益肾健脾、活血利水方对肾小球系膜细胞分泌炎症介质的影响
作者：郭利平 张军平 杨洪涛
单位：郭利平(天津中医学院一附院，天津 300193)；张军平(天津中医学院一附院，天津 300193)；杨洪涛(天津中医学院一附院，天津 300193)
关键词：益肾健脾；活血利水；炎症介质；肾小球系膜细胞
摘要 摘要：目的：揭示益肾健脾、活血利水方药拮抗肾小球硬化作用途径。方法：通过肾小球系膜细胞(Gmc)体外培养技术，运用血清药理学方法，观察益肾健脾、活血利水方药对Gmc分泌白细胞介素1(IL—1)，白细胞介素6(IL—6)、肿瘤坏死因子(TNFα)、血小板活化因子(PAF)等多种炎症介质的影响，并以雷公藤多甙片为阳性药物对照。结果：益肾健脾、活血利水方药可以显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNF、PAF等炎症介质的分泌，且某些方面明显优于雷公藤多甙片。结论：本法方药通过干预炎症介质的释放，调节免疫机能，发挥了防治肾小球硬化作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(2000)01-0070-02
Eeperimental Study on Lnfluence of the Secretion of Lnflammatory Media of
Glomerulus Mesangial Cell by Drugs of Tonifying the Kidney to
Invigorate the Spleen and Promoting Blood Circulation to Induce Diuresis
Pathogenic Factors on Immune Funetion of the Related Diseases
, 百拇医药
GUO Li-ping, ZHANG Jun-pin, YANG Hong-tao
(First Teaching Hospital of Tianjin College of Traditional Chinese Medicine, Tianjing 300193)
Abstract:Objective:Purpose to study the mechanism of anti-cirrhosis of glomerulus by the drugs of tonifiging the Ridney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis. Methods:To use incubation in vitro to observe the influence by drugs of tonifying the Kidney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis to the secretion of interleukin 1(IL-1)、interleukin 6(IL-6)、tumon necrotic factor(TNFα) and platelet activating factor(PAT) of glomerulus mesangial cell (Gmc),and establish the control group.Results:The drugs of tonifying the kidney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis could restrain the sectetion of IL-1、IL-6、TNF and PAF,and in some respect the drugs is more effective than the control group. Conclusion:The mechanism of action of anti-cirrhosis of glomerulus by the drugs is to reduce the secretion of inflummatory media of Gmc.
, 百拇医药
Key words:Tonifying the kidney to invigorat the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis； inflummatory media；glomerulus mesangial cell.
已经证明，多种细胞因子是肾小球疾病的重要炎症介质，肾小球系膜细胞(Gmc)可以自分泌白细胞介素1(IL—1)、白细胞介素6(IL—6)、肿瘤坏死因子(NTFα)、血小板活化因子(PAF)等多种炎症介质，而这些因子反过来又可刺激Gmc增生和系膜基质的生成，在肾小球硬化发生、发展中发挥着重要作用[1]。本文观察了益肾健脾、活血利水方药对其影响，报告如下：
材料与方法
1 Gmc培养与鉴定
, 百拇医药
取SD大鼠分离肾皮质、剪碎、研磨过筛，收集肾小球并胶原酶消化后，以含20%胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮肾小球进行培养，待细胞铺满孔板后，再以胰酶消化进行传代，取第4代Gmc经抗胸腺细胞抗体，抗肌浆球蛋白抗体间接免疫荧兴显示阳性，证实所培养细胞为Gmc，用作实验是可靠的。
2 实验血清制备
2.1 空白血清
正常喂养、未经任何处理采取之大耳白兔血清。
2.2 中药血清
以仙灵脾、川芎、云苓组成具有益肾健脾、活血利水作用的中药复方，水煎浓缩后，灌饲大耳白兔连续12d，在服最后一剂后2h心脏采血，分离血清。
2.3 雷公藤多甙血清
, 百拇医药
以雷公藤多甙片灌饲大耳白兔连续12d，在服用最后一次2h后，心脏采血，分离血清。
3 实验步骤
生长稳定Gmc以胰酶—EDTA联合消化后，以无血清培养液制成细胞悬液，以3×104/ml浓度分种于24孔培养板中，2ml/孔，培养24h后，使细胞生长同步化，随机分组，加入相应的各种实验血清，浓度均为5%，再以胎牛血清补齐完全培养液，使含血清终浓度为10%，继续培养24h后，观察各项指标。
4 细胞因子测定
将上述制备的上清液倍比稀释后加入96孔培养板100μl/孔，加入相应的细胞株，继续培养72h，加入1mg/ml的MTT液50μg/孔，培养4h，加入1：300盐酸异丙醇，振荡，酶标仪上测定OD值，波长为570nm，绘出标准曲线，求出样品细胞因子活性。
, 百拇医药
4.1 白细胞介素(IL—1)
检测细胞株为LBRM33—IA5细胞，HT—2细胞。
4.2 白细胞介素6(IL—6)
检测细胞株为KD83细胞。
4.3 肿瘤坏死因子(TNFα)
细胞株为L929细胞。
结果判定，细胞毒效应(%)=(1-
4.4 血小板活化因子(PAF)
, 百拇医药
提取大耳白兔新鲜血血小板，用BSA—PBS配制血小板浓度为3×1011/L，标准PAF用BSA—PBS液做系列浓度的稀释(2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L)，分别诱导兔血小板聚集反应，以血小板最大聚集率为纵坐标，PAF浓度为横坐标，从而得到PAF诱导血小板聚集反应的标准曲线，加入待测样品的诱导剂，测定兔血小板的最大聚集率，根据标准曲线求出待测样品的PAF浓度。
结果
结果表明，本法方药与雷公藤多甙片作用相似，可显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNFα、PAF等细胞因子的分泌，与空白对照组比较均(P<0.01)，且对于TNFα的抑制作用优于雷公藤多甙片(P<0.05)。而且对于IL—6雷公藤多甙片无作用。
中药血清对Gmc多种细胞因子活性影响
, 百拇医药
组 别
样本数
(n)
IL—1
(u/ml)
IL—6
(u/ml)
TNFα
(细胞毒效应%)
PAF
(μg/ml)
空白对照组
7
, 百拇医药
30.57±4.69
49.57±13.03
20.38±5.55
11.11±1.04
雷公藤多甙组
9
19.44±4.82*
33.33±18.29
11.88±3.67*
8.94±0.88*
中药血清组
, http://www.100md.com
9
18.67±3.81*
23.67±3.04*
8.27±2.69*△
8.76±1.13*
注：*表示与空白组比较：P<0.01；△表示与雷公藤多甙比较：P<0.05。讨论
Gmc可自分泌IL—1、IL—6、TNFα、PAF等多种炎症介质，这些因子除了直接作用于细胞外，也可相互诱生，通过诱导其他介质而间接发挥作用，一方面可继续刺激Gmc增生，进而引起量的扩张；另一方面又可引起肾小球毛细血管收缩，血管壁通透性增强，促凝血，促进免疫复合物沉积，直接或间接损伤肾小球，促进胶原分泌，引起肾小球硬化。
, 百拇医药
雷公藤多甙片是我国独创的新型免疫抑制剂，已经有人证明：雷公藤多甙无论是体外直接作用于培养的小鼠Gmc，还是喂小鼠后取其含药血清添加于Gmc培养液中，均可以抑制Gmc增殖，显示其对Gmc增殖性疾病的治疗作用，而对于Gmc分泌细胞因子方面作用尚未见报。本文在观察益肾健脾、活血利水中药复方作用的同时，以雷公藤多甙片作为阳性药物对照。根据中医基础理论我们认为，脏腑亏虚、痰浊、水饮、瘀血相互胶结滞留是肾小球硬化的主要病机，拟定益肾健脾、活血利水方药，先前工作已经证明，本法方药可以显著抑制Gmc增殖及其细胞外基质的积聚，显示出良好的肾小球硬化拮抗效应[2]，而其对Gmc分泌多种细胞因子影响又如何呢?所以进行了本文研究。结果表明，本法方药可以显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNFα、PAF等多种炎症介质的分泌，且某些方面较雷公藤多甙片显示出了明显的优越性，说明益肾健脾、活血利水方药具有Gmc多种炎症介质的拮抗剂样作用，这也可能是本法方药防治肾小球硬化的有效途径之一，值得进一步研究。
, 百拇医药 作者简介：郭利平(1965-)，男(汉族)，天津中医学院一附院副主任医师，医学硕士，从事组织器官硬化的中医药防治研究。
参考文献
[1]罗琼.肾纤维化的防治进展.中华肾脏病杂志，1998，14(5)：334.
[2]郭利平，等.益肾健脾、活血利水方药对肾小球系膜细胞增殖及其细胞外基质影响.天津中医，1999，16(2)：30.
收稿日期：1999-06-24
修回日期：1999-08-10, 百拇医药
单位：郭利平(天津中医学院一附院，天津 300193)；张军平(天津中医学院一附院，天津 300193)；杨洪涛(天津中医学院一附院，天津 300193)
关键词：益肾健脾；活血利水；炎症介质；肾小球系膜细胞
摘要 摘要：目的：揭示益肾健脾、活血利水方药拮抗肾小球硬化作用途径。方法：通过肾小球系膜细胞(Gmc)体外培养技术，运用血清药理学方法，观察益肾健脾、活血利水方药对Gmc分泌白细胞介素1(IL—1)，白细胞介素6(IL—6)、肿瘤坏死因子(TNFα)、血小板活化因子(PAF)等多种炎症介质的影响，并以雷公藤多甙片为阳性药物对照。结果：益肾健脾、活血利水方药可以显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNF、PAF等炎症介质的分泌，且某些方面明显优于雷公藤多甙片。结论：本法方药通过干预炎症介质的释放，调节免疫机能，发挥了防治肾小球硬化作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(2000)01-0070-02
Eeperimental Study on Lnfluence of the Secretion of Lnflammatory Media of
Glomerulus Mesangial Cell by Drugs of Tonifying the Kidney to
Invigorate the Spleen and Promoting Blood Circulation to Induce Diuresis
Pathogenic Factors on Immune Funetion of the Related Diseases
, 百拇医药
GUO Li-ping, ZHANG Jun-pin, YANG Hong-tao
(First Teaching Hospital of Tianjin College of Traditional Chinese Medicine, Tianjing 300193)
Abstract:Objective:Purpose to study the mechanism of anti-cirrhosis of glomerulus by the drugs of tonifiging the Ridney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis. Methods:To use incubation in vitro to observe the influence by drugs of tonifying the Kidney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis to the secretion of interleukin 1(IL-1)、interleukin 6(IL-6)、tumon necrotic factor(TNFα) and platelet activating factor(PAT) of glomerulus mesangial cell (Gmc),and establish the control group.Results:The drugs of tonifying the kidney to invigorate the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis could restrain the sectetion of IL-1、IL-6、TNF and PAF,and in some respect the drugs is more effective than the control group. Conclusion:The mechanism of action of anti-cirrhosis of glomerulus by the drugs is to reduce the secretion of inflummatory media of Gmc.
, 百拇医药
Key words:Tonifying the kidney to invigorat the spleen and promoting blood circulation to induce diuresis； inflummatory media；glomerulus mesangial cell.
已经证明，多种细胞因子是肾小球疾病的重要炎症介质，肾小球系膜细胞(Gmc)可以自分泌白细胞介素1(IL—1)、白细胞介素6(IL—6)、肿瘤坏死因子(NTFα)、血小板活化因子(PAF)等多种炎症介质，而这些因子反过来又可刺激Gmc增生和系膜基质的生成，在肾小球硬化发生、发展中发挥着重要作用[1]。本文观察了益肾健脾、活血利水方药对其影响，报告如下：
材料与方法
1 Gmc培养与鉴定
, 百拇医药
取SD大鼠分离肾皮质、剪碎、研磨过筛，收集肾小球并胶原酶消化后，以含20%胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮肾小球进行培养，待细胞铺满孔板后，再以胰酶消化进行传代，取第4代Gmc经抗胸腺细胞抗体，抗肌浆球蛋白抗体间接免疫荧兴显示阳性，证实所培养细胞为Gmc，用作实验是可靠的。
2 实验血清制备
2.1 空白血清
正常喂养、未经任何处理采取之大耳白兔血清。
2.2 中药血清
以仙灵脾、川芎、云苓组成具有益肾健脾、活血利水作用的中药复方，水煎浓缩后，灌饲大耳白兔连续12d，在服最后一剂后2h心脏采血，分离血清。
2.3 雷公藤多甙血清
, 百拇医药
以雷公藤多甙片灌饲大耳白兔连续12d，在服用最后一次2h后，心脏采血，分离血清。
3 实验步骤
生长稳定Gmc以胰酶—EDTA联合消化后，以无血清培养液制成细胞悬液，以3×104/ml浓度分种于24孔培养板中，2ml/孔，培养24h后，使细胞生长同步化，随机分组，加入相应的各种实验血清，浓度均为5%，再以胎牛血清补齐完全培养液，使含血清终浓度为10%，继续培养24h后，观察各项指标。
4 细胞因子测定
将上述制备的上清液倍比稀释后加入96孔培养板100μl/孔，加入相应的细胞株，继续培养72h，加入1mg/ml的MTT液50μg/孔，培养4h，加入1：300盐酸异丙醇，振荡，酶标仪上测定OD值，波长为570nm，绘出标准曲线，求出样品细胞因子活性。
, 百拇医药
4.1 白细胞介素(IL—1)
检测细胞株为LBRM33—IA5细胞，HT—2细胞。
4.2 白细胞介素6(IL—6)
检测细胞株为KD83细胞。
4.3 肿瘤坏死因子(TNFα)
细胞株为L929细胞。
结果判定，细胞毒效应(%)=(1-
4.4 血小板活化因子(PAF)
, 百拇医药
提取大耳白兔新鲜血血小板，用BSA—PBS配制血小板浓度为3×1011/L，标准PAF用BSA—PBS液做系列浓度的稀释(2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L)，分别诱导兔血小板聚集反应，以血小板最大聚集率为纵坐标，PAF浓度为横坐标，从而得到PAF诱导血小板聚集反应的标准曲线，加入待测样品的诱导剂，测定兔血小板的最大聚集率，根据标准曲线求出待测样品的PAF浓度。
结果
结果表明，本法方药与雷公藤多甙片作用相似，可显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNFα、PAF等细胞因子的分泌，与空白对照组比较均(P<0.01)，且对于TNFα的抑制作用优于雷公藤多甙片(P<0.05)。而且对于IL—6雷公藤多甙片无作用。
中药血清对Gmc多种细胞因子活性影响
, 百拇医药
组 别
样本数
(n)
IL—1
(u/ml)
IL—6
(u/ml)
TNFα
(细胞毒效应%)
PAF
(μg/ml)
空白对照组
7
, 百拇医药
30.57±4.69
49.57±13.03
20.38±5.55
11.11±1.04
雷公藤多甙组
9
19.44±4.82*
33.33±18.29
11.88±3.67*
8.94±0.88*
中药血清组
, http://www.100md.com
9
18.67±3.81*
23.67±3.04*
8.27±2.69*△
8.76±1.13*
注：*表示与空白组比较：P<0.01；△表示与雷公藤多甙比较：P<0.05。讨论
Gmc可自分泌IL—1、IL—6、TNFα、PAF等多种炎症介质，这些因子除了直接作用于细胞外，也可相互诱生，通过诱导其他介质而间接发挥作用，一方面可继续刺激Gmc增生，进而引起量的扩张；另一方面又可引起肾小球毛细血管收缩，血管壁通透性增强，促凝血，促进免疫复合物沉积，直接或间接损伤肾小球，促进胶原分泌，引起肾小球硬化。
, 百拇医药
雷公藤多甙片是我国独创的新型免疫抑制剂，已经有人证明：雷公藤多甙无论是体外直接作用于培养的小鼠Gmc，还是喂小鼠后取其含药血清添加于Gmc培养液中，均可以抑制Gmc增殖，显示其对Gmc增殖性疾病的治疗作用，而对于Gmc分泌细胞因子方面作用尚未见报。本文在观察益肾健脾、活血利水中药复方作用的同时，以雷公藤多甙片作为阳性药物对照。根据中医基础理论我们认为，脏腑亏虚、痰浊、水饮、瘀血相互胶结滞留是肾小球硬化的主要病机，拟定益肾健脾、活血利水方药，先前工作已经证明，本法方药可以显著抑制Gmc增殖及其细胞外基质的积聚，显示出良好的肾小球硬化拮抗效应[2]，而其对Gmc分泌多种细胞因子影响又如何呢?所以进行了本文研究。结果表明，本法方药可以显著抑制Gmc对IL—1、IL—6、TNFα、PAF等多种炎症介质的分泌，且某些方面较雷公藤多甙片显示出了明显的优越性，说明益肾健脾、活血利水方药具有Gmc多种炎症介质的拮抗剂样作用，这也可能是本法方药防治肾小球硬化的有效途径之一，值得进一步研究。
, 百拇医药 作者简介：郭利平(1965-)，男(汉族)，天津中医学院一附院副主任医师，医学硕士，从事组织器官硬化的中医药防治研究。
参考文献
[1]罗琼.肾纤维化的防治进展.中华肾脏病杂志，1998，14(5)：334.
[2]郭利平，等.益肾健脾、活血利水方药对肾小球系膜细胞增殖及其细胞外基质影响.天津中医，1999，16(2)：30.
收稿日期：1999-06-24
修回日期：1999-08-10, 百拇医药