丁基胆碱酯酶基因、载脂蛋白E基因与阿尔茨海默病的相关性
作者：毕胜 张昱 赵庆杰 吴江 王德生 盛雨晨
单位：毕胜(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；张昱(白求恩医科大学第一临床学院神经内科)；赵庆杰(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；吴江(白求恩医科大学第一临床学院神经内科)；王德生(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；盛雨晨(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))
关键词：阿尔茨海默病；载脂蛋白E基因；丁基胆碱酯酶基因
中国现代医学杂志000203 目的：探讨中国汉族人载脂蛋白E(ApoE)基因、丁基胆碱酶基因(BCHE)基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的相关情况。方法：应用PCR-RFLP方法，在38例患者和40例正常人中观察ApoE和BCHE基因多态性的分布，进行关联分析。结果：AD患者与ApoE基因的等位基因ε4正关联；BCHE基因多态性与AD无关联。结论：在中国人群中，ApoE ε4是AD发病的风险因子；CBHE-K等位基因不是AD发病的风险因子。
, 百拇医药
分类号 R749.16
A STUDY ON THE CORRELATION BETWEEN ApoE GENE, BCHE
GENE AND ALZHEIMER`S DISEASE IN CHINESE
Bi Sheng, Zhang Yu, Zhao Qingjie, et al
(Department of Neurology, First Clinical College of Harbin Medical University, Harbiin 150001)
Objective:To detect the correlation between ApoE gene polymorphism, butyrylcholines
, 百拇医药
terase (BCHE) gene and Alzheimer Disease (AD) in Chinese.Methods:The gene polymorph
ism of ApoE gene and BCHE gene were genotyped in 38 AD patients and 40 control cases with PCR-RFLP analysis.Results:Ad was associated with ApoE ε4 allele; and there was no association between AD and BCHE gene polymorphism.Conclusions:In Chinese, the ApoEε4 allele is a risk factor of AD, whereas BCHE-K allele is not a risk factor of AD.
Key Words:Alzheimer’s Disease;ApoE Gene;BCHE Gene
, 百拇医药
阿尔茨海默(Alzheimer's disease, AD)具有遗传异质性。研究证实，位于19号染色体的载脂蛋白E(ApoE)基因的ε4等位基因是家族性迟发性AD和散发性AD的高危因子；但是该基因的作用机制目前还不清楚。在AD患者脑内存在有神经递质乙酰胆硷的减少和胆硷能神经元的机能不良和丢失[1]。而此种情况被认为是AD病人某些认知缺陷的原因之一。近年发现，在AD病人脑内老年斑(SP)、神经原纤维缠结(NFT)和淀粉样血管病中发现有丁基胆碱酯酶(BCHE)活性的改变[2，3]。因此，作为AD的另一种病理伴随性物质，BCHE基因与AD的相互关系受到了普遍关注，我国尚未见这方面的报道。本文应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术，观察AD患者ApoE基因、BCHE基因多态性的分布，并对它们与AD的相互关系及在AD患者中的相互影响进行探讨。
1 资料和方法
1.1 资料
, 百拇医药
所有病例由哈医大一院和白求恩医大一院提供。根据美国精神病学会诊断和统计手册第4版痴呆诊断标准(DSM-Ⅳ)作出痴呆的诊断，再根据NINCDS-ADRDA作出AD诊断。以健康老年人为正常对照。本研究含AD患者38例，其中男21例，女17例，年龄60～79岁；对照组40例，男24例，女16例，年龄60～81岁。两组研究对象均为随机选择，无血缘关系。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA。
1.2.2 ApoE基因型检测[4] PCR引物为5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA - 3′ 和 5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′。反应体系为10μl，内含基因组DNA 100ng，TaqDNA聚合酶0.3U，4×dNTP50μmol/L，引物各10pmol,MgCl2 1.5mmol/L,20mM Tris-HCl(PH8.0)，KCl 25mM，二甲基亚砜(DMSO)1μl。反应程序为：95℃5min，35周期(94℃30s，65℃30s，72℃90s)，72℃5min。取PCR产物10μl，加20U HhaⅠ内切酶，酶切8h后，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后根据电泳带型确定ApoE基因型。
, 百拇医药
1.2.3 BCHE基因型检测[5] 引物为5′-ATATTTTACAGGAAATATTGATGTA-3′和5′-ATTAGAGACCCACACAACTT-3′。PCR反应体积为25μl，内含50ng基因组DNA，1.5U TaqDNA聚合酶，200μMdNTPs,引物各5pmol,反应程序为94℃20 s，35周期(53℃20s，72℃20s，94℃1min)。取PCR产物5μl，加5U MaeⅢ内切酶，酶切过夜，3%琼脂糖电泳分离酶切产物，根据电泳带型确定BCHE基因型。
1.3 统计学处理
计算各等位基因和基因型频率的分布，吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡；计算相对危险率(RR)，对AD与ApoE基因或BCHE基因多态性进行关联分析。
2 结果
2.1 AD患者与正常人ApoE各等位基因和基因型频率分布(表1)
, 百拇医药
表1 载脂蛋白(ApoE)基因多态性分布 组别
人数
基因型
等位基因
ε2/2
ε3/3
ε4/4
ε3/2
ε4/3
ε4/2
ε2
ε3
ε4
, 百拇医药
AD组
38
0
(0.000)
19
(0.005)
0
(0.000)
2
(0.053)
141)
(0.368)
3
, http://www.100md.com
(0.079)
5
(0.065)
54
(0.711)
171)
(0.024)
对照组
40
0
(0.000)
29
(0.725)
, 百拇医药
0
(0.000)
3
(0.075)
6
(0.150)
2
(0.050)
5
(0.062)
67
(0.838)
8
, http://www.100md.com
(0.100)
注：1)与对照组比较P<0.05
关联分析结果表明，AD患者与ApoE基因ε4等位基因正关联(RR=2.593，P<0.05)，与ε4/3基因型正关联(RR=3.306，P<0.05)，但与ε4/2基因型无关。
2.2 AD患者与正常人BCHE各等位基因和基因型频率分布(表2)
表2 丁基胆碱酯酶(BCHE)基因多态性分布 组别
人数
基因型
等位基因
W/W
, 百拇医药
W/K
K/K
W
K
AD组
38
24(0.632)
13(0.342)
1(0.026)
61(0.803)
15(0.197)
对照组
40
, http://www.100md.com
25(0.625)
13(0.325)
2(0.050)
63(0.788)
17(0.212)
结果表明：AD与BCHE各等位基因、基因型均无关联。
2.3 有或无ApoEε4基因的AD患者与BCHE各基因型关联分析(表3)表3 有或无ApoEε4基因的研究对象的
BCHE基因多态性分布 组别
BCHE基因型
W/W
, 百拇医药
W/K
K/K
ApoEε4+
AD组
17
8
1
对照组
19
9
2
ApoEε4-
AD组
, 百拇医药
7
5
0
对照组
6
4
0
3 讨论
BCHE基因位于第3号染色体上，至少存在有7种以上的遗传变异[6]。BCHE基因的多态性位点位于BCHEcDNA的第1615核苷酸，由碱基G或A构成，相应地产生三种BCHE基因型：WW，KW和KK。当该位点发生由G到A的替代时，会发生Ala539Thr氨基酸替代，同时使得BCHE的活性降低。
本研究在中国汉族人群中检测了ApoE基因、BCHE基因多态性与AD的相互关系，并对AD患者中两者间的相互影响进行了探讨，发现ApoE基因等位基因ε4与AD正关联，这与周伯荣等[7]的报道一致；表明中国人ApoE基因多态性与AD的关联可能仅由等位基因ε4频率增高所致。本研究发现ApoEε4/3基因型与AD正关联，而ε4/2基因型与AD却无关联，我们认为可能是由于在进行ApoE基因分型后样本数量减少所致。Lehmann等[8]曾报道携带有ApoEε4的AD患者同时携带有较高频率的BCHE-K，而本研究发现BCHE-K多态与AD无关联，与文献报道一致[9，10]。表明中国人群中，BCHE基因多态性并不构成AD的风险因子。
, 百拇医药
我们按照是否具有ApoEε4等位基因将AD患者分为两组，分别与相应对照组进行比较。分析结果显示，在AD患者中，BCHE基因多态性与ApoE基因多态性之间无明显相互影响。
目前的实验结果再次证实ApoE的ε4等位基因是AD发病的一个风险因子，初步显示BCHE基因与AD遗传易感性无关。我们拟在有关研究结果基础上，进一步深入探索AD的病因和与诊断或预测有关的分子生物学指标。
参考文献
1 Whitehouse PJ, Price DL,Struble RG, et al.Alzheimer's disease and senile dementia:loss of neurons in the basal forebrain.Science, 1992,225:1237～1239
2 Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of A-lzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord, 1995,9:23～28
, 百拇医药
3 Gomez-Ramos P,Bouras C,Moran MA,Ultrastructural localization of butrrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients. Brain Res, 1994,640:17～24
4 Wehnum PR,Price WH,Blundell G, et al. Apolipoprotein E g-enotyping by one-stage PCR.Lancet, 1991,337:1158～1162
5 Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M.Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification created restriction site.Hum Hered, 1996,26～31
, http://www.100md.com
6 Whittaker M,britten JJ.Eh, a new allele at cholinesterase locus. Hum Hered, 1987,37:54～58
7 周伯荣，钱采韵，彭光莹，等.载脂蛋白E基因多态性与Alzheimer病.中华老年医学杂志，1999；18：10～12
8 Lehmann DJ,Johnston C,Smith AD.Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late onset confirmed Alzheimer disease. Hum Mol Genet, 1997,6:1933～1936
9 Singleton AB, Smith G,Gibson AM,et al.No association between the K variant of the butyrylcholinesterase gene and pathologically confirmed Alzheimer's disease. Hum Mol Genet, 1998,7(5):937～939
10 Brindle N, Song E, Rogaeva S, et al.Analysis of the buty-rylcholinesterase gene and nearby chromosome 3 markers in Alzheimer disease. Hum Genet, 1998,7(5):933～935
收稿日期：1999-04-12, 百拇医药
单位：毕胜(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；张昱(白求恩医科大学第一临床学院神经内科)；赵庆杰(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；吴江(白求恩医科大学第一临床学院神经内科)；王德生(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))；盛雨晨(哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科(150001))
关键词：阿尔茨海默病；载脂蛋白E基因；丁基胆碱酯酶基因
中国现代医学杂志000203 目的：探讨中国汉族人载脂蛋白E(ApoE)基因、丁基胆碱酶基因(BCHE)基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的相关情况。方法：应用PCR-RFLP方法，在38例患者和40例正常人中观察ApoE和BCHE基因多态性的分布，进行关联分析。结果：AD患者与ApoE基因的等位基因ε4正关联；BCHE基因多态性与AD无关联。结论：在中国人群中，ApoE ε4是AD发病的风险因子；CBHE-K等位基因不是AD发病的风险因子。
, 百拇医药
分类号 R749.16
A STUDY ON THE CORRELATION BETWEEN ApoE GENE, BCHE
GENE AND ALZHEIMER`S DISEASE IN CHINESE
Bi Sheng, Zhang Yu, Zhao Qingjie, et al
(Department of Neurology, First Clinical College of Harbin Medical University, Harbiin 150001)
Objective:To detect the correlation between ApoE gene polymorphism, butyrylcholines
, 百拇医药
terase (BCHE) gene and Alzheimer Disease (AD) in Chinese.Methods:The gene polymorph
ism of ApoE gene and BCHE gene were genotyped in 38 AD patients and 40 control cases with PCR-RFLP analysis.Results:Ad was associated with ApoE ε4 allele; and there was no association between AD and BCHE gene polymorphism.Conclusions:In Chinese, the ApoEε4 allele is a risk factor of AD, whereas BCHE-K allele is not a risk factor of AD.
Key Words:Alzheimer’s Disease;ApoE Gene;BCHE Gene
, 百拇医药
阿尔茨海默(Alzheimer's disease, AD)具有遗传异质性。研究证实，位于19号染色体的载脂蛋白E(ApoE)基因的ε4等位基因是家族性迟发性AD和散发性AD的高危因子；但是该基因的作用机制目前还不清楚。在AD患者脑内存在有神经递质乙酰胆硷的减少和胆硷能神经元的机能不良和丢失[1]。而此种情况被认为是AD病人某些认知缺陷的原因之一。近年发现，在AD病人脑内老年斑(SP)、神经原纤维缠结(NFT)和淀粉样血管病中发现有丁基胆碱酯酶(BCHE)活性的改变[2，3]。因此，作为AD的另一种病理伴随性物质，BCHE基因与AD的相互关系受到了普遍关注，我国尚未见这方面的报道。本文应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术，观察AD患者ApoE基因、BCHE基因多态性的分布，并对它们与AD的相互关系及在AD患者中的相互影响进行探讨。
1 资料和方法
1.1 资料
, 百拇医药
所有病例由哈医大一院和白求恩医大一院提供。根据美国精神病学会诊断和统计手册第4版痴呆诊断标准(DSM-Ⅳ)作出痴呆的诊断，再根据NINCDS-ADRDA作出AD诊断。以健康老年人为正常对照。本研究含AD患者38例，其中男21例，女17例，年龄60～79岁；对照组40例，男24例，女16例，年龄60～81岁。两组研究对象均为随机选择，无血缘关系。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA。
1.2.2 ApoE基因型检测[4] PCR引物为5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA - 3′ 和 5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′。反应体系为10μl，内含基因组DNA 100ng，TaqDNA聚合酶0.3U，4×dNTP50μmol/L，引物各10pmol,MgCl2 1.5mmol/L,20mM Tris-HCl(PH8.0)，KCl 25mM，二甲基亚砜(DMSO)1μl。反应程序为：95℃5min，35周期(94℃30s，65℃30s，72℃90s)，72℃5min。取PCR产物10μl，加20U HhaⅠ内切酶，酶切8h后，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后根据电泳带型确定ApoE基因型。
, 百拇医药
1.2.3 BCHE基因型检测[5] 引物为5′-ATATTTTACAGGAAATATTGATGTA-3′和5′-ATTAGAGACCCACACAACTT-3′。PCR反应体积为25μl，内含50ng基因组DNA，1.5U TaqDNA聚合酶，200μMdNTPs,引物各5pmol,反应程序为94℃20 s，35周期(53℃20s，72℃20s，94℃1min)。取PCR产物5μl，加5U MaeⅢ内切酶，酶切过夜，3%琼脂糖电泳分离酶切产物，根据电泳带型确定BCHE基因型。
1.3 统计学处理
计算各等位基因和基因型频率的分布，吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡；计算相对危险率(RR)，对AD与ApoE基因或BCHE基因多态性进行关联分析。
2 结果
2.1 AD患者与正常人ApoE各等位基因和基因型频率分布(表1)
, 百拇医药
表1 载脂蛋白(ApoE)基因多态性分布 组别
人数
基因型
等位基因
ε2/2
ε3/3
ε4/4
ε3/2
ε4/3
ε4/2
ε2
ε3
ε4
, 百拇医药
AD组
38
0
(0.000)
19
(0.005)
0
(0.000)
2
(0.053)
141)
(0.368)
3
, http://www.100md.com
(0.079)
5
(0.065)
54
(0.711)
171)
(0.024)
对照组
40
0
(0.000)
29
(0.725)
, 百拇医药
0
(0.000)
3
(0.075)
6
(0.150)
2
(0.050)
5
(0.062)
67
(0.838)
8
, http://www.100md.com
(0.100)
注：1)与对照组比较P<0.05
关联分析结果表明，AD患者与ApoE基因ε4等位基因正关联(RR=2.593，P<0.05)，与ε4/3基因型正关联(RR=3.306，P<0.05)，但与ε4/2基因型无关。
2.2 AD患者与正常人BCHE各等位基因和基因型频率分布(表2)
表2 丁基胆碱酯酶(BCHE)基因多态性分布 组别
人数
基因型
等位基因
W/W
, 百拇医药
W/K
K/K
W
K
AD组
38
24(0.632)
13(0.342)
1(0.026)
61(0.803)
15(0.197)
对照组
40
, http://www.100md.com
25(0.625)
13(0.325)
2(0.050)
63(0.788)
17(0.212)
结果表明：AD与BCHE各等位基因、基因型均无关联。
2.3 有或无ApoEε4基因的AD患者与BCHE各基因型关联分析(表3)表3 有或无ApoEε4基因的研究对象的
BCHE基因多态性分布 组别
BCHE基因型
W/W
, 百拇医药
W/K
K/K
ApoEε4+
AD组
17
8
1
对照组
19
9
2
ApoEε4-
AD组
, 百拇医药
7
5
0
对照组
6
4
0
3 讨论
BCHE基因位于第3号染色体上，至少存在有7种以上的遗传变异[6]。BCHE基因的多态性位点位于BCHEcDNA的第1615核苷酸，由碱基G或A构成，相应地产生三种BCHE基因型：WW，KW和KK。当该位点发生由G到A的替代时，会发生Ala539Thr氨基酸替代，同时使得BCHE的活性降低。
本研究在中国汉族人群中检测了ApoE基因、BCHE基因多态性与AD的相互关系，并对AD患者中两者间的相互影响进行了探讨，发现ApoE基因等位基因ε4与AD正关联，这与周伯荣等[7]的报道一致；表明中国人ApoE基因多态性与AD的关联可能仅由等位基因ε4频率增高所致。本研究发现ApoEε4/3基因型与AD正关联，而ε4/2基因型与AD却无关联，我们认为可能是由于在进行ApoE基因分型后样本数量减少所致。Lehmann等[8]曾报道携带有ApoEε4的AD患者同时携带有较高频率的BCHE-K，而本研究发现BCHE-K多态与AD无关联，与文献报道一致[9，10]。表明中国人群中，BCHE基因多态性并不构成AD的风险因子。
, 百拇医药
我们按照是否具有ApoEε4等位基因将AD患者分为两组，分别与相应对照组进行比较。分析结果显示，在AD患者中，BCHE基因多态性与ApoE基因多态性之间无明显相互影响。
目前的实验结果再次证实ApoE的ε4等位基因是AD发病的一个风险因子，初步显示BCHE基因与AD遗传易感性无关。我们拟在有关研究结果基础上，进一步深入探索AD的病因和与诊断或预测有关的分子生物学指标。
参考文献
1 Whitehouse PJ, Price DL,Struble RG, et al.Alzheimer's disease and senile dementia:loss of neurons in the basal forebrain.Science, 1992,225:1237～1239
2 Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of A-lzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord, 1995,9:23～28
, 百拇医药
3 Gomez-Ramos P,Bouras C,Moran MA,Ultrastructural localization of butrrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients. Brain Res, 1994,640:17～24
4 Wehnum PR,Price WH,Blundell G, et al. Apolipoprotein E g-enotyping by one-stage PCR.Lancet, 1991,337:1158～1162
5 Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M.Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification created restriction site.Hum Hered, 1996,26～31
, http://www.100md.com
6 Whittaker M,britten JJ.Eh, a new allele at cholinesterase locus. Hum Hered, 1987,37:54～58
7 周伯荣，钱采韵，彭光莹，等.载脂蛋白E基因多态性与Alzheimer病.中华老年医学杂志，1999；18：10～12
8 Lehmann DJ,Johnston C,Smith AD.Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late onset confirmed Alzheimer disease. Hum Mol Genet, 1997,6:1933～1936
9 Singleton AB, Smith G,Gibson AM,et al.No association between the K variant of the butyrylcholinesterase gene and pathologically confirmed Alzheimer's disease. Hum Mol Genet, 1998,7(5):937～939
10 Brindle N, Song E, Rogaeva S, et al.Analysis of the buty-rylcholinesterase gene and nearby chromosome 3 markers in Alzheimer disease. Hum Genet, 1998,7(5):933～935
收稿日期：1999-04-12, 百拇医药