压舱，匀速减压至模拟海拔6000 m，维持12小时。从低压舱取出动物后，予3%戊巴比妥钠(0.3 ml/100g)麻醉。然后气管插管，颈总动脉和颈外静脉插管。术毕予大鼠吸入含9.78%O2的混合气体，30分钟后取动脉血样；油酸组动物由上腔静脉注入油酸100 μl/100 g，15分钟注完；对照组动物注入等量生理盐水；PTX组动物注入油酸后，立即给予PTX 2 mg/100 g，维持剂量1mg.100 g-1.h-1，观察1、2和4小时[1]。
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1.2 动脉血标本的采集：含抑肽酶的EDTA.Na2抗凝血，离心(1 500 r/min)15分钟取血浆，-70 ℃保存备测。
1.3 BALF的收集和细胞分类[2，3]：大鼠放血处死后，仰卧平放于手术台上，立即用硅化5 ml注射器抽吸0.9%氯化钠4 ml，将注射器连接气管插管，并将注射器垂直正立，使注射器活塞自然下降，向肺内灌注生理盐水。灌完后使液体在肺内停留30秒以上。然后放平注射器，把大鼠下半身向上抬高45°，慢慢收集肺内的液体。按上述步骤重复2次。3次总回收率91.06%±2.32%。将3次回收的BALF离心(800 r/min)10分钟，将上清液分装后，-70 ℃保存。离心后的细胞沉淀涂片，Giemsa染色。油镜下计数200个细胞进行分类。
1.4 血浆和BALF中TNFα含量的测定：按试剂盒说明书进行。放入ELISA酶标自动测试仪(美国BioRad公司)测定410 nm处吸光度。TNFα ELISA检测试剂盒由第四军医大学生产。
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1.5 BALF表面张力的测定[4]：采用重庆大学和西南医院烧伤研究所联合研制的KDⅡ型智能表面张力检测仪，测定BALF的表面张力。通过该仪器测定的BALF表面张力参数主要有3个，即最小表面张力(STmin)、最大表面张力(STmax)和滞后环面积(A)。并可通过下列公式分别计算出稳定指数(SI)：SI=2×(STmax-STmin)/(STmax+STmin)。SI反映的是PS单分子膜在低表面张力的稳定性，数值越大稳定性越好。
1.6 高效液相色谱法测定BALF中磷脂的组分[5]：
1.6.1 磷脂的提取：取2 ml BALF标本，加入2倍体积的氯仿甲醇提取液(2∶1，V∶V)，剧烈振荡1分钟，离心(3 000 r/min)10分钟，弃上清；再加入下层液相体积的1/4的甲醇水提取液(1∶1,V∶V)，剧烈振荡1分钟，离心(3000 r/min)10分钟。弃上层液体及杂质。下层液相用氮气吹干，密封后-70℃保存待测。测定时用20%氯仿流动相溶解后进样。
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1.6.2 色谱分析条件：HPLC系统(Gilson，法国)，色谱数据工作站(中国科学院大连化学物理研究所)，色谱柱为uPorasil Silica,4×300 mm，流动相为乙腈甲醇85%磷酸(V∶V为90∶3∶1)，流速为0.8 ml/min，进样量20 μl，室温检测，紫外线检测波长203 nm，工作站进行数据处理。
1.7 统计学方法：对实验数据进行方差分析。
2 结 果
2.1 对照组BALF镜检分类发现以巨噬细胞(AM)为主(占90%左右)，中性粒细胞(PMN)约占10%，尚有少许破碎或退化的上皮细胞；注入油酸后1小时大鼠BALF中PMN即已达到高峰，随着观察时间的延长，PMN并无明显改变，由于PMN的增加，BALF中AM百分比相应降低；在注入油酸后的2组(油酸组和PTX组)动物中PMN细胞分类均较对照组显著增加(P均<0.01)；组间比较PTX组PMN较油酸组显著降低，但并未降到对照组水平(表1)。
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表1 3组动物BALF中细胞分类 组别
动物数
(只)
AM(%)
PMN(%)
1小时
2小时
4小时
1小时
2小时
4小时
对照组
30
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86.43
91.20
90.25
12.96
8.01
8.36
油酸组
30
19.61**
21.22**
20.33*
80.32**
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78.11**
76.85**
PTX组
30
29.64**▲
34.66**▲
31.68**▲
70.26**▲
65.38**▲
64.88**▲
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注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与油酸组比较：▲P<0.05
2.2 血浆和BALF中TNFα含量：油酸组血浆TNFα含量较对照组显著增加(P<0.05或P<0.01)。PTX组第4小时TNFα含量较油酸组显著降低(P<0.05)，且PTX组第4小时显著低于第1小时(表2)。
表2 血浆TNFα含量变化(
±s)ng/L 组别动物数(只)
1小时
2小时
4小时
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对照组
30
1507.3±114.3
1567.3±123.1
1401.3±201.5
油酸组
30
1711.5±154.3*
1685.9±211.2*
1819.4±392.3**
PTX组
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30
1673.4±182.1
1514.3±116.1
1429.1±113.7*△
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与同组1小时时间点比较：△P<0.05
2.3 BALF中TNFα含量的变化各时间点比较发现，油酸组第4小时显著高于第1和第2小时(P均<0.01)；第2小时显著高于第1小时(P<0.01)；PTX组第2、4小时显著低于第1小时(P<0.01，表3)。
表3 BALF中TNFα含量变化(
±s)ng/L 组别, http://www.100md.com
动物数(只)
1小时
2小时
4小时
对照组
30
1589.0±121.4
1601.3±113.4
1506.0±163.4
油酸组
30
2101.0±218.8**
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3113.0±301.2**
4773.0±405.1**
PTX组
30
2068.0±184.0**
1558.0±96.0
1548.0±127.6
注：与对照组比较：**P<0.01
2.4 注入油酸后的2组动物(油酸组和PTX组)与对照组比，STmax之间无显著差异；但STmin迅速上升，1小时即达到对照组的5倍，此后持续在较高水平(P均<0.01)。与之相对，A和SI则进行性下降，并维持在较低水平(P<0.05或P<0.01)；PTX组反映肺表面张力变化的各参数均类似油酸组，经统计学处理各参数间无显著性差异(表4)。
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表4 BALF表面张力各参数变化比较(
±s) 组别动物数(只)
时间(h)
STmax(mN/m)
STmin(mN/m)
A(cm2)
SI
对照组
30
1
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58.81±2.63
7.15±1.29
37.62±6.82
1.56±0.11
2
56.44±3.54
8.42±1.43
36.44±5.20
1.48±0.23
4
58.62±4.35
6.47±2.68
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33.68±5.95
1.60±0.26
油酸组
30
1
53.72±4.42
34.35±2.53**
20.92±3.11*
0.44±0.06**
2
55.06±2.46
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35.06±3.07**
19.07±2.62*
0.45±0.07**
4
54.95±3.24
36.87±3.02**
18.19±1.95*
0.39±0.08**
PTX组
30
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1
55.12±2.52
36.42±3.17**
19.31±2.47*
0.41±0.03**
2
54.62±5.01
37.18±2.64**
18.76±3.50*
0.39±0.07**
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4
55.87±4.46
36.86±4.36**
19.88±2.24*
0.41±0.08**
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.5 BALF中磷脂成分的含量：油酸组与对照组比磷脂酰胆碱(PC)含量显著降低(P均<0.05)；PTX组与对照组比PC含量也显著降低(P均<0.05)；PTX组与油酸组比无差异(P均>0.05)。与对照组比磷脂酰乙醇胺(PE)含量在油酸组、PTX组均显著升高(P均<0.05，表5)。
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表5 BALF中PC和PE含量(
±s)mg/g 组别动物数(只)
时间(h)
PC
PE
对照组
30
1
8.15±0.55
1.38±0.34
2
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7.95±0.67
1.43±0.67
4
8.46±0.74
1.44±0.54
油酸组
30
1
6.15±1.17*
1.65±0.25*
2
6.70±1.13*
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1.98±0.31*
4
6.18±0.82*
1.89±0.17*
PTX组
30
1
6.14±0.86*
1.64±0.10*
2
6.88±0.90*
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1.91±0.08*
4
7.10±1.60*
1.86±0.11*
注：与对照组相应时间点比较：*P<0.05
PS的主要成分PC含量显著降低，膜成分磷脂PE含量显著升高，导致PS功能受损；PE的增加，说明含Ⅱ型肺泡上皮细胞在内的肺部细胞成分的分解增加。
3 讨 论
本研究结果显示：ARDS或急性肺损伤时确有PC和PE及表面张力参数的改变。主要表现在以下几个方面：
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3.1 表面张力的改变：本研究结果表明，急性低氧油酸肺损伤后STmin迅速上升达到峰值，A和SI则进行性下降，并维持在一个较低水平，提示PS生物活性功能降低。以往研究资料证明，ARDS时PS存在质量和形态结构的异常，包括STmin的显著增加及PS生物活性功能的降低[6]。一般认为，STmin<10 mN/m是维持肺泡扩张的基本条件；SI则可以评价低表面张力下PS是否稳定。而PS在肺泡腔从聚集到扩展成表面活性单分子层的过程，则可用表面活性面积环来反映，其值越大，PS的扩展性能也越好。我们认为急性肺损伤时，肺表面活性物质功能明显障碍，与Petty等[7]观察到ARDS患者的PS聚集形式发生改变(以小集合体形式为主)是引起肺功能障碍的主要因素的结果一致。
3.2 PS组成成分和比例的改变：在急性低氧油酸肺损伤中，静脉注入油酸后PC含量显著降低，而PE含量显著升高。本实验结果BALF中PC含量的减少，间接反映了PS含量的降低。然而本实验结果在PC含量下降的同时，PE含量明显增加。目前认为，PE在PS组成中仅占极小部分(在兔为3.2%，在人为5.3%)。PE主要参与组成细胞的膜性成分。显而易见，BALF中PE含量的增加，表明了细胞成分的分解代谢的增加，是肺组织细胞损伤的结果。尽管许多报道临床ARDS患者PS含量的结果不一，但多数作者认为，ARDS患者BALF中PS含量以降低为主[8]。我们认为，在BALF中，PC和PE组成比例的变化可能影响了PS的生物活性功能，说明PS中不同脂质组成及其相对含量的稳定对维持PS生物活性功能的重要性。
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引起PS含量、组成和比例变化的原因，目前尚不清楚。推测可能是急性肺损伤时肺毛细血管通透性增加，大量富含血浆蛋白的水肿液进入肺泡腔，稀释并改变了PS的组成成分；油酸的直接和间接毒性作用，以及毒性氧基等有毒因子对Ⅱ型肺泡上皮细胞损害，使之合成和分泌PS的功能降低，致使PS合成和分泌减少[9]；大量血浆蛋白进入肺泡腔，其中的纤维蛋白原和纤维蛋白单体抑制、灭活、甚至分解PS，可能是造成PS含量、组成和比例发生改变的又一因素。据文献[10]报道，在急性低氧实验中，模拟高原6000 m，5小时，即可使PS含量明显减少，说明单纯低氧就可造成肺部PS系统的损害。
本研究结果，尽管BALF表面张力滞后环面积减少，SI数值变小，PC和PE含量改变等异常与ARDS的发生尚有一定距离，但其反映的实质是PS系统障碍或功能低下，结果必然会导致肺顺应性降低，小气道闭塞，气道阻力和呼吸功增加。因此，PS系统异常除引起肺泡表面张力增加外，还引起小气道功能紊乱和低下，是导致呼吸衰竭的重要原因。
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3.3 本研究结果，TNFα在血浆和BALF中显著增加，以BALF中含量增加较显著，并随病程的延长而升高。文献[11]指出，ARDS患者血浆和BALF中TNFα显著升高；TNFα介导的ARDS机制十分复杂，涉及血管内皮细胞、PMN、单核巨噬细胞等。有报道[12]TNFα可直接影响磷脂的分泌和再摄取，或通过β肾上腺素能受体间接改变肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能。致使PS生成、代谢和生理活性功能降低，最后发生ARDS。故我们认为，TNFα不但参与了ARDS的发病机制，而且损害了肺部PS系统。
3.4 PTX可明显改善动脉血氧分压(PaO2)，减轻肺水肿，尚可显著降低血浆和BALF中TNFα的含量。PTX组在注油酸4小时内几乎可使升高的TNFα降至对照水平。PTX对急性低氧油酸肺损伤有一定的治疗作用。
在临床上，急性肺损伤或ARDS的早期诊断仍是一大难题。我们认为，PMN在BALF中所占比例在短时间内显著增加，AM减少与之相差悬殊，加之BALF中PC含量减少、PaO2显著降低及TNFα含量显著升高等变化，可作为ARDS或急性肺损伤的早期预警指标的重要参考。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670336)
作者简介：崔社怀(1955-)，男(汉族)，河北省人，博士，副教授，副主任医师。中华医学会重庆分会结核专业委员会委员。获军队科技进步三等奖2项，军队医疗成果三等奖1项；发表论文20多篇。
参考文献：
[1]崔社怀，郭先健.急性低氧复合油酸性大鼠肺损伤模型的复制及己酮可可碱的治疗作用.中国病理生理杂志，1999，15(2)：150-163.
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[7]Petty T L,Ashbaugh D G.The adult respiratory distress syndrome:clinical features factors influencing prognosis and principles of management.Chest,1971,60:233-239.
[8]Paterson J F,Hammond M D,Montgomery M R,et al.Acute ozone induced lung injury in rats:structural functional relationships of developing alveolar edema.Toxicol Appl Pharmcol,1992,117:37-45.
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收稿日期：1999-01-27
修稿日期：1999-09-03, 百拇医药