面神经损伤后穴位电针刺激对神经组织中神经营养因子-3及其受体表达的影响
作者：牙祖蒙 王建华 李忠禹 谭颖徽
单位：牙祖蒙(中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院北三病房，北京 100041；)；王建华(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)；李忠禹(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)；谭颖徽(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)
关键词：穴位针刺；周围神经再生；面神经；神经营养因子
中国中医基础医学杂志000121 摘要：目的：观察穴位电针刺激对面神经再生过程中神经组织神经营养因子-3(NT-3)及其受体表达的影响。方法：日本大耳白兔面神经压榨伤后，电针刺激翳风、颧FDE2、地仓、颊车、四白、阳白、合谷穴，每天30min，2周为一疗程。设对照组。经一二三疗程治疗后，应用原位杂交及RT—PCR技术检测针刺组及对照组面神经组织中NT-3及TrkC mRNA表达水平的变化。结果：NT-3、TrkC受体表达高峰均在神经损伤后第6周；在相同时间点，针刺组NT-3、TrkC mRNA的表达明显高于对照组(P<0.05或0.01)。结论：在面神经再生过程中，穴位电针刺激能明显增强面神经组织中NT-3及TrkC mRNA的表达，这一分子水平的表现可能是穴位电针刺激促进面神经再生的机制之一。
, 百拇医药
中图分类号：R245.32+9 文献标识码：B
文章标号：1006-3250(2000)01-0070-03
Effects of Acupuncture on mRNA Expression of NT-3 and Trk C
Receptors during Facial Nerve Regenerating
YA Zu-meng
(Plastic Surgery Hospital,CAMS and PUMC Beijing 100041)
Wang Jian-hua Li Zhong-yu Tan Yin-hui
, 百拇医药
(Xinqiao Hospital,Third Military Medical college Chongqing 400037)
Abstract:Both right and left facial nerve of rabbits were crashed and the degree of the injury was Sunderland IV.Then the injuried rbbits were devided into treatment and the control group.One week after injury,pulse electroacupuncture stimulation on acupoint(PEASA) were performed in teratment group,while the control group was left recovering natruely.the involed acupoints included Yifeng,Quanliao,Jiache,Dicang,Sibai,Yangbai and Hegu.Two weeks to be a course of the treatment.In this experimental modle,we have showed facial nerve regeneration had been improved by acupointpunctrue pathologically and electro-physiologically.But on molecular level how about the effects of acupuncture on neurotrophic factors during the nerve regenerate.When the first(3w),second(6w),and third(9w) course of the treatment were finished we used in situ hybridiza-tion and RT-PCR technique to observe the changes of mRNA expression of NT-3 and Trk C receptors in facial nerve tissue.The results are as follows:(1)mRNA expression of NT-3 and TrkC receptors reaches the highest level in the sixth week post trauma in both treatment and control group;(2)in facial nerve tissue,expression level of mRNA for NT-3 and TrkC in treatment group were signifigantly higher than in the control group (P<0.01 or 0.05).This experiment result suggests some molecular mechanism about the effects of acupuncture on facial nerve regeneration.
, 百拇医药
Key words:peripheral nerve regeneration;facial nerve neurotrophic factors;acupunctrue.
穴位针刺用于Bell's面瘫的治疗已经有很长的历史，其疗效是公认的，但缺乏实验依据。而对外伤性面瘫，穴位针刺治疗是否有效?如果有效，其作用机制是什么?作者已在电生理及病理形态学方面证实了穴位电针刺激可促进面神经再生[1]。神经营养因子-3(NT-3)对运动神经的修复和再生至关重要。本文报道穴位电针刺激对NT-3及其TrkC受体表达影响。
材料与方法
1 动物及其分组
日本大耳白兔48只(第三军医大学实验动物所提供，合格证号：医动字第24301052号；环境设施合格证号：医动字第24302012号)，性别不限，年龄6～8个月，体重2.0kg～2.5kg。随机分成针刺组及对照组，每组24只。针刺组又分一疗程、二疗程、三疗程组，每组8只含16侧面神经(n=16)，对照组24只也分3个与一二三疗程组相对应的小组，每组n=16。
, http://www.100md.com
2 面神经压榨伤模型的制作
3%戊巴比妥钠(1ml/kg)静注麻醉，无菌操作解剖出双侧面神经颊支，以特制钳钳夹神经中部30s，松开30s后再夹30s[2]。所造成的损伤经病理证实均为Sunderland Ⅳ度损伤。缝合伤口，复苏。
3 穴位电针刺激[2]
神经损伤1周后，治疗组接受穴位电针刺激。取双侧翳风、颧FDE2、地仓、颊车、四白、阳白、合谷穴；2.0cm毫针经皮斜刺，深度1cm～1.5cm，用外科缝线将针耳固定于皮肤上；采用频率18～20的疏密波刺激，电压1.5V，每日治疗30min，每两周为一疗程，一二三疗程组疗量分别为1、2、3个疗程，每疗程间隔1周。对照组不接受任何治疗。
4 组织原位杂交
, 百拇医药 (1) 取材：各疗程组治疗一结束， 活杀动物， 迅速切取面神经核、 面神经颊支、 颊肌组织， 立即放于液氮中保存。 (2) 探针及其标记：由于NTFs及其受体核酸碱基序列各类哺乳动物间同源性达90%以上，故本实验以鼠NGF及Trk受体mRNA碱基序列为模板，用PCR软件(Primer Designer 1.0，Scientific Software 1990)加人工分析选择探针长度及序列，人工合成NT-3、TrkC寡聚脱氧核糖核酸探针，2探针序列分别为3′-GCCTTCTTG TACTTA ACCGTAGACA-5′，3′-CTACAGCAGGCTGACTGGATCCTTC-5′(由中国科学院上海细胞生物研究所合成提供)。用3′末端转移法地高辛标记(地高辛标记盒由宝林曼公司提供)。(3)杂交：从液氮中取出组织作冰冻切片，用漂浮法进行杂交[3]，设阴性对照，终止反应后裱片、染色，光镜观察。
5 RT—PCR[4、5]
, http://www.100md.com (1)引物设计及合成：同探针设计及合成，只是引物不标记。NT-3上游引物5′-GGTGATGTCCATCTTGTTTGATGTG-3′，下游引物3′-GCCTTCTTGTACTTAACCGTAGACA-5′。TrkC上游引物5′-ATGCTCGTCAGGACTTCCATCGTGA-3′，下游引物3′-CTACAGCAGGCTGACTGGATCCTTC-5′(由中国科学院上海细胞生物研究所合成提供)。(2)用异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA。(3)RNA含量及纯度鉴定OD260/OD280<1.7者再用酚—氯仿抽提纯化，OD260/OD280>2.0者提示有异硫氰酸胍污染，再用异丙醇沉淀。(4)用1%甲醛凝胶变性电泳法鉴定RNA的完整法。(5)反转录：按反转录试剂盒说明书进行(RT—PCR试剂盒为Sigma产品)。(6)PCR扩增：按RT—PCR试剂盒说明书进行。(7)1.5～2.0%琼脂糖电泳。(8)暗室照相。(9)电泳照片特异性扩增条带的积分光密度扫描。
结果
, http://www.100md.com 1 原位杂交
在同一组中，以神经损伤后第6周的杂交信号最强；在相同时间点上，NT-3、TrkC mRNA原位杂交信号在治疗组均比对照组强，其中以神经损伤后第6周的杂交信号差异最明显(见照片1a-d)。
图1 NT-3和Trk C原位杂交信号比较：a.对照组NT-3 40×；b.针刺组NT-3，40×；c.对照组Trk C,40×；d.针刺组TrkC,40×(第二疗程结束后，即神经伤后6周)。
图2 NT-3及Trk C受体mRNA RT-PCR电泳结果
对照组NT-3 ■ 针刺组NT-3 □ 对照组Nrk C 
针刺组Trk C
, http://www.100md.com
图3 不同时间NT-3、TrkC mRNA特异条带平均灰度(AGI)比较(P<0.05;0.01)
2 RT—PCR结果
电泳结果见照片2；扫描图像分析结果见图3。两组NT-3、TrkC受体表达高峰均在神经损伤后第6周；NT-3在神经损伤后第3、6、9周，TrkC在神经损伤后第6、9周，其mRNA的表达于针刺组均明显高于对照组(P<0.05或0.01)。
讨论
穴位电针刺激促进周围神经再生已有不少文献报道[6、7]。作者在以前的实验中，已用病理形态学和电生理学手段观察到穴位电针刺激能促进面神经再生[1]。但从神经分子生物学水平观察穴位针刺对周围神经损伤后再生有何影响，尚鲜有报道。神经营养因子(NTFs)对周围神经再生和修复具有重要作用，其主要成员包括神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3/4/5/6(NT-3/4/5/6)等。神经损伤后，雪旺氏细胞和靶组织合成NTFs能力增强，逆转运速度加快，通过与胞体中Trk系列受体高亲和力结合而引起神经营养效应。NTFs各成员中，对运动神经起营养支持作用的主要是BDNF和NT-3[8、9]，后者与TrkC受体结合而发挥作用。本实验结果显示，神经损伤后NT-3及其TrkC受体的表达水平增高，这与其他文献报道相吻合，属神经自我修复的反应[10]。更有趣的是，针刺组神经组织中NT-3及TrkC mRNA的表达水平均明显高于对照组。这些结果提示穴位电针刺激使表情肌及雪旺氏细胞NT-3产量提高，逆转运速率加快，同时其受体数量增多。这可能是穴位电针刺激促进面神经再生的分子生物学机制之一。至于穴位针刺通过何种途径引起这一效应，有待进一步研究。
, 百拇医药
这些实验结果为穴位电针刺激疗法的进一步广泛应用提供了依据。
作者简介：牙祖蒙(1965-)，男，广西人，1992年于第三军医大学获口腔颌面外科专业硕士学位，1992～1997年在第三军医大学第二附属医院口腔颌面外科工作，1993年晋升主治医师。1997年8月考入中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院(研究所)攻读整形外科临床医学博士学位，从师于国际知名的整形外科专家陈宗基教授。从事头面颈整复外科和美容外科研究。
参考文献
[1]牙祖蒙，王建华，李忠禹，等.穴位针刺对面神经再生影响的实验研究.针刺研究，1999，24(2)：111-114.
[2]牙祖蒙，王建华，李忠禹，等.穴位针刺对面神经再生影响的动物模型制作.实验动物科学与管理，1999，16(1)：15-17.
, http://www.100md.com
[3]蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994.421-427.
[4]Vangerer M,Bohm M,Elce J,et al.Altered expression of β-aderenergic receptors in the failing human heart.Circulation,1993,87:454.
[5]陈建康，邹万忠，由江峰.半定量RT-PCR方法在基因表达研究中的应用.北京医科大学学报，1996，28(3)：171-173.
[6]孔天翰.电针对胫神经不同纤维成分再生的促进作用.针刺研究，1993，18：232-235.
[7]魏月娥.针刺对大鼠舌下神经切断后舌下神经核内神经元丧失的影响.针刺研究，1991，16：115-119.
, http://www.100md.com
[8]Levi-Montalcilni R.Nerve growth factor 35 years later.Science,1987,237:1154-1162.
[9]Ehlers M,Kaplan D,Price D,et al.NGF-stimulated retrograde transport of trkA in the mammalian nervous system.J Cell Biol,1995,130(1):149-156.
[10]Hiroshi F,Jonas F,Gisela B,et al.Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve.J Cell Biology,1993,123:455-465.
收稿日期：1999-07-07
修回日期：1999-09-21, http://www.100md.com
单位：牙祖蒙(中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院北三病房，北京 100041；)；王建华(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)；李忠禹(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)；谭颖徽(第三军医大学第二附属医院，重庆 630037)
关键词：穴位针刺；周围神经再生；面神经；神经营养因子
中国中医基础医学杂志000121 摘要：目的：观察穴位电针刺激对面神经再生过程中神经组织神经营养因子-3(NT-3)及其受体表达的影响。方法：日本大耳白兔面神经压榨伤后，电针刺激翳风、颧FDE2、地仓、颊车、四白、阳白、合谷穴，每天30min，2周为一疗程。设对照组。经一二三疗程治疗后，应用原位杂交及RT—PCR技术检测针刺组及对照组面神经组织中NT-3及TrkC mRNA表达水平的变化。结果：NT-3、TrkC受体表达高峰均在神经损伤后第6周；在相同时间点，针刺组NT-3、TrkC mRNA的表达明显高于对照组(P<0.05或0.01)。结论：在面神经再生过程中，穴位电针刺激能明显增强面神经组织中NT-3及TrkC mRNA的表达，这一分子水平的表现可能是穴位电针刺激促进面神经再生的机制之一。
, 百拇医药
中图分类号：R245.32+9 文献标识码：B
文章标号：1006-3250(2000)01-0070-03
Effects of Acupuncture on mRNA Expression of NT-3 and Trk C
Receptors during Facial Nerve Regenerating
YA Zu-meng
(Plastic Surgery Hospital,CAMS and PUMC Beijing 100041)
Wang Jian-hua Li Zhong-yu Tan Yin-hui
, 百拇医药
(Xinqiao Hospital,Third Military Medical college Chongqing 400037)
Abstract:Both right and left facial nerve of rabbits were crashed and the degree of the injury was Sunderland IV.Then the injuried rbbits were devided into treatment and the control group.One week after injury,pulse electroacupuncture stimulation on acupoint(PEASA) were performed in teratment group,while the control group was left recovering natruely.the involed acupoints included Yifeng,Quanliao,Jiache,Dicang,Sibai,Yangbai and Hegu.Two weeks to be a course of the treatment.In this experimental modle,we have showed facial nerve regeneration had been improved by acupointpunctrue pathologically and electro-physiologically.But on molecular level how about the effects of acupuncture on neurotrophic factors during the nerve regenerate.When the first(3w),second(6w),and third(9w) course of the treatment were finished we used in situ hybridiza-tion and RT-PCR technique to observe the changes of mRNA expression of NT-3 and Trk C receptors in facial nerve tissue.The results are as follows:(1)mRNA expression of NT-3 and TrkC receptors reaches the highest level in the sixth week post trauma in both treatment and control group;(2)in facial nerve tissue,expression level of mRNA for NT-3 and TrkC in treatment group were signifigantly higher than in the control group (P<0.01 or 0.05).This experiment result suggests some molecular mechanism about the effects of acupuncture on facial nerve regeneration.
, 百拇医药
Key words:peripheral nerve regeneration;facial nerve neurotrophic factors;acupunctrue.
穴位针刺用于Bell's面瘫的治疗已经有很长的历史，其疗效是公认的，但缺乏实验依据。而对外伤性面瘫，穴位针刺治疗是否有效?如果有效，其作用机制是什么?作者已在电生理及病理形态学方面证实了穴位电针刺激可促进面神经再生[1]。神经营养因子-3(NT-3)对运动神经的修复和再生至关重要。本文报道穴位电针刺激对NT-3及其TrkC受体表达影响。
材料与方法
1 动物及其分组
日本大耳白兔48只(第三军医大学实验动物所提供，合格证号：医动字第24301052号；环境设施合格证号：医动字第24302012号)，性别不限，年龄6～8个月，体重2.0kg～2.5kg。随机分成针刺组及对照组，每组24只。针刺组又分一疗程、二疗程、三疗程组，每组8只含16侧面神经(n=16)，对照组24只也分3个与一二三疗程组相对应的小组，每组n=16。
, http://www.100md.com
2 面神经压榨伤模型的制作
3%戊巴比妥钠(1ml/kg)静注麻醉，无菌操作解剖出双侧面神经颊支，以特制钳钳夹神经中部30s，松开30s后再夹30s[2]。所造成的损伤经病理证实均为Sunderland Ⅳ度损伤。缝合伤口，复苏。
3 穴位电针刺激[2]
神经损伤1周后，治疗组接受穴位电针刺激。取双侧翳风、颧FDE2、地仓、颊车、四白、阳白、合谷穴；2.0cm毫针经皮斜刺，深度1cm～1.5cm，用外科缝线将针耳固定于皮肤上；采用频率18～20的疏密波刺激，电压1.5V，每日治疗30min，每两周为一疗程，一二三疗程组疗量分别为1、2、3个疗程，每疗程间隔1周。对照组不接受任何治疗。
4 组织原位杂交
, 百拇医药 (1) 取材：各疗程组治疗一结束， 活杀动物， 迅速切取面神经核、 面神经颊支、 颊肌组织， 立即放于液氮中保存。 (2) 探针及其标记：由于NTFs及其受体核酸碱基序列各类哺乳动物间同源性达90%以上，故本实验以鼠NGF及Trk受体mRNA碱基序列为模板，用PCR软件(Primer Designer 1.0，Scientific Software 1990)加人工分析选择探针长度及序列，人工合成NT-3、TrkC寡聚脱氧核糖核酸探针，2探针序列分别为3′-GCCTTCTTG TACTTA ACCGTAGACA-5′，3′-CTACAGCAGGCTGACTGGATCCTTC-5′(由中国科学院上海细胞生物研究所合成提供)。用3′末端转移法地高辛标记(地高辛标记盒由宝林曼公司提供)。(3)杂交：从液氮中取出组织作冰冻切片，用漂浮法进行杂交[3]，设阴性对照，终止反应后裱片、染色，光镜观察。
5 RT—PCR[4、5]
, http://www.100md.com (1)引物设计及合成：同探针设计及合成，只是引物不标记。NT-3上游引物5′-GGTGATGTCCATCTTGTTTGATGTG-3′，下游引物3′-GCCTTCTTGTACTTAACCGTAGACA-5′。TrkC上游引物5′-ATGCTCGTCAGGACTTCCATCGTGA-3′，下游引物3′-CTACAGCAGGCTGACTGGATCCTTC-5′(由中国科学院上海细胞生物研究所合成提供)。(2)用异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA。(3)RNA含量及纯度鉴定OD260/OD280<1.7者再用酚—氯仿抽提纯化，OD260/OD280>2.0者提示有异硫氰酸胍污染，再用异丙醇沉淀。(4)用1%甲醛凝胶变性电泳法鉴定RNA的完整法。(5)反转录：按反转录试剂盒说明书进行(RT—PCR试剂盒为Sigma产品)。(6)PCR扩增：按RT—PCR试剂盒说明书进行。(7)1.5～2.0%琼脂糖电泳。(8)暗室照相。(9)电泳照片特异性扩增条带的积分光密度扫描。
结果
, http://www.100md.com 1 原位杂交
在同一组中，以神经损伤后第6周的杂交信号最强；在相同时间点上，NT-3、TrkC mRNA原位杂交信号在治疗组均比对照组强，其中以神经损伤后第6周的杂交信号差异最明显(见照片1a-d)。
图1 NT-3和Trk C原位杂交信号比较：a.对照组NT-3 40×；b.针刺组NT-3，40×；c.对照组Trk C,40×；d.针刺组TrkC,40×(第二疗程结束后，即神经伤后6周)。
图2 NT-3及Trk C受体mRNA RT-PCR电泳结果
对照组NT-3 ■ 针刺组NT-3 □ 对照组Nrk C 针刺组Trk C, http://www.100md.com
图3 不同时间NT-3、TrkC mRNA特异条带平均灰度(AGI)比较(P<0.05;0.01)
2 RT—PCR结果
电泳结果见照片2；扫描图像分析结果见图3。两组NT-3、TrkC受体表达高峰均在神经损伤后第6周；NT-3在神经损伤后第3、6、9周，TrkC在神经损伤后第6、9周，其mRNA的表达于针刺组均明显高于对照组(P<0.05或0.01)。
讨论
穴位电针刺激促进周围神经再生已有不少文献报道[6、7]。作者在以前的实验中，已用病理形态学和电生理学手段观察到穴位电针刺激能促进面神经再生[1]。但从神经分子生物学水平观察穴位针刺对周围神经损伤后再生有何影响，尚鲜有报道。神经营养因子(NTFs)对周围神经再生和修复具有重要作用，其主要成员包括神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3/4/5/6(NT-3/4/5/6)等。神经损伤后，雪旺氏细胞和靶组织合成NTFs能力增强，逆转运速度加快，通过与胞体中Trk系列受体高亲和力结合而引起神经营养效应。NTFs各成员中，对运动神经起营养支持作用的主要是BDNF和NT-3[8、9]，后者与TrkC受体结合而发挥作用。本实验结果显示，神经损伤后NT-3及其TrkC受体的表达水平增高，这与其他文献报道相吻合，属神经自我修复的反应[10]。更有趣的是，针刺组神经组织中NT-3及TrkC mRNA的表达水平均明显高于对照组。这些结果提示穴位电针刺激使表情肌及雪旺氏细胞NT-3产量提高，逆转运速率加快，同时其受体数量增多。这可能是穴位电针刺激促进面神经再生的分子生物学机制之一。至于穴位针刺通过何种途径引起这一效应，有待进一步研究。
, 百拇医药
这些实验结果为穴位电针刺激疗法的进一步广泛应用提供了依据。
作者简介：牙祖蒙(1965-)，男，广西人，1992年于第三军医大学获口腔颌面外科专业硕士学位，1992～1997年在第三军医大学第二附属医院口腔颌面外科工作，1993年晋升主治医师。1997年8月考入中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院(研究所)攻读整形外科临床医学博士学位，从师于国际知名的整形外科专家陈宗基教授。从事头面颈整复外科和美容外科研究。
参考文献
[1]牙祖蒙，王建华，李忠禹，等.穴位针刺对面神经再生影响的实验研究.针刺研究，1999，24(2)：111-114.
[2]牙祖蒙，王建华，李忠禹，等.穴位针刺对面神经再生影响的动物模型制作.实验动物科学与管理，1999，16(1)：15-17.
, http://www.100md.com
[3]蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社，1994.421-427.
[4]Vangerer M,Bohm M,Elce J,et al.Altered expression of β-aderenergic receptors in the failing human heart.Circulation,1993,87:454.
[5]陈建康，邹万忠，由江峰.半定量RT-PCR方法在基因表达研究中的应用.北京医科大学学报，1996，28(3)：171-173.
[6]孔天翰.电针对胫神经不同纤维成分再生的促进作用.针刺研究，1993，18：232-235.
[7]魏月娥.针刺对大鼠舌下神经切断后舌下神经核内神经元丧失的影响.针刺研究，1991，16：115-119.
, http://www.100md.com
[8]Levi-Montalcilni R.Nerve growth factor 35 years later.Science,1987,237:1154-1162.
[9]Ehlers M,Kaplan D,Price D,et al.NGF-stimulated retrograde transport of trkA in the mammalian nervous system.J Cell Biol,1995,130(1):149-156.
[10]Hiroshi F,Jonas F,Gisela B,et al.Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve.J Cell Biology,1993,123:455-465.
收稿日期：1999-07-07
修回日期：1999-09-21, http://www.100md.com