外源性透明质酸对创面愈合病理变化的影响
作者：吕洛 冷永成 章庆国 万伟东
单位：吕洛(第二军医大学长海医院烧伤科 上海，200433)； 冷永成(南京铁道医学院第一附属医院整形外科)； 章庆国(南京铁道医学院第一附属医院整形外科)； 万伟东(无锡市第三人民医院整形外科)
关键词：透明质酸；伤口愈合；瘢痕；成纤维细胞
江苏医药000211 摘 要：目的 探讨外源性透明质酸(hyaluronic acid,HA)在伤口愈合中可能的作用机制以及对瘢痕形成的影响。方法 大鼠45只,随机分成A、B、C(2%、1%HA溶液、PBS溶液)三组,观察伤口愈合过程中,创面平均愈合时间和残留面积的大小,大体形态以及组织学的改变。结果 (1)A、B、C三组的平均愈合时间分别为15.2天、14.2天和13.4天。A、B两组残留面积与C组比较有显著性差异,三组间比较也有显著性差异(P<0.01)。(2)组织学上,A、B两组成纤维细胞增生明显；胶原纤维较为纤细,排列整齐,直径较纤细。C组则显示出明显的炎性细胞浸润,新生血管数目增多。(3)HA的生物学作用与其浓度有关。结论 在伤口愈合过程中,外源性HA可通过对细胞的调控作用有效地发挥其生物学作用,减少瘢痕形成。
, 百拇医药
An experimental study in wound healing with exogenous hyaluronic acid
LU Luo
(Burn Center,Changhai Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200433)
LENG Yongcheng,ZHANG Qingguo,et al.
Abstract：Objective Evaluation of the effects of exogenous hyaluronic acid and possible mechanisms on wound healing in a model of incised wound of rat skin.Methods The rats were randomly divided into three groups which were treated with 1%,2% hyaluronan solution,and PBS as control.Wound areas were measured and a mean wound healing time was calculated.Samples of the repaired tissue from wounds were harvested for study under light and transmission electron microscopes.Results (1)Wound areas of control group were much smaller than these of HA-treated groups.The mean value of wound healing time was 15.2,14.2 and 13.4 days；(2)Histologically, when compared qualitatively with PBS controls,HA-treated wounds exhibited a less inflammatory response and angiogenesis,the fibroblasts proliferated significantly, and the collagen fibril was slender and arrayed in good order；(3)We found the result of treatment was correlated to the concentration of hyaluronan,i.e.,its efficacy presented a dose-dependent manner.Conclusion The study indicated that the exogenous hyaluronan can effectively inhibit collagen syntheses and improve scar quality on wound healing by its physiological function.
, 百拇医药
Key words：Hyaluronic acid Wound healing Scar Fibroblast▲
近年来,随着胎儿外科研究的逐步深入,透明质酸(HA)在伤口愈合中的作用倍受关注。研究发现,胎儿伤口无瘢痕愈合与其生长环境中富含透明质酸直接相关[1]。然而,在成人创面中,HA对组织纤维化形成的影响及其作用机制仍不十分清楚,本实验通过创伤动物模型的制作,在伤口局部应用透明质酸,探讨HA在伤口愈合中的生物学效应及其作用机制,为进一步临床应用提供理论依据。
材料和方法
一、动物创伤模型的制备和分组
健康SD大鼠45只,体质量200～250 g,雌雄各半。由南京铁道医学院实验动物中心提供。动物分笼饲养,统一饲料,自由饮食。动物背部剪毛后,涂硫化钠脱毛,温水清洗后拭干。次日用2%的戊巴比妥钠(4～5 mg/100 g体质量)腹腔注射麻醉后,常规消毒铺巾,用利刃在脊柱两侧旁开1 cm处,切取直径1.8 cm的圆形创面,深及深筋膜及部分肌层,止血后备用。2h后测定面积,经计算平均面积2.5 cm2。随机将动物分成A、B、C三组,每组15只动物。每只动物2个创面,共90个创面。
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二、HA溶液的制备和应用
HA(由上海生物制品研究所生产,相对分子量7.5×105,人脐带提取)称量后,在超净台内,用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH7.0)溶液,配制1%和2%的HA溶液。取2 cm×2 cm的无菌纱布2层,治疗组用0.2 ml的HA溶液(A、B两组HA浓度分别为2%,1%),浸湿后贴于每个创面上,再覆盖一层磺胺嘧啶银冷霜纱布(0.5 g/块纱布)后包扎。对照组(C组)PBS溶液0.2 ml,余同治疗组。创面每日换药一次,用药至伤后14天。
三、检测指标和标本的收集
在伤后2h及2、4、6、8、10天换药时通过描记结合照相技术,记录残余创面面积大小,以反映愈合速率；并通过记录各组实验动物创面的愈合时间,计算出平均愈合时间。在伤后3、7、10、14、21天,每组随机处死3只动物(6个创面),沿创缘切取全部组织,剪取皮下组织、剔除毛发,用作组织学和电镜检查。
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四、组织学检查
组织学标本用10%的福尔马林固定,制作常规石蜡切片,HE和胶原(Van Gie)染色,行光镜观察。电镜标本置入4%的戊二醛中固定。待标本收集齐后,逐级进行脱水、浸透、包埋和定位,制备超薄切片并染色。
五、统计学处理
所有数据以SAS软件进行t检验、方差分析及秩和检验等统计学处理。
结 果
一、形态学改变
愈合过程中,C组伤后可见创面边缘上皮及肉芽组织生长较快,表面凸凹不平,个别部位肉芽水肿明显,肉芽组织在伤后7天已基本充填创面。而A、B两组创面相对较为清洁,肉芽组织红嫩,呈现均匀微细的颗粒状,肉芽组织分别在伤后9、10天才充填创面。
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二、创面平均愈合时间和愈合面积
A、B、C三组创面平均愈合时间分别为15.2±2.0、14.2±1.6和13.4±1.4天。q检验结果显示,A、B两组与C组的平均愈合时间比较差异显著(P<0.05),A、B组间无显著性差异。创面愈合过程中,方差分析结果显示,各处理组不同时间点的残留面积存在显著性差异(P<0.01)。A、B两组残留创面面积大于C组。
三、组织学检查结果
1.光镜观察
HE染色：C组伤后5天、7天时显示幼稚性肉芽组织增生活跃,肉芽组织中有多量的新生毛细血管形成,血管内皮细胞增生、肥大。炎性细胞和成纤维细胞数目较多,成纤维细胞胞体较大,着色较深。伤后10天、14天时可见有多量着色较深的成纤维细胞和较粗大的胶原纤维形成,胶原纤维排列紊乱,血管增生异常活跃。A、B组伤后7天肉芽组织中显示少量新生毛细血管的形成,炎性细胞数目相对较少。伤后10天和14天可见较多着色较淡、成熟的成纤维细胞,和中等量的炎性细胞浸润。伤后21天可见排列相对整齐、稀疏的胶原纤维束。
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VG染色：A、B组伤后10天和14天时镜下胶原纤维排列整齐,较为纤细。而C组7天时即可见大量较为粗大、分布不均的桔红色胶原纤维增生,纤维排列相对紊乱。伤后21天时,比较发现A、B组中胶原纤维相对稀疏。
2.透射电镜超微结构观察
镜下可见C组7天和14天显示成纤维细胞核肥大,呈椭圆形或不规则状,核染色质丰富,浓密成块,胞浆内粗面内质网发达并可见个别内质网扩张,线粒体数量增加,周围可见多量的胶原纤维分布,纤维较为粗大,排列紊乱。新生微血管璧上可见到胞膜水肿、胞浆丰富的内皮细胞,胞核清晰,呈圆形和椭圆形。而A、B组10天和14天的超微结构显示,成纤维细胞数目较多,胞浆中异染色质较多,细胞器不发达,内质网和线粒体数量较少,周围成束排列的胶原纤维相对纤细,直径明显较C组小。
讨 论
一般认为,组织修复过程中,HA通过与靶细胞上的受体结合而发挥生物学作用。在胚胎创面的研究中已证实,HA通过促成纤维细胞的移动和增生,抑制其分化,而影响胶原的沉积；另外,HA还可作用于内皮细胞和巨噬细胞而影响新生血管的形成以及调整修复组织中胶原排列[2,3]。其次,在伤口愈合中,HA尚可通过抑制前列腺素E2的水平 、抑制炎性细胞的趋化性及吞噬作用和抑制氧自由基的产生[4]而发挥其抗炎作用。从本实验镜下观察可以看出,HA应用后实验组成纤维细胞的细胞数明显增加,胞内异染色质明显增多,但细胞器并无明显的增多,即大多呈“静止状态”,提示其分化及合成胶原的能力明显受到抑制。因此,我们认为,胶原合成的量与成纤维细胞的活性有直接的关系,与其细胞数无关；HA通过刺激成纤维细胞的增生、抑制其分化和增加成纤维细胞在基质中的移动,都是互为关联,相辅相成的生物反应过程。此外,实验结果也证明了HA抗炎和抑制新生血管形成的生物学作用。这些结果与国外有关文献的报道相近[5,6]。
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伤口愈合过程中,除了尽可能地加快创面愈合外,进一步确保愈合组织的质量,最大限度地恢复组织功能,才更符合现代创伤修复的观点。众所周知,组织中的胶原和成纤维细胞在创面收缩中有重要作用,成纤维细胞内的收缩成分是创面收缩力的主要来源[7]。有学者通过体外实验研究认为,在创伤修复中HA的主要作用并不在于调节创面的大小,而在于通过成纤维细胞的作用使胶原纤维基质(CFM)收缩减少,从而达到减少瘢痕形成的目的。有关HA抑制伤口收缩的可能机理,有人认为HA是作为一个屏障作用阻断了成纤维细胞与胶原蛋白之间的信息传递；或者是作为一个润滑剂加快了成纤维细胞的移动,有效地阻止了CFM的收缩[8,9]。这也可能就是本实验治疗组伤口愈合延迟的机制之一,从本实验伤口平均愈合时间看A、B组与C组比较差异显著；三组间残留面积比较也有显著差异,提示HA生物学作用具有剂量依赖性,为进一步指导临床应用提供了参考依据。
众多资料表明,HA作为细胞外基质的重要成分之一,在伤后可反应性升高,但很快随着酶解作用而下降[10]。本实验应用外源性HA,使其在创面局部维持一个较高的水平。结果表明,高浓度HA环境有利于细胞的增值和移动；通过其对胶原合成的调控作用,可有效地减少伤口愈合过程中愈合组织的纤维化的程度,从而达到了减少瘢痕形成的目的。■
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参考文献：
[1]Mast BA,Haynes JH,Krummel TM,et al.In vivo degradation of fetal wound hyaluronic acid results in increased fibroplasia,collagen deposition,and neovascularization.Plast Reconstr Surg,1992,89：503-514..
[2]Longaker MT,Harrison MR,Crombleholme TM,et al.Study in fetal wound healing：I.A factor in fetal serum that stimulates deposition of hyaluronic acid.J Pediatr Surg,1989,214：789-792.
[3]King SR,Hickerson WL,Proctor KG.Beneficial actions of exogenous hyaluronic acid on wound healing.Surgery,1991,109：76-84.
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[4]Goa KL,Benfield P.A review of its Pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology,and its therapeutic potential in joint disease and wound healing.Drug,1994,47：536-566.
[5]Turley EA.The role of a cell-associated hyaluronan-binding Protein in fibroblast behaviour.Ciba Found Symp,1989,143：121-133.
[6]SaSaki T,Watanabe C.Stimulation of osteoinduction in bone wound healing by high-molecular hyaluronic acid.Bone,1995,16：9-15.
, 百拇医药
[7]Korn J,Brinkerhoff CF,Edwards RL.Synthesis of PGE2,collagenese and tissue factor by fibroblast sustrains：Fibroblast sustrains are differentially activated for different metabolic marker.Collagen Related Res,1995,5：43-52.
[8]Huang LL,Wu JH,Nimni ME.Effects of hyaluronan on fibrillar matrix contraction by fibroblast.J Biomed Mater Res,1994,28：123-130.
[9]Ehrlich HP,Rajaratnam JB.Cell locomotion forces versus cell contraction forces for collagen lattice contraction：An in vitro model of wound contraction.Tissue Cell,1990,22：407-419.
[10]Longaker MT,Adzick NS.The biology of fetal wound healing：a review.Plast Reconstr Surg,1991,87：788-794.
收稿日期：1998-12-28
修稿日期：1999-06-13, http://www.100md.com
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关键词：透明质酸；伤口愈合；瘢痕；成纤维细胞
江苏医药000211 摘 要：目的 探讨外源性透明质酸(hyaluronic acid,HA)在伤口愈合中可能的作用机制以及对瘢痕形成的影响。方法 大鼠45只,随机分成A、B、C(2%、1%HA溶液、PBS溶液)三组,观察伤口愈合过程中,创面平均愈合时间和残留面积的大小,大体形态以及组织学的改变。结果 (1)A、B、C三组的平均愈合时间分别为15.2天、14.2天和13.4天。A、B两组残留面积与C组比较有显著性差异,三组间比较也有显著性差异(P<0.01)。(2)组织学上,A、B两组成纤维细胞增生明显；胶原纤维较为纤细,排列整齐,直径较纤细。C组则显示出明显的炎性细胞浸润,新生血管数目增多。(3)HA的生物学作用与其浓度有关。结论 在伤口愈合过程中,外源性HA可通过对细胞的调控作用有效地发挥其生物学作用,减少瘢痕形成。
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An experimental study in wound healing with exogenous hyaluronic acid
LU Luo
(Burn Center,Changhai Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200433)
LENG Yongcheng,ZHANG Qingguo,et al.
Abstract：Objective Evaluation of the effects of exogenous hyaluronic acid and possible mechanisms on wound healing in a model of incised wound of rat skin.Methods The rats were randomly divided into three groups which were treated with 1%,2% hyaluronan solution,and PBS as control.Wound areas were measured and a mean wound healing time was calculated.Samples of the repaired tissue from wounds were harvested for study under light and transmission electron microscopes.Results (1)Wound areas of control group were much smaller than these of HA-treated groups.The mean value of wound healing time was 15.2,14.2 and 13.4 days；(2)Histologically, when compared qualitatively with PBS controls,HA-treated wounds exhibited a less inflammatory response and angiogenesis,the fibroblasts proliferated significantly, and the collagen fibril was slender and arrayed in good order；(3)We found the result of treatment was correlated to the concentration of hyaluronan,i.e.,its efficacy presented a dose-dependent manner.Conclusion The study indicated that the exogenous hyaluronan can effectively inhibit collagen syntheses and improve scar quality on wound healing by its physiological function.
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Key words：Hyaluronic acid Wound healing Scar Fibroblast▲
近年来,随着胎儿外科研究的逐步深入,透明质酸(HA)在伤口愈合中的作用倍受关注。研究发现,胎儿伤口无瘢痕愈合与其生长环境中富含透明质酸直接相关[1]。然而,在成人创面中,HA对组织纤维化形成的影响及其作用机制仍不十分清楚,本实验通过创伤动物模型的制作,在伤口局部应用透明质酸,探讨HA在伤口愈合中的生物学效应及其作用机制,为进一步临床应用提供理论依据。
材料和方法
一、动物创伤模型的制备和分组
健康SD大鼠45只,体质量200～250 g,雌雄各半。由南京铁道医学院实验动物中心提供。动物分笼饲养,统一饲料,自由饮食。动物背部剪毛后,涂硫化钠脱毛,温水清洗后拭干。次日用2%的戊巴比妥钠(4～5 mg/100 g体质量)腹腔注射麻醉后,常规消毒铺巾,用利刃在脊柱两侧旁开1 cm处,切取直径1.8 cm的圆形创面,深及深筋膜及部分肌层,止血后备用。2h后测定面积,经计算平均面积2.5 cm2。随机将动物分成A、B、C三组,每组15只动物。每只动物2个创面,共90个创面。
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二、HA溶液的制备和应用
HA(由上海生物制品研究所生产,相对分子量7.5×105,人脐带提取)称量后,在超净台内,用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH7.0)溶液,配制1%和2%的HA溶液。取2 cm×2 cm的无菌纱布2层,治疗组用0.2 ml的HA溶液(A、B两组HA浓度分别为2%,1%),浸湿后贴于每个创面上,再覆盖一层磺胺嘧啶银冷霜纱布(0.5 g/块纱布)后包扎。对照组(C组)PBS溶液0.2 ml,余同治疗组。创面每日换药一次,用药至伤后14天。
三、检测指标和标本的收集
在伤后2h及2、4、6、8、10天换药时通过描记结合照相技术,记录残余创面面积大小,以反映愈合速率；并通过记录各组实验动物创面的愈合时间,计算出平均愈合时间。在伤后3、7、10、14、21天,每组随机处死3只动物(6个创面),沿创缘切取全部组织,剪取皮下组织、剔除毛发,用作组织学和电镜检查。
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四、组织学检查
组织学标本用10%的福尔马林固定,制作常规石蜡切片,HE和胶原(Van Gie)染色,行光镜观察。电镜标本置入4%的戊二醛中固定。待标本收集齐后,逐级进行脱水、浸透、包埋和定位,制备超薄切片并染色。
五、统计学处理
所有数据以SAS软件进行t检验、方差分析及秩和检验等统计学处理。
结 果
一、形态学改变
愈合过程中,C组伤后可见创面边缘上皮及肉芽组织生长较快,表面凸凹不平,个别部位肉芽水肿明显,肉芽组织在伤后7天已基本充填创面。而A、B两组创面相对较为清洁,肉芽组织红嫩,呈现均匀微细的颗粒状,肉芽组织分别在伤后9、10天才充填创面。
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二、创面平均愈合时间和愈合面积
A、B、C三组创面平均愈合时间分别为15.2±2.0、14.2±1.6和13.4±1.4天。q检验结果显示,A、B两组与C组的平均愈合时间比较差异显著(P<0.05),A、B组间无显著性差异。创面愈合过程中,方差分析结果显示,各处理组不同时间点的残留面积存在显著性差异(P<0.01)。A、B两组残留创面面积大于C组。
三、组织学检查结果
1.光镜观察
HE染色：C组伤后5天、7天时显示幼稚性肉芽组织增生活跃,肉芽组织中有多量的新生毛细血管形成,血管内皮细胞增生、肥大。炎性细胞和成纤维细胞数目较多,成纤维细胞胞体较大,着色较深。伤后10天、14天时可见有多量着色较深的成纤维细胞和较粗大的胶原纤维形成,胶原纤维排列紊乱,血管增生异常活跃。A、B组伤后7天肉芽组织中显示少量新生毛细血管的形成,炎性细胞数目相对较少。伤后10天和14天可见较多着色较淡、成熟的成纤维细胞,和中等量的炎性细胞浸润。伤后21天可见排列相对整齐、稀疏的胶原纤维束。
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VG染色：A、B组伤后10天和14天时镜下胶原纤维排列整齐,较为纤细。而C组7天时即可见大量较为粗大、分布不均的桔红色胶原纤维增生,纤维排列相对紊乱。伤后21天时,比较发现A、B组中胶原纤维相对稀疏。
2.透射电镜超微结构观察
镜下可见C组7天和14天显示成纤维细胞核肥大,呈椭圆形或不规则状,核染色质丰富,浓密成块,胞浆内粗面内质网发达并可见个别内质网扩张,线粒体数量增加,周围可见多量的胶原纤维分布,纤维较为粗大,排列紊乱。新生微血管璧上可见到胞膜水肿、胞浆丰富的内皮细胞,胞核清晰,呈圆形和椭圆形。而A、B组10天和14天的超微结构显示,成纤维细胞数目较多,胞浆中异染色质较多,细胞器不发达,内质网和线粒体数量较少,周围成束排列的胶原纤维相对纤细,直径明显较C组小。
讨 论
一般认为,组织修复过程中,HA通过与靶细胞上的受体结合而发挥生物学作用。在胚胎创面的研究中已证实,HA通过促成纤维细胞的移动和增生,抑制其分化,而影响胶原的沉积；另外,HA还可作用于内皮细胞和巨噬细胞而影响新生血管的形成以及调整修复组织中胶原排列[2,3]。其次,在伤口愈合中,HA尚可通过抑制前列腺素E2的水平 、抑制炎性细胞的趋化性及吞噬作用和抑制氧自由基的产生[4]而发挥其抗炎作用。从本实验镜下观察可以看出,HA应用后实验组成纤维细胞的细胞数明显增加,胞内异染色质明显增多,但细胞器并无明显的增多,即大多呈“静止状态”,提示其分化及合成胶原的能力明显受到抑制。因此,我们认为,胶原合成的量与成纤维细胞的活性有直接的关系,与其细胞数无关；HA通过刺激成纤维细胞的增生、抑制其分化和增加成纤维细胞在基质中的移动,都是互为关联,相辅相成的生物反应过程。此外,实验结果也证明了HA抗炎和抑制新生血管形成的生物学作用。这些结果与国外有关文献的报道相近[5,6]。
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伤口愈合过程中,除了尽可能地加快创面愈合外,进一步确保愈合组织的质量,最大限度地恢复组织功能,才更符合现代创伤修复的观点。众所周知,组织中的胶原和成纤维细胞在创面收缩中有重要作用,成纤维细胞内的收缩成分是创面收缩力的主要来源[7]。有学者通过体外实验研究认为,在创伤修复中HA的主要作用并不在于调节创面的大小,而在于通过成纤维细胞的作用使胶原纤维基质(CFM)收缩减少,从而达到减少瘢痕形成的目的。有关HA抑制伤口收缩的可能机理,有人认为HA是作为一个屏障作用阻断了成纤维细胞与胶原蛋白之间的信息传递；或者是作为一个润滑剂加快了成纤维细胞的移动,有效地阻止了CFM的收缩[8,9]。这也可能就是本实验治疗组伤口愈合延迟的机制之一,从本实验伤口平均愈合时间看A、B组与C组比较差异显著；三组间残留面积比较也有显著差异,提示HA生物学作用具有剂量依赖性,为进一步指导临床应用提供了参考依据。
众多资料表明,HA作为细胞外基质的重要成分之一,在伤后可反应性升高,但很快随着酶解作用而下降[10]。本实验应用外源性HA,使其在创面局部维持一个较高的水平。结果表明,高浓度HA环境有利于细胞的增值和移动；通过其对胶原合成的调控作用,可有效地减少伤口愈合过程中愈合组织的纤维化的程度,从而达到了减少瘢痕形成的目的。■
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[1]Mast BA,Haynes JH,Krummel TM,et al.In vivo degradation of fetal wound hyaluronic acid results in increased fibroplasia,collagen deposition,and neovascularization.Plast Reconstr Surg,1992,89：503-514..
[2]Longaker MT,Harrison MR,Crombleholme TM,et al.Study in fetal wound healing：I.A factor in fetal serum that stimulates deposition of hyaluronic acid.J Pediatr Surg,1989,214：789-792.
[3]King SR,Hickerson WL,Proctor KG.Beneficial actions of exogenous hyaluronic acid on wound healing.Surgery,1991,109：76-84.
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[4]Goa KL,Benfield P.A review of its Pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology,and its therapeutic potential in joint disease and wound healing.Drug,1994,47：536-566.
[5]Turley EA.The role of a cell-associated hyaluronan-binding Protein in fibroblast behaviour.Ciba Found Symp,1989,143：121-133.
[6]SaSaki T,Watanabe C.Stimulation of osteoinduction in bone wound healing by high-molecular hyaluronic acid.Bone,1995,16：9-15.
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[7]Korn J,Brinkerhoff CF,Edwards RL.Synthesis of PGE2,collagenese and tissue factor by fibroblast sustrains：Fibroblast sustrains are differentially activated for different metabolic marker.Collagen Related Res,1995,5：43-52.
[8]Huang LL,Wu JH,Nimni ME.Effects of hyaluronan on fibrillar matrix contraction by fibroblast.J Biomed Mater Res,1994,28：123-130.
[9]Ehrlich HP,Rajaratnam JB.Cell locomotion forces versus cell contraction forces for collagen lattice contraction：An in vitro model of wound contraction.Tissue Cell,1990,22：407-419.
[10]Longaker MT,Adzick NS.The biology of fetal wound healing：a review.Plast Reconstr Surg,1991,87：788-794.
收稿日期：1998-12-28
修稿日期：1999-06-13, http://www.100md.com