重庆地区HBV、HCV感染的肝癌组织中癌基因与抑癌基因的表达
作者：汪荣泉 周子成 杨建明 房殿春
单位：第三军医大学西南医院消化科 重庆 400038
关键词：原发性肝癌 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 癌基因 抑癌 基因
重庆医学000202摘 要：目的 揭示重庆地区肝癌患者HBV和/或H CV的感染与癌组织中癌基因和抑癌基因表达之间的联系。方法 应用 免疫组织化学方法检测HBV和HCV抗原以诊断HBV和HCV感染，癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和 抑癌基因p53蛋白的表达也用免疫组化方法检测。结果 46例肝癌患 者中，HBV感染34例，HCV感染20例；其癌组织中ras p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表达 阳性率分别为58.7%、67.4%、47.8%和30.4%，HCV双重感染14例，单独HBV感染20例，单独HC V 感染6例，无HBV、HCV感染6例；四组不同HBV、HCV感染状况肝癌组织中rasp21、c-myc、c-e rbB-2和p53蛋白表达阳性率无显著差异(P>0.05)。结论 HBV、H CV感染可能与原发性肝癌发生密切相关，HBV、HCV的不同感染状况与癌基因ras、c-myc、c- erbB-2和抑癌基因p53蛋白表达之间的联系并不明显。
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Expression of Oncogenes and Tumor-suppressor Gene in the Tissues of Hepatocellular Carcinoma With Different Types of HBV、HCV Infection
Wang Rongquan Zhou Zicheng Yang Jianmin Fang Dianchun
(Department of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medic al College,Chongqing 400038)
Abstract：Objective:To elucidatc the rclationship bctwccn cxprcssi on of oncogenes and tumor-suppressor gene in the cancerous tissues and HBV and /or HC V infection of hepatocellular carcinoma in Chongqing area.Method: HBV and HCV antigens detected by immunohistochemical method were used to diagnos e HBV and HCV infection.rasp21c-mycc=erbB-2 and p53 proteins were also detected by the same method.Results:It was found that 34 cases had HB V infection,20 cases had HCV infcction in all 46 paticnts.The dctection rate s of rasp21、c-myc、c-erbB-2 and p53 proteins in the cancerous tissues had no sig n ificant difference among the differnet types of HBV、HCV infection:co-infection of HBV、HCV(14 cases),single infection of HBV、HCV(6 cases).Conclusion :It is suggested from above findings that HBV、HCV infection might be clo sely associated with the development of HCC.The rclationship bctwccn the cxprcss ion of rasp21、c-myc、c-crbB-2 and p53 proteins and the different types of HBV、 HCV infection should be farther studied
, 百拇医药
Key words：Hcpatoccllular carcinoma;Hcpatitis B virus;Hepatitis C virus;Oncogene;Tumor-suppressor gene▲
我国西南地区原发性肝癌(HC C)的发生多与HBV、HCV的感染有关。有关血清学、分子流行病学已有较多报道[1、2] 。HCC的发生机理迄今亦不完全清楚，可能与癌基因ras、c-myc、c-erbB-2的激活与抑癌 基因p53的失活密切相关[3]。本文从HBV、HCV的免疫病理诊断入手，对HBV、HC V不 同感染状况肝癌患者的肝组织中癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和抑癌基因p53的蛋白表达作 对比分析，试图探索HBV、HCV致肝细胞癌的可能机理。
1 材料与方法
1.1 病例选择 46例HCC患者均为我院1994年经手术切除的患者，其中38例 切除标本含癌旁肝组织，1例大致正常肝组织为肝内胆管结石患者半肝切除标本。所有标本 均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片。46例患者中，男41例，女5例，年龄23～ 64岁，平均47.3岁。
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1.2 主要试剂 抗HCV CP10抗原的单抗由本院传染科提供，该单抗系以合 成肽CP10免疫小鼠后制备。抗HCVNS3抗原、抗HCVNS5抗原的单抗由北京医科大学肝病研究所 提供。抗HBsAg的多抗、抗p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂 盒购自福州迈新公司(进口分装、即用型)，胰蛋白酶购自Merk公司。
1.3 染色方法 切片常规脱蜡、水化。内源性过氧化物酶阻断剂和非免疫 羊血清室温各孵育30分钟；加抗CP10的单抗室温3小时，抗NS3蛋白的单抗4℃12小时，抗NS5 抗原的单抗4℃12小时，抗HBsAg的多抗室温1小时，即用型p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白 的抗体4℃12小时；加生物素标记的二抗室温孵育30分钟；加链菌素抗生物素蛋白一过氧化 物酶室温孵育30分钟；除正常非免疫羊血清孵育外上述各步均经PBS液洗涤3次，每次5分钟 。DAB显色3～5分钟，苏木素衬染(p53和c-myc蛋白用甲基绿衬染)，脱水、透明、封片。p53 和c-myc蛋白染色时在内源性过氧化物酶阻断剂孵育前用微波处理10分钟。
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1.4 实验对照 用大致正常肝组织、PBS液代替一抗及用不相关的单抗和抗 P物质的多抗代替一抗作阴性对照，做HBsAg、p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白染色时应用 阳性切片作阳性对照。
1.5 统计学分析 所得数据用四格表精确概率法统计，以P<0.05为相 差显著，P<0.01为相差非常显著。
2 结 果
2.1 HBV、HCV在HCC患者的感染状况 癌组织和癌旁肝组织只要其中之一出 现HBsAg阳性染色即认为该患者存在HBV感染；癌组织和癌旁组织中只要其中之一出现HCV核 心抗原、NS3抗原和NS5抗原的任一项阳性即该患者存在HCV感染。46例HCC患者存在HBV感染3 4例，存在HCV感染20例，其中HBV、HCV双重感染14例，单独HBV感染20例，单独HCV感染6例 ，无HBV、HCV感染6例。
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2.2 rasp21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白的检测 rasp21、c-myc、c-erbB -2和p53蛋白在癌组织中的阳性率分别为58.7%、67.4%、47.8%和30.4%，癌旁组织中的阳性 率分别为34.2%、47.4%、44.7%和7.9%，肝癌组织和癌旁组织间的p21和p53蛋白阳性率有显 著性差异(P<0.05)。p21蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆内，c-myc蛋白位于肝细胞和 肝癌细胞的胞核内，c-erbB-2蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞膜上和胞浆内，p53蛋白位于 肝细胞的胞浆内，肝癌细胞的胞核内。
2.3 HCC患者不同HBV和HCV感染状况与p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表 达的关系见表1。
表1 HCC患者不同HBV和HCV感染状况与其癌组织p21、c-myc、c-erb B-2和p53蛋白表达的关系 分 组
例 数
, 百拇医药
p21
c-myc
c-erbB-2
p53
(+)
%
(+)
%
(+)
%
(+)
%
HBV、HCV均(+ )
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14
8
57.1
10
71.4
8
57.1
4
28.6
HBV(+) HCV(-)
20
12
60.0
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15
75.0
11
55.0
7
35.0
HBV(-) HCV(+)
6
3
50.0
1
16.7
1
, 百拇医药
16.7
1
16.7
HBV、HCV均(-)
6
3
50.0
5
83.3
1
16.7
1
16.7
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表1显示，HCC患者中不同HBV和HCV感染组间p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表达无显 著性差异(P>0.05)。
3 讨 论
肝癌发生的分子机理可能与癌基因ras、c-myc、c-erbB-2的激活和抑癌基因p53的失活密切 相关。进一步揭示HBV、HCV的感染与上述肝癌相关基因改变之间的关系有助于深入探索HBV 、HCV的可能致癌机理及为临床研究提供一定的依据。
肝癌患者存在高感染率的HBV与文献报道类似。本文联合应用HCV核心抗原、HCVNS3抗原和HC VNS5抗原的单克隆抗体检测肝癌及其癌旁组织中的HCV相关抗原，有助于提高HCV的检出率， 因HCV的基因组存在高变异性，联合应用上述三种HCV基因组中最保守的编码区抗原的单抗用 于HCV的免疫病理诊断无疑具有重要的意义[4、5]。目前国内联合该三种抗原同时 检测肝癌组织中HCV感染尚无文献报道。
, 百拇医药
HBV与HCV的双重感染可加重丙型肝炎的病情，并促其慢性化[6]。双重感染的肝癌 患者的癌旁肝硬化为100%(另文报道)，提示双重感染具有加重其间接致癌作用。
本文结果提示各种不同感染类型的肝癌患者癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和抑癌基因p5 3表达无显著的差异，这与Laurcnt-Puig[7]的结论类似，其p53突变的发生率均较低。其原因考虑可能与HCV RNA为正链RNA病毒，不存在逆转录，不可能整合入宿主基因组， 其直接致癌作用尚无足够的依据。故不同感染组的患者癌基因和抑癌基因异常表达就不会明显。■
参考文献：
[1]Yang Jianmin,Liu Weiweng.Relationship of Hepatitis C virus inf ection with primary hepatic carcinoma;An investigation of serum HCV RNA in diffe rent population groups.J Med Coll PLA,1993,8(2):109
, 百拇医药
[2]Tomimatsu M,Tshiguro N,Taniai M,et al.Hepatitis C virus antibo dy in patients with primary liver cancer (Hepatocellular carcinoma,cholangiocarc inoma and combined Hepatocellular-cholangiocarcinoma) in Japan.Cancer,1993,72:68 3
[3]顾健人，陈渊卿，蒋惠秋，等.人原发性肝癌的癌基因谱.肿瘤，1998 ，8：289
[4]汪荣泉，周子成，杨建民，等.肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒NS5抗 原的免疫组织化学观察.中华医学杂志，1996，76(8)：623
[5]汪荣泉，周子成，杨建民，等.丙型肝炎病毒核心抗原在肝细胞癌及癌 旁组织中的表达.第三军医大学学报，1996，18(3)：237
[6]潘兆随，蒋琪，方景森.乙型重叠丙型肝炎病毒感染与单纯乙型肝炎的 临床对比分析.中华传染病杂志，1995，13(3)：173
[7]Laurcnt-Puig P,Plcjou JE,Fabrc M,et al.Ovcrcxprcssion of p53:A rarc event in a large series of white patients with hepatocellular carcinoma.He patology,1992,16(5):1171, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院消化科 重庆 400038
关键词：原发性肝癌 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 癌基因 抑癌 基因
重庆医学000202摘 要：目的 揭示重庆地区肝癌患者HBV和/或H CV的感染与癌组织中癌基因和抑癌基因表达之间的联系。方法 应用 免疫组织化学方法检测HBV和HCV抗原以诊断HBV和HCV感染，癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和 抑癌基因p53蛋白的表达也用免疫组化方法检测。结果 46例肝癌患 者中，HBV感染34例，HCV感染20例；其癌组织中ras p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表达 阳性率分别为58.7%、67.4%、47.8%和30.4%，HCV双重感染14例，单独HBV感染20例，单独HC V 感染6例，无HBV、HCV感染6例；四组不同HBV、HCV感染状况肝癌组织中rasp21、c-myc、c-e rbB-2和p53蛋白表达阳性率无显著差异(P>0.05)。结论 HBV、H CV感染可能与原发性肝癌发生密切相关，HBV、HCV的不同感染状况与癌基因ras、c-myc、c- erbB-2和抑癌基因p53蛋白表达之间的联系并不明显。
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Expression of Oncogenes and Tumor-suppressor Gene in the Tissues of Hepatocellular Carcinoma With Different Types of HBV、HCV Infection
Wang Rongquan Zhou Zicheng Yang Jianmin Fang Dianchun
(Department of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medic al College,Chongqing 400038)
Abstract：Objective:To elucidatc the rclationship bctwccn cxprcssi on of oncogenes and tumor-suppressor gene in the cancerous tissues and HBV and /or HC V infection of hepatocellular carcinoma in Chongqing area.Method: HBV and HCV antigens detected by immunohistochemical method were used to diagnos e HBV and HCV infection.rasp21c-mycc=erbB-2 and p53 proteins were also detected by the same method.Results:It was found that 34 cases had HB V infection,20 cases had HCV infcction in all 46 paticnts.The dctection rate s of rasp21、c-myc、c-erbB-2 and p53 proteins in the cancerous tissues had no sig n ificant difference among the differnet types of HBV、HCV infection:co-infection of HBV、HCV(14 cases),single infection of HBV、HCV(6 cases).Conclusion :It is suggested from above findings that HBV、HCV infection might be clo sely associated with the development of HCC.The rclationship bctwccn the cxprcss ion of rasp21、c-myc、c-crbB-2 and p53 proteins and the different types of HBV、 HCV infection should be farther studied
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Key words：Hcpatoccllular carcinoma;Hcpatitis B virus;Hepatitis C virus;Oncogene;Tumor-suppressor gene▲
我国西南地区原发性肝癌(HC C)的发生多与HBV、HCV的感染有关。有关血清学、分子流行病学已有较多报道[1、2] 。HCC的发生机理迄今亦不完全清楚，可能与癌基因ras、c-myc、c-erbB-2的激活与抑癌 基因p53的失活密切相关[3]。本文从HBV、HCV的免疫病理诊断入手，对HBV、HC V不 同感染状况肝癌患者的肝组织中癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和抑癌基因p53的蛋白表达作 对比分析，试图探索HBV、HCV致肝细胞癌的可能机理。
1 材料与方法
1.1 病例选择 46例HCC患者均为我院1994年经手术切除的患者，其中38例 切除标本含癌旁肝组织，1例大致正常肝组织为肝内胆管结石患者半肝切除标本。所有标本 均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片。46例患者中，男41例，女5例，年龄23～ 64岁，平均47.3岁。
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1.2 主要试剂 抗HCV CP10抗原的单抗由本院传染科提供，该单抗系以合 成肽CP10免疫小鼠后制备。抗HCVNS3抗原、抗HCVNS5抗原的单抗由北京医科大学肝病研究所 提供。抗HBsAg的多抗、抗p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂 盒购自福州迈新公司(进口分装、即用型)，胰蛋白酶购自Merk公司。
1.3 染色方法 切片常规脱蜡、水化。内源性过氧化物酶阻断剂和非免疫 羊血清室温各孵育30分钟；加抗CP10的单抗室温3小时，抗NS3蛋白的单抗4℃12小时，抗NS5 抗原的单抗4℃12小时，抗HBsAg的多抗室温1小时，即用型p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白 的抗体4℃12小时；加生物素标记的二抗室温孵育30分钟；加链菌素抗生物素蛋白一过氧化 物酶室温孵育30分钟；除正常非免疫羊血清孵育外上述各步均经PBS液洗涤3次，每次5分钟 。DAB显色3～5分钟，苏木素衬染(p53和c-myc蛋白用甲基绿衬染)，脱水、透明、封片。p53 和c-myc蛋白染色时在内源性过氧化物酶阻断剂孵育前用微波处理10分钟。
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1.4 实验对照 用大致正常肝组织、PBS液代替一抗及用不相关的单抗和抗 P物质的多抗代替一抗作阴性对照，做HBsAg、p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白染色时应用 阳性切片作阳性对照。
1.5 统计学分析 所得数据用四格表精确概率法统计，以P<0.05为相 差显著，P<0.01为相差非常显著。
2 结 果
2.1 HBV、HCV在HCC患者的感染状况 癌组织和癌旁肝组织只要其中之一出 现HBsAg阳性染色即认为该患者存在HBV感染；癌组织和癌旁组织中只要其中之一出现HCV核 心抗原、NS3抗原和NS5抗原的任一项阳性即该患者存在HCV感染。46例HCC患者存在HBV感染3 4例，存在HCV感染20例，其中HBV、HCV双重感染14例，单独HBV感染20例，单独HCV感染6例 ，无HBV、HCV感染6例。
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2.2 rasp21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白的检测 rasp21、c-myc、c-erbB -2和p53蛋白在癌组织中的阳性率分别为58.7%、67.4%、47.8%和30.4%，癌旁组织中的阳性 率分别为34.2%、47.4%、44.7%和7.9%，肝癌组织和癌旁组织间的p21和p53蛋白阳性率有显 著性差异(P<0.05)。p21蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆内，c-myc蛋白位于肝细胞和 肝癌细胞的胞核内，c-erbB-2蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞膜上和胞浆内，p53蛋白位于 肝细胞的胞浆内，肝癌细胞的胞核内。
2.3 HCC患者不同HBV和HCV感染状况与p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表 达的关系见表1。
表1 HCC患者不同HBV和HCV感染状况与其癌组织p21、c-myc、c-erb B-2和p53蛋白表达的关系 分 组
例 数
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p21
c-myc
c-erbB-2
p53
(+)
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HBV、HCV均(+ )
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14
8
57.1
10
71.4
8
57.1
4
28.6
HBV(+) HCV(-)
20
12
60.0
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15
75.0
11
55.0
7
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HBV(-) HCV(+)
6
3
50.0
1
16.7
1
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1
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HBV、HCV均(-)
6
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50.0
5
83.3
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16.7
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表1显示，HCC患者中不同HBV和HCV感染组间p21、c-myc、c-erbB-2和p53蛋白表达无显 著性差异(P>0.05)。
3 讨 论
肝癌发生的分子机理可能与癌基因ras、c-myc、c-erbB-2的激活和抑癌基因p53的失活密切 相关。进一步揭示HBV、HCV的感染与上述肝癌相关基因改变之间的关系有助于深入探索HBV 、HCV的可能致癌机理及为临床研究提供一定的依据。
肝癌患者存在高感染率的HBV与文献报道类似。本文联合应用HCV核心抗原、HCVNS3抗原和HC VNS5抗原的单克隆抗体检测肝癌及其癌旁组织中的HCV相关抗原，有助于提高HCV的检出率， 因HCV的基因组存在高变异性，联合应用上述三种HCV基因组中最保守的编码区抗原的单抗用 于HCV的免疫病理诊断无疑具有重要的意义[4、5]。目前国内联合该三种抗原同时 检测肝癌组织中HCV感染尚无文献报道。
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HBV与HCV的双重感染可加重丙型肝炎的病情，并促其慢性化[6]。双重感染的肝癌 患者的癌旁肝硬化为100%(另文报道)，提示双重感染具有加重其间接致癌作用。
本文结果提示各种不同感染类型的肝癌患者癌基因ras、c-myc、c-erbB-2和抑癌基因p5 3表达无显著的差异，这与Laurcnt-Puig[7]的结论类似，其p53突变的发生率均较低。其原因考虑可能与HCV RNA为正链RNA病毒，不存在逆转录，不可能整合入宿主基因组， 其直接致癌作用尚无足够的依据。故不同感染组的患者癌基因和抑癌基因异常表达就不会明显。■
参考文献：
[1]Yang Jianmin,Liu Weiweng.Relationship of Hepatitis C virus inf ection with primary hepatic carcinoma;An investigation of serum HCV RNA in diffe rent population groups.J Med Coll PLA,1993,8(2):109
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[2]Tomimatsu M,Tshiguro N,Taniai M,et al.Hepatitis C virus antibo dy in patients with primary liver cancer (Hepatocellular carcinoma,cholangiocarc inoma and combined Hepatocellular-cholangiocarcinoma) in Japan.Cancer,1993,72:68 3
[3]顾健人，陈渊卿，蒋惠秋，等.人原发性肝癌的癌基因谱.肿瘤，1998 ，8：289
[4]汪荣泉，周子成，杨建民，等.肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒NS5抗 原的免疫组织化学观察.中华医学杂志，1996，76(8)：623
[5]汪荣泉，周子成，杨建民，等.丙型肝炎病毒核心抗原在肝细胞癌及癌 旁组织中的表达.第三军医大学学报，1996，18(3)：237
[6]潘兆随，蒋琪，方景森.乙型重叠丙型肝炎病毒感染与单纯乙型肝炎的 临床对比分析.中华传染病杂志，1995，13(3)：173
[7]Laurcnt-Puig P,Plcjou JE,Fabrc M,et al.Ovcrcxprcssion of p53:A rarc event in a large series of white patients with hepatocellular carcinoma.He patology,1992,16(5):1171, 百拇医药