神经生长抑制因子Collapsin-1的致萎缩活性可被它的抗体所阻断
作者：丁新生 都爱莲 邓晓萱 姚娟 程虹
单位：丁新生(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 都爱莲(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 邓晓萱(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 姚娟(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 程虹(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)
关键词：Collapsin-1；抗血清；致萎缩活性
江苏医药000203 摘 要：目的 制备鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1的抗体并检测它对Collapsin-1致萎缩活性的阻断作用。方法 PCR扩增并克隆表达整合了c-myc表位的Collapsin-1全码序列,用所得的重组Collapsin-1免疫兔制备它的抗体。背根神经节(DRG)培养物检测它们对生长抑制因子Collapsin-1致萎缩活性的阻滞作用。结果 Collapsin-1能导致DRG生长冠萎缩,这种致萎缩活性能被Collapsin-1的抗体所阻断。结论 所制备的抑制因子Collapsin-1的抗体具有阻断其抑制活性的作用。
, 百拇医药
The collapsing activity of a neuron growth inhibitor-collapsing-1 can be neutralized by its antibody
DING Xinsheng,DU Ailian,DENG Xiaoxuan,et al.
(Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
Abstract：Objective To prepare the antiserum of achicken-brain-derived neuron growth inhibitor collapsin-1 and to detect its ability to neutrolize the collapsing activity of collapsin-1.Methods The c-myc epitope taged entire sequence of collapsin-1 was amplified by PCR and expression cloned.The rabbits was immunized with the c-myc-taged collapsin-1 to produce antiserum of collapsin-1.Its ability to neutrolize the collapsing activity of collapsin-1 was observed in DRG growth cone.Results Collapsin-1 could induce the collapse of DRG growth cone.The collapsing activity of collapsin-1 can be neutrolized by antiserum of collapsin-1.Conclusion The antibody of a neuron growth inhibitor-collapsin-1 can block its inhibiting function.
, 百拇医药
Key words：Collapsin-1 Antiserum Collapsing activity▲
神经系统的正常发育和生长是其周围环境中不同信号因子共同作用的结果。近年的研究发现：这些因子包括靶部位分泌的特异性神经轴突生长吸引因子(neuron growth attractants)和非靶部位分泌的轴突生长抑制因子(neuron growth inhibitors)[1]。这些因子的共同作用诱导不同类型的轴突精确地投射到靶部位,构成复杂有序的神经网络。
1993年,Luo等[2]第一次提取了成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1。SemaphorinⅢ(以下简称sema)和semaD分别是它在人和大鼠中的同源物[3],三者的分子结构有90%以上的同源性。最近,我们在美国同道的协助下,提取和纯化了成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1,并制备了它的抗体。发现Collapsin-1导致生长冠萎缩的活性可被它的抗体所阻断,这一结果对于中枢神经再生方面的研究很有意义。
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材料和方法
一、天然Collapsin-1的提取
按照Luo[2]等提供的方法提取成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1(具体过程另文发表)。简言之,新鲜鸡脑膜粗提物依次通过Q-Sepherose阴离子交换柱、S-Sepherose阳离子交换柱、WGA凝胶亲和柱、Mono S阳离子交换柱分离纯化,再通过SDS-PAGE电泳进一步分离并洗脱分子量为100KD的蛋白质,背根神经节(DRG)培养物检测它导致生长冠萎缩的活性。
二、重组Collapsin-1的制备
BLAST程序[4]查找鸡Collapsin-1的编码序列,用整合了c-myc表位的Collapsin-1全码序列转化杆状病毒载体PVL1392,按照Pharmingen公司提供的说明在昆虫细胞中表达。用抗c-myc的单抗9E10(Evan)[5]筛选出阳性克隆。培养3天以后,收集培养液通过S-Sepherose阳离子交换柱以提取分泌在其中的重组Collapsin-1,再通过抗-9E10二抗亲和柱纯化,即得重组Collapsin-1。
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三、Collapsin-1抗血清的制备
用这种重组Collapsin-1免疫兔,剂量每2周100 μg/次,共4次。收集免疫前和免疫后血清,蛋白A纯化以后,Western Blot检测它对重组Collapsin-1的识别能力。能识别重组Collapsin-1的抗血清即为抗Collapsin-1的抗血清。取500 μg抗血清与10 μg纯的重组Collapsin-1室温下孵育2h,之后加入抗c-myc亲和柱中孵育3h,高盐PBS冲洗以制备去除抗体的抗血清。将这些免疫前血清、抗血清和去除抗体的抗血清留作致萎缩功能阻滞实验。
四、致萎缩功能阻滞实验
按照Fan[6]提供的方法(具体过程另文发表)培养DRG细胞。简言之,取E7DRG剪成小块,置于Laminin包被的盖片上,一起放入含F-12标准培养液的12孔板中,37℃CO2环境中培养24h。取重组和天然的Collapsin-1分别加入各孔中对其生长冠进行致萎缩功能检测。发生萎缩的培养物少部分染色固定,大部分留作致萎缩功能阻滞实验。为使显色明显,用2 u/ml的若丹明-毒伞素对生长冠染色30分钟,冲洗后荧光固定液G固定。将Collapsin-1的免疫前血清、抗血清、去除抗体的抗血清分别加入发生萎缩的DRG培养物中,37℃下温育30分钟,染色同上。
, 百拇医药
结 果
致萎缩功能的观察与评定
正常的生长冠末端膨大成帆幕状,有突起向四周伸展。加入神经生长抑制因子后生长冠末端萎缩。突起消失,状如枯枝。加入抗-Collapsin-1的抗血清以后,原来萎缩的生长冠又重新伸展,而加入它的免疫前血清和去除抗体的抗血清对萎缩反应没有影响。所以,我们的结果是：天然的和重组的Collapsin-1都能导致生长冠的萎缩。这种致萎缩活性可被抗-Collapsin-1的抗体所阻断,而它的免疫前血清和去除抗体的抗血清均不能阻断Collapsin-1的致萎缩活性。
讨 论
我们制备抗体所用的抗原是整合了c-myc表位的Collapsin-1编码序列的直接产物,经抗c-myc的单抗进行筛选,保证了抗原的纯正性。所得的抗血清在Western Blot中能识别重组Collapsin-1,证明里面存在Collapsin-1的抗体。该抗血清加入发生萎缩后的DRG培养物中,原来发生萎缩的生长冠又重新伸展。这些结果说明：我们所制备的抗体就是Collapsin-1的抗体,它对Collapsin-1的致萎缩活性具有阻滞作用。
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Collapsin-1是成年鸡脑膜中提取的一种分泌型糖蛋白,它能导致DRG轴突生长方向的逆转和生长冠的萎缩[2]。在胚胎发育的特定时期内,它高度表达在脊髓的腹侧,阻止背侧投射性的皮肤感觉轴突向腹侧生长,而对腹侧投射性的肌支则无影响[7]。近来研究证明,其mRNA在胚胎发育期的皮层下白质、海马及小脑等结构中都有较高水平的表达[8],提示它对这些结构的轴突网络的形成具有重要作用。Collapsin-1在成年期CNS中的作用还不太清楚,推测它与正常轴突环路的维持及阻止异常轴突的长出有关。同时,也有理由相信,神经生长抑制因子在阻止中枢神经损伤后的再生中也起着关键的作用。
这里,我们制备了神经生长抑制因子Collapsin-1的抗体,为解决中枢神经损伤后的再生问题开辟了一条新的途径。我们可以外源性地给予抑制因子的单抗或者通过转基因的方式在体内暂时性地表达抑制因子的抗体,解除抑制因子对中枢神经再生的抑制作用,从而促进损伤后中枢神经的再生。对这方面的深入研究具有深远的临床意义。■
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基金项目：本课题为国家自然科学基金(39840011)和江苏省自然科学基金(BK97057)资助项
目
参考文献：
[1]Keynes R,Geaffrey MWC.Axon guidance molecules.Cell,1995,83：161-169.
[2]Luo YL,Raible D,Raper JA.Collapsin：a protein in brain that induces the collapse of paralysis of neuronal growth cones.Cell,1993,75：217-227.
[3]Messersmith EK,Leonardo ED,Shatz CJ,et al.Semaphorin Ⅲ can function as a selective chemorepellent to pattern sensory projections in the spinal cord.Neuron,1995,14：949-959.
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[4]Altschul SF,Gish W,Miller W,et al.Basic local alignment searth tool.J Mol Biol,1990,215：403-410.
[5]Evan GI,Lewis GK,Ramsay G,et al.Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product.Mol Cell Biol,1985,5：3610-3616.
[6]Fan JH,Mansfield SG,Remond T,et al.The orgnization of F-actin and microtubules in growth cones exposed to abrain-derived collapsing factor.J Cell Biol,1993,121：867-878.
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[7]Shepherd LT,Luo YL,Lefcort F,et al.A sensory axon repellent secreted from ventral spinal cord explants is neutrolized by antibodies against collapsin-1.Development,1997,124：1377-1385.
[8]Luo YL,Shepherd I,Li J,et al.A family of molecules related to collapsin in the embryoic chicken nervous system.Neuron,1995,14：1131-1140.
收稿日期：1999-10-09
修稿日期：1999-10-20, 百拇医药
单位：丁新生(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 都爱莲(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 邓晓萱(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 姚娟(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)； 程虹(南京医科大学第一附属医院神经内科 210029)
关键词：Collapsin-1；抗血清；致萎缩活性
江苏医药000203 摘 要：目的 制备鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1的抗体并检测它对Collapsin-1致萎缩活性的阻断作用。方法 PCR扩增并克隆表达整合了c-myc表位的Collapsin-1全码序列,用所得的重组Collapsin-1免疫兔制备它的抗体。背根神经节(DRG)培养物检测它们对生长抑制因子Collapsin-1致萎缩活性的阻滞作用。结果 Collapsin-1能导致DRG生长冠萎缩,这种致萎缩活性能被Collapsin-1的抗体所阻断。结论 所制备的抑制因子Collapsin-1的抗体具有阻断其抑制活性的作用。
, 百拇医药
The collapsing activity of a neuron growth inhibitor-collapsing-1 can be neutralized by its antibody
DING Xinsheng,DU Ailian,DENG Xiaoxuan,et al.
(Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
Abstract：Objective To prepare the antiserum of achicken-brain-derived neuron growth inhibitor collapsin-1 and to detect its ability to neutrolize the collapsing activity of collapsin-1.Methods The c-myc epitope taged entire sequence of collapsin-1 was amplified by PCR and expression cloned.The rabbits was immunized with the c-myc-taged collapsin-1 to produce antiserum of collapsin-1.Its ability to neutrolize the collapsing activity of collapsin-1 was observed in DRG growth cone.Results Collapsin-1 could induce the collapse of DRG growth cone.The collapsing activity of collapsin-1 can be neutrolized by antiserum of collapsin-1.Conclusion The antibody of a neuron growth inhibitor-collapsin-1 can block its inhibiting function.
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Key words：Collapsin-1 Antiserum Collapsing activity▲
神经系统的正常发育和生长是其周围环境中不同信号因子共同作用的结果。近年的研究发现：这些因子包括靶部位分泌的特异性神经轴突生长吸引因子(neuron growth attractants)和非靶部位分泌的轴突生长抑制因子(neuron growth inhibitors)[1]。这些因子的共同作用诱导不同类型的轴突精确地投射到靶部位,构成复杂有序的神经网络。
1993年,Luo等[2]第一次提取了成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1。SemaphorinⅢ(以下简称sema)和semaD分别是它在人和大鼠中的同源物[3],三者的分子结构有90%以上的同源性。最近,我们在美国同道的协助下,提取和纯化了成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1,并制备了它的抗体。发现Collapsin-1导致生长冠萎缩的活性可被它的抗体所阻断,这一结果对于中枢神经再生方面的研究很有意义。
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材料和方法
一、天然Collapsin-1的提取
按照Luo[2]等提供的方法提取成年鸡脑源性神经生长抑制因子Collapsin-1(具体过程另文发表)。简言之,新鲜鸡脑膜粗提物依次通过Q-Sepherose阴离子交换柱、S-Sepherose阳离子交换柱、WGA凝胶亲和柱、Mono S阳离子交换柱分离纯化,再通过SDS-PAGE电泳进一步分离并洗脱分子量为100KD的蛋白质,背根神经节(DRG)培养物检测它导致生长冠萎缩的活性。
二、重组Collapsin-1的制备
BLAST程序[4]查找鸡Collapsin-1的编码序列,用整合了c-myc表位的Collapsin-1全码序列转化杆状病毒载体PVL1392,按照Pharmingen公司提供的说明在昆虫细胞中表达。用抗c-myc的单抗9E10(Evan)[5]筛选出阳性克隆。培养3天以后,收集培养液通过S-Sepherose阳离子交换柱以提取分泌在其中的重组Collapsin-1,再通过抗-9E10二抗亲和柱纯化,即得重组Collapsin-1。
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三、Collapsin-1抗血清的制备
用这种重组Collapsin-1免疫兔,剂量每2周100 μg/次,共4次。收集免疫前和免疫后血清,蛋白A纯化以后,Western Blot检测它对重组Collapsin-1的识别能力。能识别重组Collapsin-1的抗血清即为抗Collapsin-1的抗血清。取500 μg抗血清与10 μg纯的重组Collapsin-1室温下孵育2h,之后加入抗c-myc亲和柱中孵育3h,高盐PBS冲洗以制备去除抗体的抗血清。将这些免疫前血清、抗血清和去除抗体的抗血清留作致萎缩功能阻滞实验。
四、致萎缩功能阻滞实验
按照Fan[6]提供的方法(具体过程另文发表)培养DRG细胞。简言之,取E7DRG剪成小块,置于Laminin包被的盖片上,一起放入含F-12标准培养液的12孔板中,37℃CO2环境中培养24h。取重组和天然的Collapsin-1分别加入各孔中对其生长冠进行致萎缩功能检测。发生萎缩的培养物少部分染色固定,大部分留作致萎缩功能阻滞实验。为使显色明显,用2 u/ml的若丹明-毒伞素对生长冠染色30分钟,冲洗后荧光固定液G固定。将Collapsin-1的免疫前血清、抗血清、去除抗体的抗血清分别加入发生萎缩的DRG培养物中,37℃下温育30分钟,染色同上。
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结 果
致萎缩功能的观察与评定
正常的生长冠末端膨大成帆幕状,有突起向四周伸展。加入神经生长抑制因子后生长冠末端萎缩。突起消失,状如枯枝。加入抗-Collapsin-1的抗血清以后,原来萎缩的生长冠又重新伸展,而加入它的免疫前血清和去除抗体的抗血清对萎缩反应没有影响。所以,我们的结果是：天然的和重组的Collapsin-1都能导致生长冠的萎缩。这种致萎缩活性可被抗-Collapsin-1的抗体所阻断,而它的免疫前血清和去除抗体的抗血清均不能阻断Collapsin-1的致萎缩活性。
讨 论
我们制备抗体所用的抗原是整合了c-myc表位的Collapsin-1编码序列的直接产物,经抗c-myc的单抗进行筛选,保证了抗原的纯正性。所得的抗血清在Western Blot中能识别重组Collapsin-1,证明里面存在Collapsin-1的抗体。该抗血清加入发生萎缩后的DRG培养物中,原来发生萎缩的生长冠又重新伸展。这些结果说明：我们所制备的抗体就是Collapsin-1的抗体,它对Collapsin-1的致萎缩活性具有阻滞作用。
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Collapsin-1是成年鸡脑膜中提取的一种分泌型糖蛋白,它能导致DRG轴突生长方向的逆转和生长冠的萎缩[2]。在胚胎发育的特定时期内,它高度表达在脊髓的腹侧,阻止背侧投射性的皮肤感觉轴突向腹侧生长,而对腹侧投射性的肌支则无影响[7]。近来研究证明,其mRNA在胚胎发育期的皮层下白质、海马及小脑等结构中都有较高水平的表达[8],提示它对这些结构的轴突网络的形成具有重要作用。Collapsin-1在成年期CNS中的作用还不太清楚,推测它与正常轴突环路的维持及阻止异常轴突的长出有关。同时,也有理由相信,神经生长抑制因子在阻止中枢神经损伤后的再生中也起着关键的作用。
这里,我们制备了神经生长抑制因子Collapsin-1的抗体,为解决中枢神经损伤后的再生问题开辟了一条新的途径。我们可以外源性地给予抑制因子的单抗或者通过转基因的方式在体内暂时性地表达抑制因子的抗体,解除抑制因子对中枢神经再生的抑制作用,从而促进损伤后中枢神经的再生。对这方面的深入研究具有深远的临床意义。■
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基金项目：本课题为国家自然科学基金(39840011)和江苏省自然科学基金(BK97057)资助项
目
参考文献：
[1]Keynes R,Geaffrey MWC.Axon guidance molecules.Cell,1995,83：161-169.
[2]Luo YL,Raible D,Raper JA.Collapsin：a protein in brain that induces the collapse of paralysis of neuronal growth cones.Cell,1993,75：217-227.
[3]Messersmith EK,Leonardo ED,Shatz CJ,et al.Semaphorin Ⅲ can function as a selective chemorepellent to pattern sensory projections in the spinal cord.Neuron,1995,14：949-959.
, http://www.100md.com
[4]Altschul SF,Gish W,Miller W,et al.Basic local alignment searth tool.J Mol Biol,1990,215：403-410.
[5]Evan GI,Lewis GK,Ramsay G,et al.Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product.Mol Cell Biol,1985,5：3610-3616.
[6]Fan JH,Mansfield SG,Remond T,et al.The orgnization of F-actin and microtubules in growth cones exposed to abrain-derived collapsing factor.J Cell Biol,1993,121：867-878.
, http://www.100md.com
[7]Shepherd LT,Luo YL,Lefcort F,et al.A sensory axon repellent secreted from ventral spinal cord explants is neutrolized by antibodies against collapsin-1.Development,1997,124：1377-1385.
[8]Luo YL,Shepherd I,Li J,et al.A family of molecules related to collapsin in the embryoic chicken nervous system.Neuron,1995,14：1131-1140.
收稿日期：1999-10-09
修稿日期：1999-10-20, 百拇医药