老年肾综合征出血热患者外周血单个核细胞产生细胞因子能力研究
作者：苗里宁 周闻华 李红
单位：苗里宁 周闻华(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；李红(长春市南关区清明医院)
关键词：外周血单个核细胞；肾综合征出血热；白细胞介素；肿瘤坏死因子
中国老年学杂志000212摘 要 目的 探讨细胞因子在老年肾综合征出血热(HFRS)发病中的作用。方法 检测42例老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TNF含量。PHA刺激体外培养的HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)，观察产生IL-6、IL-2和TNF能力。将HFRS患者血清加入正常的PBMC进行体外培养，检测IL-6、IL-2和TNF的分泌量。结果 老年HFRS患者血清IL-6、IL-2和TNF含量较对照组明显增高(P<0.01)，IL-6、IL-2的高峰值在少尿期，TNF的高峰值在低血压期。PHA刺激HFRS患者PBMC产生IL-6、IL-2和TNF在发热期已达高水平，低血压期、少尿期持续在高水平，多尿期开始下降。加入HFRS患者血清后，正常人PBMC在PHA刺激下产生的IL-6、IL-2和TNF减少，特别是在少尿期与正常组比较减少更明显(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。结论 HFRS患者在发病初期PBMC既处于活化状态，在发病过程中产生大量细胞因子，参与肾脏的免疫损伤。HFRS患者血清中存在对PBMC产生细胞因子有抑制作用的物质，细胞因子在免疫性损伤中的作用取决于PBMC的分泌量与抑制物质的抑制的双重作用。
, http://www.100md.com
Cytokine presentation of mononuclear cell with in the peripheral blood(PBMC) of the elderly hemorrhagic fever patients complicated with renal syndrome
Miao Lining,Zhou Wenhua,Li Hong
(Second teaching hospital,Norman Bethune University of Medical Science,Changchun 130041)
Abstract：Objective To explore the role of cytokines in the pathogenesis of the elderly hemorrhagic fever patients complicated with renal syndrome(HFRS).Methods the serum IL-6、IL-2 and TNF were detected from 42 elderly ptients with HFRS.The PBMC from the HFRS patients cultured in vitro were stimulated by PHA,Then the concentrations of IL-6、IL-2 and TNF were determined.Results Serum IL-6、IL-2、TNF production in HFRS patients were significantly higher than the control(P<0.01),IL-6、IL-2 increased to peak at oliguria statge,and TNF to peak at hypotension stage.IL-6、IL-2 and TNF produced by PBMC stimulated with PHA in vitro were increased significantly at fever stage,continued in high levels at hypotension stage and oliguria stage.Conclusion PBMC from elderly HFRS patients were highly activated during the fever stage and cytokines produced during the course of the disease,taking part in the immune injury of the kindey.
, 百拇医药
Key words Peripheral blood mononuclear cell Hemorrhagic fever with renal syndrome Interleukins Tumor necrosis factor
近年来的研究证明，HFRS患者的体液免疫功能亢进，免疫复合物 在其 发病过程中起到了非常重要的作用〔1，2〕，同时也存在明显的细胞免疫调节失常 〔3，4〕。我们对老年HFRS患者的PBMC在体外培养时，PHA刺激下产生细胞因子的能力 进行了研究，同 时就患者血清对正常人PBMC产生细胞因子的调控作用进行了研究，试图对老年HFRS患者细胞 免疫状态进行研究，进而探讨其在发病过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 老年HFRS患者42例，为1997～1998年我 院、长春市腹膜透析中心的住院患者，男28例，女14例，平均年龄78.8(61～86)岁。诊断 与分型根据1986年南京全国流行性出血热临床专题会议制定的标准。正常对照组20例，男女 各10例，平均年龄68.8(60～75)岁，均为健康献血员。
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1.2 实验方法
1.2.1 血清中细胞因子检测 分别在患者各个期抽血 ，分离血清。IL-6、IL-2和TNF测定均采用北京东亚免疫技术研究所提供的放射免疫分析 试剂盒进行检测。
1.2.2 PBMC体外细胞因子分泌 抽取受检者静脉血5 m l，肝素抗凝，用Hank液稀释后用Ficoll-Hypaque密度梯度离心，分离PBMC，用Hank液洗2 次，再用PBMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106/ml加10%正常人血清，1%植物血凝 素(PHA)，置37 ℃、5%CO2孵箱培养48 h后收集上清，-20 ℃冰箱保存。IL-6、IL-2和T NF检测同上。
1.2.3 老年HFRS患者血清对正常人细胞因子产生的影 响 抽正常人抗凝血5 ml，同前分离PBMC，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml， 加10%患者血清，1%PHA同上培养及检测。
, 百拇医药
1.3 统计学分析 资料用均数±标准表示，组间比较分 别采用t检验。
2 结 果
2.1 老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TNF测定 见 表1。IL-6、IL-2水平在发热期已明显高于正常组(P<0.01)，低血压期持续上 升， 少尿期达高峰，多尿期明显下降，恢复期接近正常水平。TNF水平与IL-6、IL-2大致相同 ，只是高峰出现在低血压期。
表1 老年HFRS患者血清中细胞因子水平(
±s) 组别
n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
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TNF(ng/ml)
正常组
20
92±28
4.8±1.6
0.97±0.51
发热期
17
463±108
20.1±3.3
4.56±0.64
低血压期
, http://www.100md.com 15
996±230
33.6±5.1
6.11±0.72
少尿期
42
1 312±272
58.5±8.5
5.26±0.76
多尿期
42
415±84
16.3±3.7
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2.34±0.41
恢复期
38
141±42
6.5±1.8
1.08±0.54
表2 PBMC产生细胞因子结果(±s) 组别
n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
TNF(ng/ml)
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正常组
20
330±46
20.5±3.8
1.18±0.54
发热期
17
98±71
137.6±4.5
5.29±0.77
低血压期
15
927±73
, 百拇医药
152.8±9.7
5.51±1.21
少尿期
42
1 045±136
147.2±13.4
6.13±1.41
多尿期
42
662±54
82.6±4.8
3.58±0.61
, 百拇医药
恢复期
38
391±52
24.3±3.5
1.24±0.58
表3 老年HFRS患者血清对细胞因子产生的影响(±s) 组别
n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
TNF(ng/ml)
, 百拇医药 正常组
20
330±46
20.5±3.8
1.18±0.54
发热期
17
319±57
19.8±4.2
1.15±0.61
低血压期
15
304±54
, 百拇医药
17.6±5.5
0.92±0.65
少尿期
42
246±44
10.2±3.7
0.61±0.24
多尿期
42
409±61
17.1±4.2
0.89±0.35
, 百拇医药
恢复期
38
335±52
19.7±4.7
1.15±0.74
2.2 老年HFRS患者PBMC体外细胞因子产生结果 见表 2。IL-6、IL-2和TNF在发热期与正常组比均已明显升高(P<0.01)，低血压期和少 尿期持续在同一高水平，多尿期开始下降，恢复期降到接近正常水平。
2.3 正常组PBMC在加入HFRS患者血清后产生细胞因子结 果 见表3。加入发热期、低血压期血清，IL-6、IL-2和TNF产生开始减少，但不明显；加 入少 尿期血清，IL-6、IL-2和TNF的产生与正常组比均明显减少(P<0.05，P<0.01 )。多尿期和恢复期明显恢复，接近正常水平。
, 百拇医药
3 讨 论
IL-6、IL-2和TNF是T、B淋巴细胞、巨噬细胞等多种细胞产生，IL-2主要由T淋巴细胞产 生。这些细胞因子具有促进B淋巴细胞分化和增殖，促进抗体生成等功能，参与机体炎症反 应和自身免疫性疾病的发作与转归〔5，6〕。老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TN F均在发热期开始上升，分别在低血压期和少尿期达到高峰，进入多尿期明显下降，这与肾 脏 损伤程度相一致，提示这些细胞因子介导的免疫损伤在HFRS肾损伤中起重要的作用。另外， 本实验可见，从发热期开始直到少尿期，老年HFRS患者PBMC都处在高度活化状态，到多尿 期之后才逐渐恢复。这进一步证明，老年HFRS患者的PBMC在病毒侵入后既已被激活， 产生大量的IL-6、IL-2和TNF等细胞因子，直接参与肾脏及其他组织器官的损伤过程。
本实验中将老年HFRS病人血清加入正常人PBMC进行体外培养，经PHA刺激后观察IL-6、IL- 2和TNF的产生情况，可见在发热期和低血压期细胞因子产生已经减少，少尿期明显减少，血 清对细胞因子的产生有明显的抑制作用，这种抑制作用进入多尿期明显减轻，并在恢复期基 本消失。我们考虑，在老年HFRS病人血清中存在某种抑制因子在起作用，这种抑制因子可能 随着病情加重产生增多，也可能属小分子物质，在肾功能恶化的少尿期在体内蓄积，而多尿 期后很快被排除。
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老年HFRS病人肾损伤已往被认为是病毒感染所致〔7〕，近来研究证明与免疫功能异 常有关〔2，8〕。本研究表明病人体内细胞因子产生异常，与发病过程相关，其作用 机制有待于进一步探讨。
作者简介：苗里宁，男，42岁，副教授，研究方向：肾小球疾病的发病机制与治疗
参考文献
1，Liu YF，Yang SJ，Yan PS et al. Character istics of immunocomplex in autopsy tissues of hemorrhagic fever with renal syndrome.Chin Med J，1994；107：444
2，黄晓峰，刘彦仿，张远强 et al.肾综合征出血热可溶性免疫复合物的致病作用.中华医学杂志，1998；78：41
, http://www.100md.com
3，樊万虎，张成文，刘正稳 et al.流行性出血热患者可溶性白细胞介素-2受体的动态检查及意义.中华传染病杂志，1993；11：204
4，樊万虎，岳金声，刘正稳 et al.肾综合征出血热患者血清IL-6、尿液肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8的检测.中华内科杂志，1998；37：33
5，Waage A，Bakke O.Giucocorticoids suppress the productin of tumour necrosis factor by lipopolysaccharide stimulated human monocytes.Immunology，1998；63：299
6，Kawamo M，Hiranot,Matsuda T et al.Autocrine generation and requirement of BSF-2/IL-6 for human multiple myelomas.Nature，1998；332：83
7，Cosgriff TM，Lewis RM.Mechanisms of dissease in hemorrhagic fever with renal syndrome.Kidney Intl，1991；40(suppl)：s72
8，杨守洋，刘彦仿，刘莹莹 et al.肾综合征出血热肾组织病毒抗原、特异性免疫复合物及其与肾病变的关系.中华肾脏杂志，1995；11：39
收稿日期：1999-01-10
修回日期：1999-12-10, 百拇医药
单位：苗里宁 周闻华(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；李红(长春市南关区清明医院)
关键词：外周血单个核细胞；肾综合征出血热；白细胞介素；肿瘤坏死因子
中国老年学杂志000212摘 要 目的 探讨细胞因子在老年肾综合征出血热(HFRS)发病中的作用。方法 检测42例老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TNF含量。PHA刺激体外培养的HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)，观察产生IL-6、IL-2和TNF能力。将HFRS患者血清加入正常的PBMC进行体外培养，检测IL-6、IL-2和TNF的分泌量。结果 老年HFRS患者血清IL-6、IL-2和TNF含量较对照组明显增高(P<0.01)，IL-6、IL-2的高峰值在少尿期，TNF的高峰值在低血压期。PHA刺激HFRS患者PBMC产生IL-6、IL-2和TNF在发热期已达高水平，低血压期、少尿期持续在高水平，多尿期开始下降。加入HFRS患者血清后，正常人PBMC在PHA刺激下产生的IL-6、IL-2和TNF减少，特别是在少尿期与正常组比较减少更明显(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。结论 HFRS患者在发病初期PBMC既处于活化状态，在发病过程中产生大量细胞因子，参与肾脏的免疫损伤。HFRS患者血清中存在对PBMC产生细胞因子有抑制作用的物质，细胞因子在免疫性损伤中的作用取决于PBMC的分泌量与抑制物质的抑制的双重作用。
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Cytokine presentation of mononuclear cell with in the peripheral blood(PBMC) of the elderly hemorrhagic fever patients complicated with renal syndrome
Miao Lining,Zhou Wenhua,Li Hong
(Second teaching hospital,Norman Bethune University of Medical Science,Changchun 130041)
Abstract：Objective To explore the role of cytokines in the pathogenesis of the elderly hemorrhagic fever patients complicated with renal syndrome(HFRS).Methods the serum IL-6、IL-2 and TNF were detected from 42 elderly ptients with HFRS.The PBMC from the HFRS patients cultured in vitro were stimulated by PHA,Then the concentrations of IL-6、IL-2 and TNF were determined.Results Serum IL-6、IL-2、TNF production in HFRS patients were significantly higher than the control(P<0.01),IL-6、IL-2 increased to peak at oliguria statge,and TNF to peak at hypotension stage.IL-6、IL-2 and TNF produced by PBMC stimulated with PHA in vitro were increased significantly at fever stage,continued in high levels at hypotension stage and oliguria stage.Conclusion PBMC from elderly HFRS patients were highly activated during the fever stage and cytokines produced during the course of the disease,taking part in the immune injury of the kindey.
, 百拇医药
Key words Peripheral blood mononuclear cell Hemorrhagic fever with renal syndrome Interleukins Tumor necrosis factor
近年来的研究证明，HFRS患者的体液免疫功能亢进，免疫复合物 在其 发病过程中起到了非常重要的作用〔1，2〕，同时也存在明显的细胞免疫调节失常 〔3，4〕。我们对老年HFRS患者的PBMC在体外培养时，PHA刺激下产生细胞因子的能力 进行了研究，同 时就患者血清对正常人PBMC产生细胞因子的调控作用进行了研究，试图对老年HFRS患者细胞 免疫状态进行研究，进而探讨其在发病过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 老年HFRS患者42例，为1997～1998年我 院、长春市腹膜透析中心的住院患者，男28例，女14例，平均年龄78.8(61～86)岁。诊断 与分型根据1986年南京全国流行性出血热临床专题会议制定的标准。正常对照组20例，男女 各10例，平均年龄68.8(60～75)岁，均为健康献血员。
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1.2 实验方法
1.2.1 血清中细胞因子检测 分别在患者各个期抽血 ，分离血清。IL-6、IL-2和TNF测定均采用北京东亚免疫技术研究所提供的放射免疫分析 试剂盒进行检测。
1.2.2 PBMC体外细胞因子分泌 抽取受检者静脉血5 m l，肝素抗凝，用Hank液稀释后用Ficoll-Hypaque密度梯度离心，分离PBMC，用Hank液洗2 次，再用PBMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106/ml加10%正常人血清，1%植物血凝 素(PHA)，置37 ℃、5%CO2孵箱培养48 h后收集上清，-20 ℃冰箱保存。IL-6、IL-2和T NF检测同上。
1.2.3 老年HFRS患者血清对正常人细胞因子产生的影 响 抽正常人抗凝血5 ml，同前分离PBMC，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml， 加10%患者血清，1%PHA同上培养及检测。
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1.3 统计学分析 资料用均数±标准表示，组间比较分 别采用t检验。
2 结 果
2.1 老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TNF测定 见 表1。IL-6、IL-2水平在发热期已明显高于正常组(P<0.01)，低血压期持续上 升， 少尿期达高峰，多尿期明显下降，恢复期接近正常水平。TNF水平与IL-6、IL-2大致相同 ，只是高峰出现在低血压期。
表1 老年HFRS患者血清中细胞因子水平(
±s) 组别n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
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TNF(ng/ml)
正常组
20
92±28
4.8±1.6
0.97±0.51
发热期
17
463±108
20.1±3.3
4.56±0.64
低血压期
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996±230
33.6±5.1
6.11±0.72
少尿期
42
1 312±272
58.5±8.5
5.26±0.76
多尿期
42
415±84
16.3±3.7
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2.34±0.41
恢复期
38
141±42
6.5±1.8
1.08±0.54
表2 PBMC产生细胞因子结果(
±s) 组别n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
TNF(ng/ml)
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正常组
20
330±46
20.5±3.8
1.18±0.54
发热期
17
98±71
137.6±4.5
5.29±0.77
低血压期
15
927±73
, 百拇医药
152.8±9.7
5.51±1.21
少尿期
42
1 045±136
147.2±13.4
6.13±1.41
多尿期
42
662±54
82.6±4.8
3.58±0.61
, 百拇医药
恢复期
38
391±52
24.3±3.5
1.24±0.58
表3 老年HFRS患者血清对细胞因子产生的影响(
±s) 组别n
IL-6(pg/ml)
IL -2(ng/ml)
TNF(ng/ml)
, 百拇医药 正常组
20
330±46
20.5±3.8
1.18±0.54
发热期
17
319±57
19.8±4.2
1.15±0.61
低血压期
15
304±54
, 百拇医药
17.6±5.5
0.92±0.65
少尿期
42
246±44
10.2±3.7
0.61±0.24
多尿期
42
409±61
17.1±4.2
0.89±0.35
, 百拇医药
恢复期
38
335±52
19.7±4.7
1.15±0.74
2.2 老年HFRS患者PBMC体外细胞因子产生结果 见表 2。IL-6、IL-2和TNF在发热期与正常组比均已明显升高(P<0.01)，低血压期和少 尿期持续在同一高水平，多尿期开始下降，恢复期降到接近正常水平。
2.3 正常组PBMC在加入HFRS患者血清后产生细胞因子结 果 见表3。加入发热期、低血压期血清，IL-6、IL-2和TNF产生开始减少，但不明显；加 入少 尿期血清，IL-6、IL-2和TNF的产生与正常组比均明显减少(P<0.05，P<0.01 )。多尿期和恢复期明显恢复，接近正常水平。
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3 讨 论
IL-6、IL-2和TNF是T、B淋巴细胞、巨噬细胞等多种细胞产生，IL-2主要由T淋巴细胞产 生。这些细胞因子具有促进B淋巴细胞分化和增殖，促进抗体生成等功能，参与机体炎症反 应和自身免疫性疾病的发作与转归〔5，6〕。老年HFRS患者血清中IL-6、IL-2和TN F均在发热期开始上升，分别在低血压期和少尿期达到高峰，进入多尿期明显下降，这与肾 脏 损伤程度相一致，提示这些细胞因子介导的免疫损伤在HFRS肾损伤中起重要的作用。另外， 本实验可见，从发热期开始直到少尿期，老年HFRS患者PBMC都处在高度活化状态，到多尿 期之后才逐渐恢复。这进一步证明，老年HFRS患者的PBMC在病毒侵入后既已被激活， 产生大量的IL-6、IL-2和TNF等细胞因子，直接参与肾脏及其他组织器官的损伤过程。
本实验中将老年HFRS病人血清加入正常人PBMC进行体外培养，经PHA刺激后观察IL-6、IL- 2和TNF的产生情况，可见在发热期和低血压期细胞因子产生已经减少，少尿期明显减少，血 清对细胞因子的产生有明显的抑制作用，这种抑制作用进入多尿期明显减轻，并在恢复期基 本消失。我们考虑，在老年HFRS病人血清中存在某种抑制因子在起作用，这种抑制因子可能 随着病情加重产生增多，也可能属小分子物质，在肾功能恶化的少尿期在体内蓄积，而多尿 期后很快被排除。
, http://www.100md.com
老年HFRS病人肾损伤已往被认为是病毒感染所致〔7〕，近来研究证明与免疫功能异 常有关〔2，8〕。本研究表明病人体内细胞因子产生异常，与发病过程相关，其作用 机制有待于进一步探讨。
作者简介：苗里宁，男，42岁，副教授，研究方向：肾小球疾病的发病机制与治疗
参考文献
1，Liu YF，Yang SJ，Yan PS et al. Character istics of immunocomplex in autopsy tissues of hemorrhagic fever with renal syndrome.Chin Med J，1994；107：444
2，黄晓峰，刘彦仿，张远强 et al.肾综合征出血热可溶性免疫复合物的致病作用.中华医学杂志，1998；78：41
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3，樊万虎，张成文，刘正稳 et al.流行性出血热患者可溶性白细胞介素-2受体的动态检查及意义.中华传染病杂志，1993；11：204
4，樊万虎，岳金声，刘正稳 et al.肾综合征出血热患者血清IL-6、尿液肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8的检测.中华内科杂志，1998；37：33
5，Waage A，Bakke O.Giucocorticoids suppress the productin of tumour necrosis factor by lipopolysaccharide stimulated human monocytes.Immunology，1998；63：299
6，Kawamo M，Hiranot,Matsuda T et al.Autocrine generation and requirement of BSF-2/IL-6 for human multiple myelomas.Nature，1998；332：83
7，Cosgriff TM，Lewis RM.Mechanisms of dissease in hemorrhagic fever with renal syndrome.Kidney Intl，1991；40(suppl)：s72
8，杨守洋，刘彦仿，刘莹莹 et al.肾综合征出血热肾组织病毒抗原、特异性免疫复合物及其与肾病变的关系.中华肾脏杂志，1995；11：39
收稿日期：1999-01-10
修回日期：1999-12-10, 百拇医药