储存损伤对血小板超微结构、磷脂及聚集功能的影响
作者：成晓玲 林武存 黎汝青 曾杰 任德慧
单位：第三军医大学附属第一医院输血科 重庆 400038
关键词：血小板储存损伤 高效液相色谱分析 脂质 超微结构 血 小板聚集
重庆医学000205摘 要：目的 对保存期间血小板脂质、超微结构 及功能的改变进行观察分析，探讨储存损伤对血小板的影响。方法 20名健康献血者，常规采血，经二次离心获得浓缩血小板，将每单位浓缩血小板分装成两份 ，分别编为甲、乙两组，每组20个样本。甲组于22℃水平振摇保存，分别在3天、5天时取样 检测；乙组采用DMSO作为防冻剂，终浓度为5%，-80℃保存，分别在1月、3月、6月时取样测 定；采血当天的新鲜血小板为对照组。采用高效液相色谱法(HPLC-UV)分析血小板磷脂的变 化，电镜观察血小板超微结构的改变。结果 正常人新鲜血小板中四 种主要磷脂：磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI) 的 含量依次为PC>PE>PS>PI，各占总磷脂含量的37%，27%，12%，7%左右。血小板在22℃水平振 摇保存3天、5天，磷脂丢失率为5.8%，31.8%；-80℃冷冻保存(防冻剂为DMSO)1～6月，磷脂 丢失率约为33～36%左右，且不随冷冻时间延长而增加。透射电镜观察血小板超微结构，发 现血小板出现激活信号，如由盘状向球形转变，伪足延伸，开放小管系统(OCS)肿胀，储存 颗粒丧失，空泡形成等。血小板聚集实验显示：血小板对聚集剂ADP的反应性下降，提示血 小板功能受损。结论 在储存损伤的发展过程中，血小板脂质丧失与 血小板形态改变和功能损伤有密切关系。
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The Changes of Lipids,Ultrastructure and Aggregation in Platelet Storage Lesion
Cheng Xiaoling Lin Wuchen Li Ruqing,et al.
(Department of Blood Tra nsfusion;Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,P R China)
Abstract：objective:The purpose of this project was to study the s torage lesion of platelet and to investigate the changes of platelet lipids,ultr a-structure and aggregation.Methods:20 units of platelet were div ided into two groups.One was stored at 22℃ and esamined at 3,5 days poststorage .Another added DMSO(5% terminal concentration)was stored at -80℃ and examined a t 1,3 and 6 months poststorage.The fresh platelet was as control.The platelet li pids were assayed by HPLC.The platelet ultra-structure was investigated by elect ron microscope.Results:The loss rates of platelet lipids at 22℃ were 5.8%～31.8% after 3,5 days respectively.The loss rates of lipids at -80℃ w ere 33%～36% after 6 months storage and did not change anymore thereafter.The ul tra-structure alterations were occurred at 22℃ and -80℃ groups in storage.The morphological alterations were expressed as signs of activation.The piatelet agg regative test sbowed the decrease of reaction to agonist ADP.This result showed the functional alteration of platelet.Conclusion:The functional a lterations of platelet are due to the lipids loss and morphological alterations in platelet preparation and storage.
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Key Words：Storage lesion of platelet;HPLC;Lipids;Ultra-structure; Platelet aggregation▲
血小板储存损伤(the Platelet Storage Lesion,PSL)是影响血小板保存的重 要障碍。它可以使血小板输注后体内恢复率下降，生存期缩短，严重影响治疗效果，成为临 床输血亟待解决的难题。鉴于血小板脂质对维持血小板形态结构，发挥止血效能具有重要意 义，同时又具理化性能不稳定的特点，我们调查了保存期间血小板脂质、超微结构及功能的 变化，并就其相关性进行了探讨，旨在预防或减少PSL发生，改善血小板保存质量，提高血 小板输注后体内存活率。
1 材料与方法
1.1 样本准备与分组
1.1.1 样本准备 20位健康献血者，常规采血，采用多血小板血浆法(PRP- PC)经二次离心获得浓缩血小板，血袋为ACD-B三联袋(上海血液中心产品)。
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1.1.2 分组 将每单位浓缩血小板分装成两份，编为甲、乙两组，每组20 个样本；采血当天的新鲜血小板(第一天)为对照组。甲组于22℃水平振摇保存(XHZ-1 型血 小板恒温振荡保存箱，60次/分，苏州产)，分别在2天、3天、4天、5天取样检测，与对照组 比较进行动态观察。乙组用二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂(终浓度为5%)，-80℃保存，分别在1 月、3月、6月取样测定，与对照组比较进行动态观察，用前在37℃水浴快速溶化。
1.2 实验方法
1.2.1 血小板磷脂测定 (1)提取脂质根据 文献报道[1，2]，将 血 小板悬液加入塑料试管中，4℃离心，4000g，10分钟，去上层血浆，用冷生理盐水(4℃)将 血小板扣再悬浮，4℃离心，4000g，10分钟，反复三次，直到完全去除血浆。用冷生理盐水 将血小板调至400×109/L，白细胞和红细胞污染数量少于1/4000血小板。将洗涤后的血小 板悬液在冰水浴中匀浆。取3ml血小板匀浆液+2倍的氯仿-甲醇提取液(2：1，v/v)，离心去 上清液，收集氯仿液；再加入甲醇-水提取液，离心去上清液；取1ml氯仿液，氮气下吹干， -20℃保存备用[2]。(2)试剂 四种磷脂标准品：磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholin e,PC)，磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserin e,PS)，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)均为Sigma产品；乙晴、甲醇为HPLC(色谱) 纯级(上海产)；其它试剂均为分析纯级。(3)仪器与色谱条件 GILSON系列高效液相色谱仪( 法国产)，色谱数据工作站(中科院大连化物所)。色谱柱：μPorasil silica,300mm×4.0mm ，粒径10μm；流动相：乙晴-甲醇-磷酸(90：3：1，v/v)；流速：0.8ml/分钟，进样量： 20μl；紫外检测波长203nm；时间25分钟；柱温：室温。色谱数据工作站进行数据处理。
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1.2.2 血小板超微结构观察 常规电镜样本处理。LKB-V型超薄切片机切 片，切片厚度0.6μm，铅染色，GE2000型电镜观察。
1.2.3 血小板聚集功能测定 诱导剂：ADP，浓度分别为
0.2、0. 1、0.05mM；测定5分钟，记录最大聚集率(PAG)；仪器：TYXN-91型血液凝集仪(上海产)。
1.2.4 浓缩血小板悬液pH测定 AVL990型血气分析仪(瑞士产)。
1.2.5 结果以χ±s表示，进行t检验。
2 结 果
2.1 22℃水平振摇保存血小板。
2.1.1 磷脂的变化 新鲜血小板四种主要磷脂含量依次PC>PE>PS>PI。保存 3天，血小板四种磷脂的总量下降5.8%；保存5天下降31.8%，具有统计学意义(表1)。
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表1 血小板磷脂PC，PE，PI，PS在储存期间的变化n＝20浓度：μg/ml
PC
PE
PS
PI
合计
丢失率(%)
P值
22℃
1天
35.7±7.9
21.0±4.2
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10.1±6.4
4.6±0.7
71.4
0
3天
33.9±8.1
20.3±5.2
8.6±2.7
4.5±0.5
67.3
5.8*
>0.05
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5天
24.8±4.9
13.9±3.3
6.4±2.1
3.6±0.5
48.7
31.8*
<0.01
-80℃
1月
24.6±5.4
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13.2±4.1
6.9±3.1
3.9±1.2
47.6
33.3**
<0.01
3月
21.4±3.7
14.6±3.1
7.2±2.9
3.5±1.0
46.7
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34.6**
<0.01
6月
22.5±4.1
13.6±4.2
6.2±4.2
3.2±1.1
45.5
36.3**
<0.01
*22℃贮存3天、5天之间比较，P<0.05。**-80℃低温贮存1、3、6月之间比较，P>0.05。
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2.1.2 血小板超微结构变化 透射电镜下观察：新鲜血小板膜光滑，颗粒 清楚，无变形，均匀一致，有少数小泡扩张，可见少量短突(图1)。保存3天，血小板形态完 整，环形小管肿胀扩张，呈半月状，颗粒减少，色变淡，可观察到退变的膜性结构。血小板 微丝，微管，线粒体可见(图2 、图3)。保存5天血小板开放管道系统(OCS)扩张，肿胀明显 ，出现聚集及溶解。
图1.新鲜血小板，膜光滑，颗粒清楚，均匀一致，有少数小泡扩张。×5，000。
图2.22℃保存3天的血小板，形态完整，颗粒减少，空泡增多，OC S扩张，肿胀，呈半月状裂隙。×5，000。
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图3.22℃保存3天的血小板，可见α颗粒与OCS融合的现象，腺粒体可见。×30，000。
2.1.3 血小板聚集功能改变 随着储存时间延长，血小板对ADP的反应性下 降。22℃保存24小时，血小板PAG下降约50%，保存72小时PAG降至10%以下，即使增加ADP浓 度也不能提高PAG(图6)。
图6.22℃水平振摇保存，血小板聚集率的变化
2.1.4 血小板pH的变化见表2。
表2 血小板在22℃保存下pH等指标的变化 (n＝8)
1天
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3天
5天
P值
pH
6.97±0.2
7.02±0.1
<6.0
<0.01
HCO3(mmol/l)
12.2±0.2
6.03±1.2
0.04±0.1
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<0.01
PO2(kPa)
15.5±0.9
13.4±1.2
12.7±1.2
>0.05
表3 ADP诱导的冻-融后血小板最大聚集率(PAG) (n=8) ADP(mM)
0.2
0.1
0.05
新鲜血小板
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90±8.2
83±9.0
冻融后血小板
10±4.1*
10±3.4*
7±2.7*
重悬血小板**
18±6.3*
18±4.5*
16±2.5*
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*冻-融后血小板与新鲜血小板比较，P<0.01；重悬血小板与冻融后血小 板比较，P<0.05。**冻-融后用同型FFP重悬的血小板。
2.2 -80℃冷冻保存血小板
2.2.1 磷脂的变化 -80℃保存1月、3月、6月，血小板磷脂丢失率分别为 33.3%，34.6%，36.3%，三者之间无显著差异，但与新鲜血小板相比较差异显著，P<0.0 1(表1)。
2.2.2 血小板超微结构改变 保存1月，冻一融血小板约58%保持完整的形 态结构，颗粒稍有减少，色变淡，线粒体、α-颗粒、致密颗粒、微管均可见(图4)。约42% 的血小板出现基质肿胀，颗粒边集或溢出膜外，部分内部结构消失，膜溶解(图5)。
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图4.-80℃低温保存(5%OMSO)1月，pH7.02，血小板圆盘状形态和内部散在的细胞器依然存在于大部分血小板中。×5，000。
图5.-80℃保存1月后溶解的血小板，开放管道系统(OCS)消失， 部分残余α颗粒靠向浆膜(边集)。×30，000
2.2.3 血小板聚集功能 表3总结了冻-融血小板对ADP诱导剂的聚集反应。 可见血小板最大聚集率明显下降，用同型新鲜冰冻血浆(FFP)重悬后聚集功能部分恢复。在- 80℃保存1～6月的血小板之间比较，PAG改变不显著。
3 讨 论
3.1 储存损伤对血小板脂质的影响 血小板脂质的主要功能是维持血小板 膜结构完整性和磷脂的促凝血活性。未活化的血小板磷脂PI、PS和PE主要暴露于浆膜内侧面 ，血小板活化时PE和PS转向外侧面，为血浆凝血因子FVa和FXa提供了催化表面，形成血小板 3因子(PF3)，使凝血酶形成速度大大加快[3]。贮存期间血小板的活化和细胞溶 解使磷脂从血小板膜释放到上清液中。血小板磷脂丧失的机制目前还不完全明确，有可能是 脂质过氧化反应所致。贮存期间血小板内源性抗氧化物(如谷光甘肽)逐渐耗尽，使得氧分子 能够对无保护功能的脂质进行过氧化反应。在脂质过氧化反应中，氧分子加入到脂链的烯烃 双键中反复排列，使一个脂质链形成两个醛分子，最终导致脂链破碎。在这一过程中，膜表 面主要负责脂质功能活性的特异性极性基团丧失，维持血小板生理功能的花生四烯酸前体缺 乏，同时生成破坏生物膜完整性的脂肪酰基醛，使血小板膜脂质双层稳定性下降，磷脂丧失 。血小板磷脂的丢失和血小板聚集功能的改变提示：(1)血小板磷脂丧失与血小板功能下降 有密切的关系；(2)冰冻保存血小板，其损伤主要来自冻一融过程，与保存时间的长短无明显关系。
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3.2 储存损伤对血小板超微结构的影响 刚制备的新鲜血小板形态发生相对轻微的改变，复温后这些变化是可逆的。血小板在体外受 到刺激后引起α-颗粒通过与OCS融合进行释放(图3)。随保存时间延长，OCS消失，血小板 气球样变，甚至溶解。血小板具有强大的吞噬能力，颗粒中贮存的许多物质并非来自巨核细 胞或血小板自身，而是来自血浆。故推测，输注后血小板α-颗粒可通过细胞摄粒作用得到恢复[4]。然而，在血小板保存期间，细胞膜磷脂 丢失，细胞摄粒作用减弱，不利于血小板输入体内后的恢复和生存。
3.3 储存对血小板聚集功能和代谢功能的影响
3.3.1 ADP诱导的血小板聚集反应 22℃保存期间，ADP诱导的血小板最大 聚集率PAG随时间递增而下降(图6)。-80℃保存的血小板，冻融后PAG下降显著(P<0.01) ，加入新鲜血浆可部分改善血小板对ADP的反应性(表3)。其原因可能是，新鲜血浆除了给血 小板提供基本能量外，还对在保存中丧失了的某些成分进行了补充，使血小板反应性部分恢 复[5]。可以认为，PSL具有可逆性，保存血小板输注到体内后，可以在一定程度上 恢复其生理功能。我们发现，有时采用聚集仪测定PAG结果为阴性时，在显微镜下往往可以 看到血小板已3～5个聚集成团，这是由于比浊法不能反映少于5个血小板的聚集体[3] 。推测，这种血小板输到体内后仍能恢复一定的生理功能，发挥止血效能(有待进一步证 实)。
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3.3.2 血小板代谢情况 22℃保存1～3天，PRP-PC法制备的浓缩血小板，p H维持在7.0左右，第四天下降至6.75，第五天pH<6.0；HCO3-第一天 为23.23mmol/L ，第五天只有
0.04mmol/L；PO2呈下降趋势。这是由于浓缩血小板以葡萄糖为最 主要燃料 ，而血小板所摄取的葡萄糖80%以上是通过无氧酵解，因而导致大量乳酸产生，引起pH下降 。HCO3-的下降提示血浆缓冲能力被消耗。pH降低导致血小板损伤，可见血小板由 圆盘状变成球形，当pH低于6.0时，新陈代谢衰竭，血小板可发生严重的结构改变和释放反 应，这种改变是不可逆的。
3.4 血小板脂质丧失与血小板形态、结构及功能改变的关系 在保存期间 ，由于“贮存损伤”的影响，血小板受到非生理性刺激，引起活化，释放颗粒，进而聚集； 脂质被消耗或丢失，导致血小板止血功能下降；乳酸盐积蓄，pH下降，血小板新陈代谢衰竭 ，最终导致血小板膜溶解，内容物溢出。在血小板活化过程中，磷脂PS和PE在脂质膜外侧暴 露，形成PF3。PF3能大大加快凝血酶产生的速度，引起血小板广泛聚集。据报道，保存 5天血小板总PF3活性可增加12倍[4]。这与我们的观察一致。由于在体外提前消 耗，血小板输注后止血作用减弱，血液循环中维持时间缩短，体内复苏率降低。
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3.5 结论 根据血小板激活、新陈代谢衰竭及衰老的变化，浓缩血小板储 存损伤的发展可能为多因素过程，血小板脂质的丧失与血小板形态改变和功能损伤有密切关 系。随着对贮存血小板生物化学、形态学和功能损伤的研究，人们对储存损伤的机制更为了 解。目前，白膜法(BC-PC)制备浓缩血小板的方法受到推荐。它可使血小板活化程度降到最 低[6]。实验室研究发现，在血小板中加入血小板活化抑制剂前列腺素l(PGE)、茶 碱(Theophylline)[7]和抗氧化剂维生素E能明显延长血小板的储存时间[8] 。另外，储存容器具有良好的透气性，添加醋酸盐人工介质以改善浓缩血小板pH稳定性及 能量供给，适当的保存温度和振摇频率以及减少白细胞污染等，对血小板完善地保存都是必 不可少的。
参考文献：
[1]Kawasaki T,Kambayashi J,Mori T,et al.Analysis of platelet phospholipid s by high performance liquid chromatography.Thrombosis Research,1984,36:335
, 百拇医药
[2]王凤君，赵云，谢尔凡，等.高效液相色谱法测定生物样品中磷脂含量.第三军 医大学学报，1996，18(1)：67
[3]阮长耿.血小板-基础与临床.第2版，上海：上海科学技术出版社，1987：20
[4]Klinger MHF.The storage lesion of platelets:ultrastructural and functi onal aspects.Ann Hematol,1996,73:103
[5]黎金庆，易永林，王宇，等.血小板冷冻保存的研究.中国输血杂志，1994，7 ：7
[6]Seghatchian JMJ,Krailadsiri p.The platelet storage lesion.Transfusion Medicine Reviews,1997，11(2)：130
[7]Bode AP,Holme S,Heaton WA,et al.Extended storage of platelets in an a rtificial medium with the platelet activation inhibitors prostaglandin E1 and theophylline.Vox Sang,1996,60:105
[8]Koerner TAW,Cunningham MT,Zhang D-S.The role of membrane lipid in the platelet storage lesion.Blood Cell,1992,18:481, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属第一医院输血科 重庆 400038
关键词：血小板储存损伤 高效液相色谱分析 脂质 超微结构 血 小板聚集
重庆医学000205摘 要：目的 对保存期间血小板脂质、超微结构 及功能的改变进行观察分析，探讨储存损伤对血小板的影响。方法 20名健康献血者，常规采血，经二次离心获得浓缩血小板，将每单位浓缩血小板分装成两份 ，分别编为甲、乙两组，每组20个样本。甲组于22℃水平振摇保存，分别在3天、5天时取样 检测；乙组采用DMSO作为防冻剂，终浓度为5%，-80℃保存，分别在1月、3月、6月时取样测 定；采血当天的新鲜血小板为对照组。采用高效液相色谱法(HPLC-UV)分析血小板磷脂的变 化，电镜观察血小板超微结构的改变。结果 正常人新鲜血小板中四 种主要磷脂：磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI) 的 含量依次为PC>PE>PS>PI，各占总磷脂含量的37%，27%，12%，7%左右。血小板在22℃水平振 摇保存3天、5天，磷脂丢失率为5.8%，31.8%；-80℃冷冻保存(防冻剂为DMSO)1～6月，磷脂 丢失率约为33～36%左右，且不随冷冻时间延长而增加。透射电镜观察血小板超微结构，发 现血小板出现激活信号，如由盘状向球形转变，伪足延伸，开放小管系统(OCS)肿胀，储存 颗粒丧失，空泡形成等。血小板聚集实验显示：血小板对聚集剂ADP的反应性下降，提示血 小板功能受损。结论 在储存损伤的发展过程中，血小板脂质丧失与 血小板形态改变和功能损伤有密切关系。
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The Changes of Lipids,Ultrastructure and Aggregation in Platelet Storage Lesion
Cheng Xiaoling Lin Wuchen Li Ruqing,et al.
(Department of Blood Tra nsfusion;Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,P R China)
Abstract：objective:The purpose of this project was to study the s torage lesion of platelet and to investigate the changes of platelet lipids,ultr a-structure and aggregation.Methods:20 units of platelet were div ided into two groups.One was stored at 22℃ and esamined at 3,5 days poststorage .Another added DMSO(5% terminal concentration)was stored at -80℃ and examined a t 1,3 and 6 months poststorage.The fresh platelet was as control.The platelet li pids were assayed by HPLC.The platelet ultra-structure was investigated by elect ron microscope.Results:The loss rates of platelet lipids at 22℃ were 5.8%～31.8% after 3,5 days respectively.The loss rates of lipids at -80℃ w ere 33%～36% after 6 months storage and did not change anymore thereafter.The ul tra-structure alterations were occurred at 22℃ and -80℃ groups in storage.The morphological alterations were expressed as signs of activation.The piatelet agg regative test sbowed the decrease of reaction to agonist ADP.This result showed the functional alteration of platelet.Conclusion:The functional a lterations of platelet are due to the lipids loss and morphological alterations in platelet preparation and storage.
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Key Words：Storage lesion of platelet;HPLC;Lipids;Ultra-structure; Platelet aggregation▲
血小板储存损伤(the Platelet Storage Lesion,PSL)是影响血小板保存的重 要障碍。它可以使血小板输注后体内恢复率下降，生存期缩短，严重影响治疗效果，成为临 床输血亟待解决的难题。鉴于血小板脂质对维持血小板形态结构，发挥止血效能具有重要意 义，同时又具理化性能不稳定的特点，我们调查了保存期间血小板脂质、超微结构及功能的 变化，并就其相关性进行了探讨，旨在预防或减少PSL发生，改善血小板保存质量，提高血 小板输注后体内存活率。
1 材料与方法
1.1 样本准备与分组
1.1.1 样本准备 20位健康献血者，常规采血，采用多血小板血浆法(PRP- PC)经二次离心获得浓缩血小板，血袋为ACD-B三联袋(上海血液中心产品)。
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1.1.2 分组 将每单位浓缩血小板分装成两份，编为甲、乙两组，每组20 个样本；采血当天的新鲜血小板(第一天)为对照组。甲组于22℃水平振摇保存(XHZ-1 型血 小板恒温振荡保存箱，60次/分，苏州产)，分别在2天、3天、4天、5天取样检测，与对照组 比较进行动态观察。乙组用二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂(终浓度为5%)，-80℃保存，分别在1 月、3月、6月取样测定，与对照组比较进行动态观察，用前在37℃水浴快速溶化。
1.2 实验方法
1.2.1 血小板磷脂测定 (1)提取脂质根据 文献报道[1，2]，将 血 小板悬液加入塑料试管中，4℃离心，4000g，10分钟，去上层血浆，用冷生理盐水(4℃)将 血小板扣再悬浮，4℃离心，4000g，10分钟，反复三次，直到完全去除血浆。用冷生理盐水 将血小板调至400×109/L，白细胞和红细胞污染数量少于1/4000血小板。将洗涤后的血小 板悬液在冰水浴中匀浆。取3ml血小板匀浆液+2倍的氯仿-甲醇提取液(2：1，v/v)，离心去 上清液，收集氯仿液；再加入甲醇-水提取液，离心去上清液；取1ml氯仿液，氮气下吹干， -20℃保存备用[2]。(2)试剂 四种磷脂标准品：磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholin e,PC)，磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserin e,PS)，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)均为Sigma产品；乙晴、甲醇为HPLC(色谱) 纯级(上海产)；其它试剂均为分析纯级。(3)仪器与色谱条件 GILSON系列高效液相色谱仪( 法国产)，色谱数据工作站(中科院大连化物所)。色谱柱：μPorasil silica,300mm×4.0mm ，粒径10μm；流动相：乙晴-甲醇-磷酸(90：3：1，v/v)；流速：0.8ml/分钟，进样量： 20μl；紫外检测波长203nm；时间25分钟；柱温：室温。色谱数据工作站进行数据处理。
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1.2.2 血小板超微结构观察 常规电镜样本处理。LKB-V型超薄切片机切 片，切片厚度0.6μm，铅染色，GE2000型电镜观察。
1.2.3 血小板聚集功能测定 诱导剂：ADP，浓度分别为
0.2、0. 1、0.05mM；测定5分钟，记录最大聚集率(PAG)；仪器：TYXN-91型血液凝集仪(上海产)。
1.2.4 浓缩血小板悬液pH测定 AVL990型血气分析仪(瑞士产)。
1.2.5 结果以χ±s表示，进行t检验。
2 结 果
2.1 22℃水平振摇保存血小板。
2.1.1 磷脂的变化 新鲜血小板四种主要磷脂含量依次PC>PE>PS>PI。保存 3天，血小板四种磷脂的总量下降5.8%；保存5天下降31.8%，具有统计学意义(表1)。
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表1 血小板磷脂PC，PE，PI，PS在储存期间的变化n＝20浓度：μg/ml
PC
PE
PS
PI
合计
丢失率(%)
P值
22℃
1天
35.7±7.9
21.0±4.2
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4.6±0.7
71.4
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20.3±5.2
8.6±2.7
4.5±0.5
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5天
24.8±4.9
13.9±3.3
6.4±2.1
3.6±0.5
48.7
31.8*
<0.01
-80℃
1月
24.6±5.4
, 百拇医药
13.2±4.1
6.9±3.1
3.9±1.2
47.6
33.3**
<0.01
3月
21.4±3.7
14.6±3.1
7.2±2.9
3.5±1.0
46.7
, 百拇医药
34.6**
<0.01
6月
22.5±4.1
13.6±4.2
6.2±4.2
3.2±1.1
45.5
36.3**
<0.01
*22℃贮存3天、5天之间比较，P<0.05。**-80℃低温贮存1、3、6月之间比较，P>0.05。
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2.1.2 血小板超微结构变化 透射电镜下观察：新鲜血小板膜光滑，颗粒 清楚，无变形，均匀一致，有少数小泡扩张，可见少量短突(图1)。保存3天，血小板形态完 整，环形小管肿胀扩张，呈半月状，颗粒减少，色变淡，可观察到退变的膜性结构。血小板 微丝，微管，线粒体可见(图2 、图3)。保存5天血小板开放管道系统(OCS)扩张，肿胀明显 ，出现聚集及溶解。
图1.新鲜血小板，膜光滑，颗粒清楚，均匀一致，有少数小泡扩张。×5，000。
图2.22℃保存3天的血小板，形态完整，颗粒减少，空泡增多，OC S扩张，肿胀，呈半月状裂隙。×5，000。
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图3.22℃保存3天的血小板，可见α颗粒与OCS融合的现象，腺粒体可见。×30，000。
2.1.3 血小板聚集功能改变 随着储存时间延长，血小板对ADP的反应性下 降。22℃保存24小时，血小板PAG下降约50%，保存72小时PAG降至10%以下，即使增加ADP浓 度也不能提高PAG(图6)。
图6.22℃水平振摇保存，血小板聚集率的变化
2.1.4 血小板pH的变化见表2。
表2 血小板在22℃保存下pH等指标的变化 (n＝8)
1天
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3天
5天
P值
pH
6.97±0.2
7.02±0.1
<6.0
<0.01
HCO3(mmol/l)
12.2±0.2
6.03±1.2
0.04±0.1
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<0.01
PO2(kPa)
15.5±0.9
13.4±1.2
12.7±1.2
>0.05
表3 ADP诱导的冻-融后血小板最大聚集率(PAG) (n=8) ADP(mM)
0.2
0.1
0.05
新鲜血小板
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90±8.2
83±9.0
冻融后血小板
10±4.1*
10±3.4*
7±2.7*
重悬血小板**
18±6.3*
18±4.5*
16±2.5*
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*冻-融后血小板与新鲜血小板比较，P<0.01；重悬血小板与冻融后血小 板比较，P<0.05。**冻-融后用同型FFP重悬的血小板。
2.2 -80℃冷冻保存血小板
2.2.1 磷脂的变化 -80℃保存1月、3月、6月，血小板磷脂丢失率分别为 33.3%，34.6%，36.3%，三者之间无显著差异，但与新鲜血小板相比较差异显著，P<0.0 1(表1)。
2.2.2 血小板超微结构改变 保存1月，冻一融血小板约58%保持完整的形 态结构，颗粒稍有减少，色变淡，线粒体、α-颗粒、致密颗粒、微管均可见(图4)。约42% 的血小板出现基质肿胀，颗粒边集或溢出膜外，部分内部结构消失，膜溶解(图5)。
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图4.-80℃低温保存(5%OMSO)1月，pH7.02，血小板圆盘状形态和内部散在的细胞器依然存在于大部分血小板中。×5，000。
图5.-80℃保存1月后溶解的血小板，开放管道系统(OCS)消失， 部分残余α颗粒靠向浆膜(边集)。×30，000
2.2.3 血小板聚集功能 表3总结了冻-融血小板对ADP诱导剂的聚集反应。 可见血小板最大聚集率明显下降，用同型新鲜冰冻血浆(FFP)重悬后聚集功能部分恢复。在- 80℃保存1～6月的血小板之间比较，PAG改变不显著。
3 讨 论
3.1 储存损伤对血小板脂质的影响 血小板脂质的主要功能是维持血小板 膜结构完整性和磷脂的促凝血活性。未活化的血小板磷脂PI、PS和PE主要暴露于浆膜内侧面 ，血小板活化时PE和PS转向外侧面，为血浆凝血因子FVa和FXa提供了催化表面，形成血小板 3因子(PF3)，使凝血酶形成速度大大加快[3]。贮存期间血小板的活化和细胞溶 解使磷脂从血小板膜释放到上清液中。血小板磷脂丧失的机制目前还不完全明确，有可能是 脂质过氧化反应所致。贮存期间血小板内源性抗氧化物(如谷光甘肽)逐渐耗尽，使得氧分子 能够对无保护功能的脂质进行过氧化反应。在脂质过氧化反应中，氧分子加入到脂链的烯烃 双键中反复排列，使一个脂质链形成两个醛分子，最终导致脂链破碎。在这一过程中，膜表 面主要负责脂质功能活性的特异性极性基团丧失，维持血小板生理功能的花生四烯酸前体缺 乏，同时生成破坏生物膜完整性的脂肪酰基醛，使血小板膜脂质双层稳定性下降，磷脂丧失 。血小板磷脂的丢失和血小板聚集功能的改变提示：(1)血小板磷脂丧失与血小板功能下降 有密切的关系；(2)冰冻保存血小板，其损伤主要来自冻一融过程，与保存时间的长短无明显关系。
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3.2 储存损伤对血小板超微结构的影响 刚制备的新鲜血小板形态发生相对轻微的改变，复温后这些变化是可逆的。血小板在体外受 到刺激后引起α-颗粒通过与OCS融合进行释放(图3)。随保存时间延长，OCS消失，血小板 气球样变，甚至溶解。血小板具有强大的吞噬能力，颗粒中贮存的许多物质并非来自巨核细 胞或血小板自身，而是来自血浆。故推测，输注后血小板α-颗粒可通过细胞摄粒作用得到恢复[4]。然而，在血小板保存期间，细胞膜磷脂 丢失，细胞摄粒作用减弱，不利于血小板输入体内后的恢复和生存。
3.3 储存对血小板聚集功能和代谢功能的影响
3.3.1 ADP诱导的血小板聚集反应 22℃保存期间，ADP诱导的血小板最大 聚集率PAG随时间递增而下降(图6)。-80℃保存的血小板，冻融后PAG下降显著(P<0.01) ，加入新鲜血浆可部分改善血小板对ADP的反应性(表3)。其原因可能是，新鲜血浆除了给血 小板提供基本能量外，还对在保存中丧失了的某些成分进行了补充，使血小板反应性部分恢 复[5]。可以认为，PSL具有可逆性，保存血小板输注到体内后，可以在一定程度上 恢复其生理功能。我们发现，有时采用聚集仪测定PAG结果为阴性时，在显微镜下往往可以 看到血小板已3～5个聚集成团，这是由于比浊法不能反映少于5个血小板的聚集体[3] 。推测，这种血小板输到体内后仍能恢复一定的生理功能，发挥止血效能(有待进一步证 实)。
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3.3.2 血小板代谢情况 22℃保存1～3天，PRP-PC法制备的浓缩血小板，p H维持在7.0左右，第四天下降至6.75，第五天pH<6.0；HCO3-第一天 为23.23mmol/L ，第五天只有
0.04mmol/L；PO2呈下降趋势。这是由于浓缩血小板以葡萄糖为最 主要燃料 ，而血小板所摄取的葡萄糖80%以上是通过无氧酵解，因而导致大量乳酸产生，引起pH下降 。HCO3-的下降提示血浆缓冲能力被消耗。pH降低导致血小板损伤，可见血小板由 圆盘状变成球形，当pH低于6.0时，新陈代谢衰竭，血小板可发生严重的结构改变和释放反 应，这种改变是不可逆的。
3.4 血小板脂质丧失与血小板形态、结构及功能改变的关系 在保存期间 ，由于“贮存损伤”的影响，血小板受到非生理性刺激，引起活化，释放颗粒，进而聚集； 脂质被消耗或丢失，导致血小板止血功能下降；乳酸盐积蓄，pH下降，血小板新陈代谢衰竭 ，最终导致血小板膜溶解，内容物溢出。在血小板活化过程中，磷脂PS和PE在脂质膜外侧暴 露，形成PF3。PF3能大大加快凝血酶产生的速度，引起血小板广泛聚集。据报道，保存 5天血小板总PF3活性可增加12倍[4]。这与我们的观察一致。由于在体外提前消 耗，血小板输注后止血作用减弱，血液循环中维持时间缩短，体内复苏率降低。
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3.5 结论 根据血小板激活、新陈代谢衰竭及衰老的变化，浓缩血小板储 存损伤的发展可能为多因素过程，血小板脂质的丧失与血小板形态改变和功能损伤有密切关 系。随着对贮存血小板生物化学、形态学和功能损伤的研究，人们对储存损伤的机制更为了 解。目前，白膜法(BC-PC)制备浓缩血小板的方法受到推荐。它可使血小板活化程度降到最 低[6]。实验室研究发现，在血小板中加入血小板活化抑制剂前列腺素l(PGE)、茶 碱(Theophylline)[7]和抗氧化剂维生素E能明显延长血小板的储存时间[8] 。另外，储存容器具有良好的透气性，添加醋酸盐人工介质以改善浓缩血小板pH稳定性及 能量供给，适当的保存温度和振摇频率以及减少白细胞污染等，对血小板完善地保存都是必 不可少的。
参考文献：
[1]Kawasaki T,Kambayashi J,Mori T,et al.Analysis of platelet phospholipid s by high performance liquid chromatography.Thrombosis Research,1984,36:335
, 百拇医药
[2]王凤君，赵云，谢尔凡，等.高效液相色谱法测定生物样品中磷脂含量.第三军 医大学学报，1996，18(1)：67
[3]阮长耿.血小板-基础与临床.第2版，上海：上海科学技术出版社，1987：20
[4]Klinger MHF.The storage lesion of platelets:ultrastructural and functi onal aspects.Ann Hematol,1996,73:103
[5]黎金庆，易永林，王宇，等.血小板冷冻保存的研究.中国输血杂志，1994，7 ：7
[6]Seghatchian JMJ,Krailadsiri p.The platelet storage lesion.Transfusion Medicine Reviews,1997，11(2)：130
[7]Bode AP,Holme S,Heaton WA,et al.Extended storage of platelets in an a rtificial medium with the platelet activation inhibitors prostaglandin E1 and theophylline.Vox Sang,1996,60:105
[8]Koerner TAW,Cunningham MT,Zhang D-S.The role of membrane lipid in the platelet storage lesion.Blood Cell,1992,18:481, http://www.100md.com