肾病综合征患儿环孢素亲合素基因表达的分析
作者：夏正坤 刘光陵 高远赋 王晓燕 伏洁 张连丰 傅元凤 樊忠民
单位：夏正坤(南京军区南京总医院儿科 210002)； 刘光陵(南京军区南京总医院儿科 210002)； 高远赋(南京军区南京总医院儿科 210002)； 王晓燕(南京军区南京总医院儿科 210002)； 伏洁(南京军区南京总医院儿科 210002)； 张连丰(南京军区南京总医院儿科 210002)； 傅元凤(南京军区南京总医院儿科 210002)； 樊忠民(南京军区南京总医院儿科 210002)
关键词：环孢素亲合素；环孢霉素A；基因表达；肾病综合征
江苏医药000202 摘 要：目的 环孢素亲合素(cyclophilin,CyP)是细胞内环孢霉素A(CsA)的受体,探讨CyP在肾病综合征患儿中基因表达及临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定28例肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA的表达,并以正常儿童作对照。结果 CyP碱基对408bp与β-Actin条带234bp可清晰区分。不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平无差异,同时发现肾病综合征患儿急性期血白细胞中CyP基因表达水平明显高于恢复期与对照组。结论 肾病综合征患儿急性期有高水平的CyP mRNA表达,在此时给予合适剂量环孢素亲合素的反应物(如CsA治疗)可促进肾病综合征的缓解。
, http://www.100md.com
The study of expression of cyclophilin mRNA in child nephrotic syndrome
XIA Zhengkun,LIU Guangling,GAO Yuanfu,et al.
(Department of Pediatrics,Nanjing General Hospital of PLA,Nanjing 210002)
Abstract：Objective To investigate the role and expression of cyclophilin(CyP)gene,receptor of cyclosporin A(CsA),in child nephrotic syndrome.Methods The authors studied the expression of CyP gene from white blood cells in children with nephrotic syndrome by reverse transcription polymerase chain reaction.Results It was shown that the base of CyP is helpful in differentiating 408bp from β-Actin(234bp).The results also showed that the expression of CyP gene from white blood cells in children nephrotic syndrome in acute stage was significantly higher than those in restoring stage and those of controls.Conclusion These findings revealed a high level expression of CyP mRNA was observed in the acute stage of nephrotic syndrome,during which if timely CsA treatment at proper dosage is given,there might be a good prospect of remission of the disease.
, 百拇医药
Key words：Cyclophilin Cyclosporin A Gene expression Nephrotic syndrome▲
环孢素亲合素(CyP)是细胞内环孢霉素A(CsA)的主要结合蛋白质,广泛存在于生物体内。本文使用逆转录聚合酶链反应测定儿童肾病综合征患儿血白细胞由CyP mRNA的表达,探讨CyP在肾病综合征患儿中基因表达及临床意义。
材料与方法
一、临床资料
28例肾病综合征患儿为1995年12月至1997年11月住院的患儿,男15例,平均年龄6.9岁,女13例,平均年龄8.1岁。其中7例为激素依赖,15例频繁复发,6例对激素耐药,20例病儿给予CsA治疗,所有患儿均无肝肾功能的异常。诊断符合全国儿科肾脏病科研协作组制定的诊断标准[1]。对照组随机选取正常儿童20例,男10例,平均年龄8.5岁,女10例,平均年龄7岁。
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二、试剂
RNA抽提试剂盒(美国GIBCOBRL公司),RT-PCR试剂盒(英国PROMEGA),PCR Marker(上海华美生物工程公司),引物由大连宝生物工程公司合成。
二条引物序列分别为：
CyP C15′TCTTCTTGCTGGTCTTGCC,C25′TCTCCTTTGAGCTGTTTGC；
β-Actin A15′CTTCCTGGGCATGGAGTC,A25′GCCGATCCACACGGAGTA。
三、方法
1.外周血RNA的抽提：全血2 ml稀释后,铺入1ml淋巴细胞分离液,4 000r/min离心10分钟,吸取白细胞层,12 000r/min离心5分钟弃上清,调整细胞浓度为5×106个细胞,标本分别加入RNA抽提液,充分振荡,12 000r/min离心5分钟,取上清液加入无水乙醇混匀置-20℃1.5小时,12 000r/min离心12分钟弃上清,加入冷75%乙醇、12 000r/min离心5分钟弃上清,再用冷75%乙醇重复操作一次,37℃30分钟烘干,加入10 μl DEPC溶解,紫外分光光度计测定RNA浓度,重复测定三次,OD260/OD280为1.8～2.0,置-70℃冰箱待检。
, 百拇医药
2.RT-PCR：取3 μl的标本RNA(1 μg左右),依次加入1倍体积反应缓冲液,0.2 mM dNTPs,1.0 μmol/L引物(C1+C2,A1+A2),1 mM mgso4,0.1 u/μl逆转录酶,0.1 u/μl DNA聚合酶,反应总体积为25 μl,反应条件为48℃45分钟进行1个循环,94℃2分钟进行1个循环,95℃30s,53℃30s,72℃30s进行30个循环,再72℃延伸7分钟后,4℃保温,以上操作于PCR扩增仪中进行(美国PE9600)。
3.PCR产物分析及定量：取标本PCR产物10μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色,用密度扫描仪扫描得到CyP条带与β-Actin条带各自峰面积积分值,计算CyP/β-Actin比值。
结 果
一、CyP碱基对的大小
标本与CyP、β-Actin二条引物进行逆转录-聚合酶链反应,于1.5%琼脂糖凝胶中电泳后发现CyP条带(408bp)与β-Actin条带(234bp)可清晰区分,无杂带出现(见图1)。
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图1 PCR扩增产物,M：PCR Maker 1～5：肾病CyP条带与β-Actin条带
二、儿童肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA表达的水平
测定肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA的水平,结果表明肾病综合征患儿急性期血白细胞中CyPmRNA的水平明显高于恢复期与对照组,两两间均有显著性差异(见表1)。
三、儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平
测定儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平,结果表明激素依赖、频繁复发、激素耐药肾病患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平之间无差异(P>0.05)。
表1 肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA表达 组别
, 百拇医药
例数
CyP/β-Action
急性期
28
0.282±0.011△▲
恢复期
22
0.267±0.164*
对照组
20
0.258±0.011*
F＝20.47 P<0.01
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注：△急性期与恢复期P<0.01,▲急性期与对照组P<0.01
*恢复期与对照组P<0.05
急性期为临床症状存在,尿蛋白≥
恢复期为临床症状消失,尿蛋白≤+或转阴。讨 论
一、CyP在肾病综合征患儿中基因表达的水平及临床意义
CyP是细胞内CsA的受体,分子量为18KD,由165个氨基酸组成,等电点为碱性。具有肽基脯氨酰顺反异构酶的活性(PPIase),能够催化蛋白质的折叠和转运等生物学功能,对正常细胞的功能起着重要调节作用,在临床上可广泛应用于器官移植后抗排斥、移植宿主病及一些自身免疫疾病的治疗[2]。近几年人们注视着肾小球疾病Cyclophilin基因表达的作用。本文通过逆转录聚合酶链反应的方法,以组成型表达β-Actin为内标,测定血白细胞中环孢素亲合素mRNA的表达,结果CyP条带(408bp)与β-Actin条带(234bp)可清晰区分,表明该方法专一性较好,结果与赵权等报道的一致[3]。同时对肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA进行测定,结果表明肾病综合征急性期血白细胞中CyP mRNA水平高于恢复期与对照组,而儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平表明激素依赖、频繁复发、激素耐药肾病患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平之间无差异。说明在肾病综合征患儿血白细胞中有高水平的CyP mRNA表达,在此时给予合适剂量CyP的反应物(如CsA治疗)可促进肾病综合征的缓解。因此,在使用CsA治疗肾病综合征的患者中,对CsA血浓度监测的同时进行CyP水平的测定,就可更合理地选用CsA治疗肾病及判断疗效[4]。
, 百拇医药
二、CyP在肾病综合征患儿中介导CsA的免疫抑制机理
CsA是一种来自真菌的11肽,含有11个氨基酸的中性亲脂的多肽,分子量为1 202.6道尔顿,在1、2、3、11位置上的氨基酸形成亲水的免疫抑制活性位点。CsA具有疏水性,易溶于脂类,在蓖麻油和橄榄油中性质稳定。1978年Calne等首次用于治疗原发性肾小球疾病,取得了一定的疗效,但对其作用机理尚不明确。近几年来研究发现环孢素亲合素是细胞内CsA的主要结合蛋白即CsA的受体,Sigal[5]研究发现CsA与CyP结合物与在肾病综合征患者中的免疫抑制活性呈正相关。当CsA进入人体细胞后,CsA与CyP结合形成CsA-CyP复合物,引起钙离子内流,从而细胞内钙离子浓度增高,抑制PPIase与钙依赖的神经钙蛋白,使得激活的T细胞核因子不能去磷酸化,T细胞生长因子、IL-2、IL-4等细胞因子的转录受阻,从而抑制T细胞的增殖[6],相应的不能产生或形成极低的相关淋巴因子,保证肾小球基底膜的正常阴离子电荷屏障不受破坏,减少尿蛋白排出,最终达到对肾小球疾病的治疗目的[7]。■
, 百拇医药
基金项目：本课题为全军“九五”医学科研规划第二批科研基金资助项目(98M027)
参考文献：
[1]姜新猷,陈荣华,王宝琳(整理).《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志,1981,19：241-243.
[2]Freskgard PO,Bergenhem N,Jonsson BM,et al.Isomerase and chaperone activity of prolyl isomerase in the folding of carbonic anhydrase.Science,1992,258：466-468.
[3]赵权,李芳秋,武建国.人白细胞环孢霉素A亲和素mRNA表达水平的检测.上海免疫学杂志,1997,17：41-43.
, 百拇医药
[4]夏正坤,刘光陵,高远赋,等.环孢霉素A治疗对儿童肾病CyP基因表达的影响.山西医科大学学报,1999,30：8-10.
[5]Sigal NH,Dumont F,Durette P,et al.Is cyclophilin involved in the immunosuppressive and nephrotoxic mechanism of action of cyclosporin A.J Exp Med,1991,173：619-628.
[6]Shaw KT,Ho AM,Raghavan A,et al.Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation of transcription factor NFAT1 in stimulated immune cells.Proc Natl Acad Sci USA.1995,92：11 205-11 209.
[7]Schrijver G,Assmann KJ,Wetzels JF,et al.Cyclosporin A reduces albuminuria in experimental anti-GBM nephritis independently from changes in GFR.Nephrol Dial Transplant,1995,10：1149-1154.
收稿日期：1998-12-07
修稿日期：1999-06-22, 百拇医药
单位：夏正坤(南京军区南京总医院儿科 210002)； 刘光陵(南京军区南京总医院儿科 210002)； 高远赋(南京军区南京总医院儿科 210002)； 王晓燕(南京军区南京总医院儿科 210002)； 伏洁(南京军区南京总医院儿科 210002)； 张连丰(南京军区南京总医院儿科 210002)； 傅元凤(南京军区南京总医院儿科 210002)； 樊忠民(南京军区南京总医院儿科 210002)
关键词：环孢素亲合素；环孢霉素A；基因表达；肾病综合征
江苏医药000202 摘 要：目的 环孢素亲合素(cyclophilin,CyP)是细胞内环孢霉素A(CsA)的受体,探讨CyP在肾病综合征患儿中基因表达及临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定28例肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA的表达,并以正常儿童作对照。结果 CyP碱基对408bp与β-Actin条带234bp可清晰区分。不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平无差异,同时发现肾病综合征患儿急性期血白细胞中CyP基因表达水平明显高于恢复期与对照组。结论 肾病综合征患儿急性期有高水平的CyP mRNA表达,在此时给予合适剂量环孢素亲合素的反应物(如CsA治疗)可促进肾病综合征的缓解。
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The study of expression of cyclophilin mRNA in child nephrotic syndrome
XIA Zhengkun,LIU Guangling,GAO Yuanfu,et al.
(Department of Pediatrics,Nanjing General Hospital of PLA,Nanjing 210002)
Abstract：Objective To investigate the role and expression of cyclophilin(CyP)gene,receptor of cyclosporin A(CsA),in child nephrotic syndrome.Methods The authors studied the expression of CyP gene from white blood cells in children with nephrotic syndrome by reverse transcription polymerase chain reaction.Results It was shown that the base of CyP is helpful in differentiating 408bp from β-Actin(234bp).The results also showed that the expression of CyP gene from white blood cells in children nephrotic syndrome in acute stage was significantly higher than those in restoring stage and those of controls.Conclusion These findings revealed a high level expression of CyP mRNA was observed in the acute stage of nephrotic syndrome,during which if timely CsA treatment at proper dosage is given,there might be a good prospect of remission of the disease.
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Key words：Cyclophilin Cyclosporin A Gene expression Nephrotic syndrome▲
环孢素亲合素(CyP)是细胞内环孢霉素A(CsA)的主要结合蛋白质,广泛存在于生物体内。本文使用逆转录聚合酶链反应测定儿童肾病综合征患儿血白细胞由CyP mRNA的表达,探讨CyP在肾病综合征患儿中基因表达及临床意义。
材料与方法
一、临床资料
28例肾病综合征患儿为1995年12月至1997年11月住院的患儿,男15例,平均年龄6.9岁,女13例,平均年龄8.1岁。其中7例为激素依赖,15例频繁复发,6例对激素耐药,20例病儿给予CsA治疗,所有患儿均无肝肾功能的异常。诊断符合全国儿科肾脏病科研协作组制定的诊断标准[1]。对照组随机选取正常儿童20例,男10例,平均年龄8.5岁,女10例,平均年龄7岁。
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二、试剂
RNA抽提试剂盒(美国GIBCOBRL公司),RT-PCR试剂盒(英国PROMEGA),PCR Marker(上海华美生物工程公司),引物由大连宝生物工程公司合成。
二条引物序列分别为：
CyP C15′TCTTCTTGCTGGTCTTGCC,C25′TCTCCTTTGAGCTGTTTGC；
β-Actin A15′CTTCCTGGGCATGGAGTC,A25′GCCGATCCACACGGAGTA。
三、方法
1.外周血RNA的抽提：全血2 ml稀释后,铺入1ml淋巴细胞分离液,4 000r/min离心10分钟,吸取白细胞层,12 000r/min离心5分钟弃上清,调整细胞浓度为5×106个细胞,标本分别加入RNA抽提液,充分振荡,12 000r/min离心5分钟,取上清液加入无水乙醇混匀置-20℃1.5小时,12 000r/min离心12分钟弃上清,加入冷75%乙醇、12 000r/min离心5分钟弃上清,再用冷75%乙醇重复操作一次,37℃30分钟烘干,加入10 μl DEPC溶解,紫外分光光度计测定RNA浓度,重复测定三次,OD260/OD280为1.8～2.0,置-70℃冰箱待检。
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2.RT-PCR：取3 μl的标本RNA(1 μg左右),依次加入1倍体积反应缓冲液,0.2 mM dNTPs,1.0 μmol/L引物(C1+C2,A1+A2),1 mM mgso4,0.1 u/μl逆转录酶,0.1 u/μl DNA聚合酶,反应总体积为25 μl,反应条件为48℃45分钟进行1个循环,94℃2分钟进行1个循环,95℃30s,53℃30s,72℃30s进行30个循环,再72℃延伸7分钟后,4℃保温,以上操作于PCR扩增仪中进行(美国PE9600)。
3.PCR产物分析及定量：取标本PCR产物10μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色,用密度扫描仪扫描得到CyP条带与β-Actin条带各自峰面积积分值,计算CyP/β-Actin比值。
结 果
一、CyP碱基对的大小
标本与CyP、β-Actin二条引物进行逆转录-聚合酶链反应,于1.5%琼脂糖凝胶中电泳后发现CyP条带(408bp)与β-Actin条带(234bp)可清晰区分,无杂带出现(见图1)。
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图1 PCR扩增产物,M：PCR Maker 1～5：肾病CyP条带与β-Actin条带
二、儿童肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA表达的水平
测定肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA的水平,结果表明肾病综合征患儿急性期血白细胞中CyPmRNA的水平明显高于恢复期与对照组,两两间均有显著性差异(见表1)。
三、儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平
测定儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平,结果表明激素依赖、频繁复发、激素耐药肾病患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平之间无差异(P>0.05)。
表1 肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA表达 组别
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例数
CyP/β-Action
急性期
28
0.282±0.011△▲
恢复期
22
0.267±0.164*
对照组
20
0.258±0.011*
F＝20.47 P<0.01
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注：△急性期与恢复期P<0.01,▲急性期与对照组P<0.01
*恢复期与对照组P<0.05
急性期为临床症状存在,尿蛋白≥
恢复期为临床症状消失,尿蛋白≤+或转阴。讨 论
一、CyP在肾病综合征患儿中基因表达的水平及临床意义
CyP是细胞内CsA的受体,分子量为18KD,由165个氨基酸组成,等电点为碱性。具有肽基脯氨酰顺反异构酶的活性(PPIase),能够催化蛋白质的折叠和转运等生物学功能,对正常细胞的功能起着重要调节作用,在临床上可广泛应用于器官移植后抗排斥、移植宿主病及一些自身免疫疾病的治疗[2]。近几年人们注视着肾小球疾病Cyclophilin基因表达的作用。本文通过逆转录聚合酶链反应的方法,以组成型表达β-Actin为内标,测定血白细胞中环孢素亲合素mRNA的表达,结果CyP条带(408bp)与β-Actin条带(234bp)可清晰区分,表明该方法专一性较好,结果与赵权等报道的一致[3]。同时对肾病综合征患儿血白细胞中CyP mRNA进行测定,结果表明肾病综合征急性期血白细胞中CyP mRNA水平高于恢复期与对照组,而儿童不同类型肾病综合征患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平表明激素依赖、频繁复发、激素耐药肾病患者血白细胞中CyP mRNA表达的水平之间无差异。说明在肾病综合征患儿血白细胞中有高水平的CyP mRNA表达,在此时给予合适剂量CyP的反应物(如CsA治疗)可促进肾病综合征的缓解。因此,在使用CsA治疗肾病综合征的患者中,对CsA血浓度监测的同时进行CyP水平的测定,就可更合理地选用CsA治疗肾病及判断疗效[4]。
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二、CyP在肾病综合征患儿中介导CsA的免疫抑制机理
CsA是一种来自真菌的11肽,含有11个氨基酸的中性亲脂的多肽,分子量为1 202.6道尔顿,在1、2、3、11位置上的氨基酸形成亲水的免疫抑制活性位点。CsA具有疏水性,易溶于脂类,在蓖麻油和橄榄油中性质稳定。1978年Calne等首次用于治疗原发性肾小球疾病,取得了一定的疗效,但对其作用机理尚不明确。近几年来研究发现环孢素亲合素是细胞内CsA的主要结合蛋白即CsA的受体,Sigal[5]研究发现CsA与CyP结合物与在肾病综合征患者中的免疫抑制活性呈正相关。当CsA进入人体细胞后,CsA与CyP结合形成CsA-CyP复合物,引起钙离子内流,从而细胞内钙离子浓度增高,抑制PPIase与钙依赖的神经钙蛋白,使得激活的T细胞核因子不能去磷酸化,T细胞生长因子、IL-2、IL-4等细胞因子的转录受阻,从而抑制T细胞的增殖[6],相应的不能产生或形成极低的相关淋巴因子,保证肾小球基底膜的正常阴离子电荷屏障不受破坏,减少尿蛋白排出,最终达到对肾小球疾病的治疗目的[7]。■
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基金项目：本课题为全军“九五”医学科研规划第二批科研基金资助项目(98M027)
参考文献：
[1]姜新猷,陈荣华,王宝琳(整理).《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志,1981,19：241-243.
[2]Freskgard PO,Bergenhem N,Jonsson BM,et al.Isomerase and chaperone activity of prolyl isomerase in the folding of carbonic anhydrase.Science,1992,258：466-468.
[3]赵权,李芳秋,武建国.人白细胞环孢霉素A亲和素mRNA表达水平的检测.上海免疫学杂志,1997,17：41-43.
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[4]夏正坤,刘光陵,高远赋,等.环孢霉素A治疗对儿童肾病CyP基因表达的影响.山西医科大学学报,1999,30：8-10.
[5]Sigal NH,Dumont F,Durette P,et al.Is cyclophilin involved in the immunosuppressive and nephrotoxic mechanism of action of cyclosporin A.J Exp Med,1991,173：619-628.
[6]Shaw KT,Ho AM,Raghavan A,et al.Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation of transcription factor NFAT1 in stimulated immune cells.Proc Natl Acad Sci USA.1995,92：11 205-11 209.
[7]Schrijver G,Assmann KJ,Wetzels JF,et al.Cyclosporin A reduces albuminuria in experimental anti-GBM nephritis independently from changes in GFR.Nephrol Dial Transplant,1995,10：1149-1154.
收稿日期：1998-12-07
修稿日期：1999-06-22, 百拇医药