雪旺细胞和纤连蛋白对脊髓损伤后功能恢复的初步研究
作者：赵寅涛 李立新 戴建础
单位：赵寅涛(南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科(南京 210008))；李立新 戴建础(南京医科大学第一附属医院神经外科(南京 210029))
关键词：雪旺细胞；纤连蛋白；脊髓诱发电位；功能
中国现代医学杂志000202 目的：观察雪旺细胞和纤连蛋白对大鼠损伤的脊髓功能的影响。方法：将体外培养的雪旺细胞结合纤连蛋白植入大鼠半切损伤的脊髓内，用脊髓诱发电位及图像分析方法比较治疗组和对照组诱发电位潜伏期，再生轴突计数及二者间的关系。结果：雪旺细胞结合纤连蛋白治疗组脊髓诱发电位潜伏期显著缩短，再生轴突明显增多，二者呈负相关。结论：雪旺细胞结合纤连蛋白移植具有促进脊髓损伤后轴突再生的作用，并能部分恢复脊髓的传入功能。
分类号 R-332
, 百拇医药
THE EFFECTS OF SCHWANN CELLS AND FIBRONECTIN ON THE FUNCTION RECOVERY OF SCATHING SPINAL CORD IN RATS
Zhao Yintao, Li Lixing, Dai Jianchu
Department of Neurosurgery, Affiliated Gulou Hospital of Nanjing,Medical College of Nanjing University, Nanjing, Jiangsu 210008
Objective：To investigate whether Schwann Cells (SCs) and fibronectin (FN) could promote the function recovery of scathing spinal cords in adult rats. Methods:After cultured SCs combined with FN were grafted into hemi-resected lumbar spinal cords of adult rats, we used surface recording of spinal cord evoked potential (SCEP) and image analysis system to compare the latent period of SCEP and count the axon number between the therapeutic group and the control group. Results:In the group treated with SCs and FN, the latency of P1 wave was significantly shorten and the number of regrowed axons significant increased, with a significant negative correlation. Conclusions:Schwann cells together with fibronectin grafted to hemi-resected lumbar spinal cords in adult rats can promote partial conductive function repair of scathing spinal cords.
, 百拇医药
Key Words:Schwann Cell;Fibronectin;Spinal Cord Evoked Potential
二十世纪八十年代中期，Kromer等[1]将雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)植入中枢神经损伤区，发现SCs能诱导、促进损伤轴突再生。进入90年代以来，国外利用培养的SCs移植治疗脊髓损伤的研究日益增多[2～4]。这些研究多侧重于形态学，而对脊髓损伤后功能的报道甚少。因此，本文就培养的SCs及其分泌的细胞外基质分子之一纤连蛋白(Fibronectin,FN)，是否在体内具有促进损伤脊髓功能恢复的作用，作初步探讨。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
无菌取SD乳鼠坐骨神经，剥除神经外膜和束膜，机械加酶消化法分散细胞，应用差速粘附加阿糖胞苷(10-5M,Sigma,Co.)，纯化雪旺细胞[5]。最后用FN(20μl/ml)加入基础培养液刺激细胞分裂增殖。培养的细胞用PAP法行抗S-100蛋白免疫组化染色，阳性细胞>95%。移植前以0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA将细胞分离、浓缩，制成1×107个细胞/ml密度的悬液备用。活细胞计数>95%。
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1.2 方法
1.2.1 实验分组 30只雌性SD大鼠，体重185～210g。随机取10只测定脊髓诱发电位(SCEP) P1潜伏期。测试完，将30只大鼠重新随机分成三组，每组10只，SCs/FN移植组、FN移植组和对照组，供基础培养液移植。
1.2.2 脊髓诱发电位正常值测定 取首次随机抽取的10只动物，2%戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔麻醉，分离左测坐骨神经至胫腓神经分叉处。将刺激电极置分叉处上方，外测0.5cm置一参考电极；记录电极插入T11-T12椎间皮下0.3cm，参考电极置其外测0.5cm处皮下。测试仪器为维京IV型诱发电位仪(Nicolet,Co)，波宽0.2ms，频率0.5Hz正方波脉冲，记录信号迭加20次。
1.2.3 脊髓半切模型制作及悬液移植 全部30只大鼠同前法行腹腔麻醉，取后正中切口，切除T13、L1椎板，显露脊髓。在显微镜下，作脊髓左半横切，向内达中央管，并切除0.2cm左半脊髓，压迫止血后，用Hamilton微量注射器按上述分组将10μl下述液体：SCs/FN，FN(20μl/ml)，基础培养液，分别注入脊髓残端实质内。
, 百拇医药
1.2.4 术后处理 术后3d肌注庆大霉素(3mg/kg，2次/d)。每日挤压排尿，单笼喂养。每周行1次左后肢Tarlov[6]运动功能计分，共6周。
1.2.5 术后SCEP检测 术后6周，因血尿、感染、左后肢溃疡，11只大鼠死亡未获检查。存活19只，其中SCs/FN组8只，FN组6只，对照组5只，于术后6周行皮肤电极SECP P1潜伏期测定。
1.2.6 再生轴突计数 移植后6周，取移植损伤区脊髓1cm长节段，4%多聚甲醛固定，石蜡切片，Bielshowsdy's银染色，显微镜-微机图像处理系统(Kontron,IBAS 2.5全图像分析仪，德国)计数移植损伤区内的再生轴突。由于在对照组的脊髓移植损伤区内，没有观察到再生轴突，所以，我们仅对SCs/FN组6例和FN组中5例的脊髓移植损伤区的再生轴突计数，并取其平均值行统计学处理。
1.2.7 结果处理 应用t检验，H检验，方差分析两两比较及相关性分析处理数据。
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2 结果
2.1 临床功能评价
存活19只大鼠术后左后肢瘫。每周1次左后肢的Tarlov运动计分，每个点示均值，经H检验显示3组在统计学上无显著性差异(P>0.05)。
2.2 P1潜伏期测定
电刺激坐骨神经在皮肤表面获得的SCEP较小，一般为2～20μv,迭加20次，可显示其波形及分布。研究表明，在体记录时神经组织以外因素对诱发电位影响较大，而反应潜伏期不受影响[7]。故本实验以P1潜伏期作为了解脊髓传导功能的指标，其结果较可靠。各组P1潜伏期比较见附表。
附表 四组P1潜伏期比较(
±s) 组别
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例数
P1潜伏期
正常组
10
1.07±0.18
SCs/FN组
8
1.57±0.25
FN组
6
1.84±0.29
对照组
5
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2.33±0.33
由附表看出，无论治疗组或对照组P1潜伏期均较正常组明显延长(P<0.01)。统计分析表明SCs/FN组P1潜伏期较另两组明显缩短，而FN组与对照组间无显著差别。
2.3 再生轴突计数
对SCs/FN组6例、FN组5例再生轴突计数结果分别为(346.63±153.61)和(110.38±18.54),t=3.37,P<0.01。结果显示SCs/FN移植有显著促进轴突再生的作用。
2.4 轴突计数与P1潜伏期相关性分析
结果表明：再生轴突数量与P1潜伏期呈明显负相关。说明当再生轴突数量显著增多时，可导致P1潜伏期的缩短。SCs/FN组再生轴突明显多与FN组，其潜伏期较后者明显缩短，提示移植含雪旺细胞的悬液后脊髓传导功能有部分恢复。
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3 讨论
本实验以培养的SCs结合FN移植，治疗大鼠实验性脊髓损伤，脊髓诱发电位检查显示SCs/FN移植具有显著缩短脊髓损伤后SCEP P1潜伏期的作用，而单纯FN移植，对P1潜伏期无明显影响。说明在SCs/FN移植组中，主要是SCs起作用。一般认为，P1为脊髓背根纤维在脊髓中直接延续的动作电位，主要经脊髓同侧后索、部分经侧索传导[8，9]。由于组成大鼠坐骨神经的脊神经多数在L1-S2椎体水平进入脊髓，故记录电极在L3椎体平面以上记录到的SCEP为传导性的SCEP[7]。本实验中脊髓损伤位与T13-L1椎体水平，刺激同侧坐骨神经，在T11-T12椎体间记录SCEP，三组均记录到较正常延长的P1潜伏期，证实上述论断。本实验首次将表面电极记录SCEP技术应用与细胞移植治疗脊髓损伤的功能测定，具有创伤小，结果较可靠的优点。它对于观察脊髓长传导束的功能、预测感觉功能恢复程度具有帮助。
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从再生轴突计数的统计分析上看,P1潜伏期的缩短与轴突数量较多具有相关性,表明SCs/FN移植具有显著促进脊髓损伤后轴突再生的作用。其机制可能有以下几点:SCs可分泌多种神经营养因子,形成适合再生的微环境;产生细胞外基质、细胞粘附分子、神经类固醇等,诱导、支持轴突再生;同时,FN具有促进移植的SCs存活、分裂增殖及迁移的作用[10]。
参考文献
1 Kromer LF,Cornbrooks CJ.Transplants of Schwann cell cultures promote axonal regeneration in the adult mammalian brain.Proc Natl Acad Sci USA,1985;82:6330
2 Chen A,Xu XM,Kleitman N,et al.Methylprednisolone administration improves axonal regeneration into Schwann cells grafts in transected adult rat thoracic spinal cord.Exp Neurol,1996;138:261
, 百拇医药
3 Guest JD,Rao A,Olson L,et al.The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord.Exp Neurol,1997;148:502
4 Li Y,Raisman G.Integration of transplanted cultured Schwann cells into the long myelinated fiber tracts of the adult spinal cord.Exp Neurol,1997;145:397
5 Montgomery CT,Tenaglia EA,Robson JA.Axonal growth into tubes implanted within lesions in the spinal cords of adult rat.Exo Neurol,1996;137:277
, 百拇医药
6 Tarlov IM.Spinal cord compression studies.Ⅲ-Time limits for recovery after gradual compression on dogs.Arch Neurol Psychiatry,1954；71:588
7 王福庄，刘连生.大鼠脊髓诱发电位与脊髓损伤的关系.生理学杂志，1985；1：222
8 Sarnowski RJ,Crocco RQ,Vogel HB,et al.Spinal evoked response in the cat:Comparison of skin,lamina,and dural recordings.J Neurosurg,1975;43:329
9 Fehlings MG,Tator CH,Dean Linder R,et al.Motor and somatosensory potentials recorded from the rat.electroenceph Clin Neuroanat,1988;69:65
10 Xu XM.Roles of Schwann cells in the repair and regeneration of the central nervous system.Chin J Neuroanat,1996;12:16
收稿日期：1999-07-17, http://www.100md.com
单位：赵寅涛(南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科(南京 210008))；李立新 戴建础(南京医科大学第一附属医院神经外科(南京 210029))
关键词：雪旺细胞；纤连蛋白；脊髓诱发电位；功能
中国现代医学杂志000202 目的：观察雪旺细胞和纤连蛋白对大鼠损伤的脊髓功能的影响。方法：将体外培养的雪旺细胞结合纤连蛋白植入大鼠半切损伤的脊髓内，用脊髓诱发电位及图像分析方法比较治疗组和对照组诱发电位潜伏期，再生轴突计数及二者间的关系。结果：雪旺细胞结合纤连蛋白治疗组脊髓诱发电位潜伏期显著缩短，再生轴突明显增多，二者呈负相关。结论：雪旺细胞结合纤连蛋白移植具有促进脊髓损伤后轴突再生的作用，并能部分恢复脊髓的传入功能。
分类号 R-332
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THE EFFECTS OF SCHWANN CELLS AND FIBRONECTIN ON THE FUNCTION RECOVERY OF SCATHING SPINAL CORD IN RATS
Zhao Yintao, Li Lixing, Dai Jianchu
Department of Neurosurgery, Affiliated Gulou Hospital of Nanjing,Medical College of Nanjing University, Nanjing, Jiangsu 210008
Objective：To investigate whether Schwann Cells (SCs) and fibronectin (FN) could promote the function recovery of scathing spinal cords in adult rats. Methods:After cultured SCs combined with FN were grafted into hemi-resected lumbar spinal cords of adult rats, we used surface recording of spinal cord evoked potential (SCEP) and image analysis system to compare the latent period of SCEP and count the axon number between the therapeutic group and the control group. Results:In the group treated with SCs and FN, the latency of P1 wave was significantly shorten and the number of regrowed axons significant increased, with a significant negative correlation. Conclusions:Schwann cells together with fibronectin grafted to hemi-resected lumbar spinal cords in adult rats can promote partial conductive function repair of scathing spinal cords.
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Key Words:Schwann Cell;Fibronectin;Spinal Cord Evoked Potential
二十世纪八十年代中期，Kromer等[1]将雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)植入中枢神经损伤区，发现SCs能诱导、促进损伤轴突再生。进入90年代以来，国外利用培养的SCs移植治疗脊髓损伤的研究日益增多[2～4]。这些研究多侧重于形态学，而对脊髓损伤后功能的报道甚少。因此，本文就培养的SCs及其分泌的细胞外基质分子之一纤连蛋白(Fibronectin,FN)，是否在体内具有促进损伤脊髓功能恢复的作用，作初步探讨。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
无菌取SD乳鼠坐骨神经，剥除神经外膜和束膜，机械加酶消化法分散细胞，应用差速粘附加阿糖胞苷(10-5M,Sigma,Co.)，纯化雪旺细胞[5]。最后用FN(20μl/ml)加入基础培养液刺激细胞分裂增殖。培养的细胞用PAP法行抗S-100蛋白免疫组化染色，阳性细胞>95%。移植前以0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA将细胞分离、浓缩，制成1×107个细胞/ml密度的悬液备用。活细胞计数>95%。
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1.2 方法
1.2.1 实验分组 30只雌性SD大鼠，体重185～210g。随机取10只测定脊髓诱发电位(SCEP) P1潜伏期。测试完，将30只大鼠重新随机分成三组，每组10只，SCs/FN移植组、FN移植组和对照组，供基础培养液移植。
1.2.2 脊髓诱发电位正常值测定 取首次随机抽取的10只动物，2%戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔麻醉，分离左测坐骨神经至胫腓神经分叉处。将刺激电极置分叉处上方，外测0.5cm置一参考电极；记录电极插入T11-T12椎间皮下0.3cm，参考电极置其外测0.5cm处皮下。测试仪器为维京IV型诱发电位仪(Nicolet,Co)，波宽0.2ms，频率0.5Hz正方波脉冲，记录信号迭加20次。
1.2.3 脊髓半切模型制作及悬液移植 全部30只大鼠同前法行腹腔麻醉，取后正中切口，切除T13、L1椎板，显露脊髓。在显微镜下，作脊髓左半横切，向内达中央管，并切除0.2cm左半脊髓，压迫止血后，用Hamilton微量注射器按上述分组将10μl下述液体：SCs/FN，FN(20μl/ml)，基础培养液，分别注入脊髓残端实质内。
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1.2.4 术后处理 术后3d肌注庆大霉素(3mg/kg，2次/d)。每日挤压排尿，单笼喂养。每周行1次左后肢Tarlov[6]运动功能计分，共6周。
1.2.5 术后SCEP检测 术后6周，因血尿、感染、左后肢溃疡，11只大鼠死亡未获检查。存活19只，其中SCs/FN组8只，FN组6只，对照组5只，于术后6周行皮肤电极SECP P1潜伏期测定。
1.2.6 再生轴突计数 移植后6周，取移植损伤区脊髓1cm长节段，4%多聚甲醛固定，石蜡切片，Bielshowsdy's银染色，显微镜-微机图像处理系统(Kontron,IBAS 2.5全图像分析仪，德国)计数移植损伤区内的再生轴突。由于在对照组的脊髓移植损伤区内，没有观察到再生轴突，所以，我们仅对SCs/FN组6例和FN组中5例的脊髓移植损伤区的再生轴突计数，并取其平均值行统计学处理。
1.2.7 结果处理 应用t检验，H检验，方差分析两两比较及相关性分析处理数据。
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2 结果
2.1 临床功能评价
存活19只大鼠术后左后肢瘫。每周1次左后肢的Tarlov运动计分，每个点示均值，经H检验显示3组在统计学上无显著性差异(P>0.05)。
2.2 P1潜伏期测定
电刺激坐骨神经在皮肤表面获得的SCEP较小，一般为2～20μv,迭加20次，可显示其波形及分布。研究表明，在体记录时神经组织以外因素对诱发电位影响较大，而反应潜伏期不受影响[7]。故本实验以P1潜伏期作为了解脊髓传导功能的指标，其结果较可靠。各组P1潜伏期比较见附表。
附表 四组P1潜伏期比较(
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
P1潜伏期
正常组
10
1.07±0.18
SCs/FN组
8
1.57±0.25
FN组
6
1.84±0.29
对照组
5
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2.33±0.33
由附表看出，无论治疗组或对照组P1潜伏期均较正常组明显延长(P<0.01)。统计分析表明SCs/FN组P1潜伏期较另两组明显缩短，而FN组与对照组间无显著差别。
2.3 再生轴突计数
对SCs/FN组6例、FN组5例再生轴突计数结果分别为(346.63±153.61)和(110.38±18.54),t=3.37,P<0.01。结果显示SCs/FN移植有显著促进轴突再生的作用。
2.4 轴突计数与P1潜伏期相关性分析
结果表明：再生轴突数量与P1潜伏期呈明显负相关。说明当再生轴突数量显著增多时，可导致P1潜伏期的缩短。SCs/FN组再生轴突明显多与FN组，其潜伏期较后者明显缩短，提示移植含雪旺细胞的悬液后脊髓传导功能有部分恢复。
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3 讨论
本实验以培养的SCs结合FN移植，治疗大鼠实验性脊髓损伤，脊髓诱发电位检查显示SCs/FN移植具有显著缩短脊髓损伤后SCEP P1潜伏期的作用，而单纯FN移植，对P1潜伏期无明显影响。说明在SCs/FN移植组中，主要是SCs起作用。一般认为，P1为脊髓背根纤维在脊髓中直接延续的动作电位，主要经脊髓同侧后索、部分经侧索传导[8，9]。由于组成大鼠坐骨神经的脊神经多数在L1-S2椎体水平进入脊髓，故记录电极在L3椎体平面以上记录到的SCEP为传导性的SCEP[7]。本实验中脊髓损伤位与T13-L1椎体水平，刺激同侧坐骨神经，在T11-T12椎体间记录SCEP，三组均记录到较正常延长的P1潜伏期，证实上述论断。本实验首次将表面电极记录SCEP技术应用与细胞移植治疗脊髓损伤的功能测定，具有创伤小，结果较可靠的优点。它对于观察脊髓长传导束的功能、预测感觉功能恢复程度具有帮助。
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从再生轴突计数的统计分析上看,P1潜伏期的缩短与轴突数量较多具有相关性,表明SCs/FN移植具有显著促进脊髓损伤后轴突再生的作用。其机制可能有以下几点:SCs可分泌多种神经营养因子,形成适合再生的微环境;产生细胞外基质、细胞粘附分子、神经类固醇等,诱导、支持轴突再生;同时,FN具有促进移植的SCs存活、分裂增殖及迁移的作用[10]。
参考文献
1 Kromer LF,Cornbrooks CJ.Transplants of Schwann cell cultures promote axonal regeneration in the adult mammalian brain.Proc Natl Acad Sci USA,1985;82:6330
2 Chen A,Xu XM,Kleitman N,et al.Methylprednisolone administration improves axonal regeneration into Schwann cells grafts in transected adult rat thoracic spinal cord.Exp Neurol,1996;138:261
, 百拇医药
3 Guest JD,Rao A,Olson L,et al.The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord.Exp Neurol,1997;148:502
4 Li Y,Raisman G.Integration of transplanted cultured Schwann cells into the long myelinated fiber tracts of the adult spinal cord.Exp Neurol,1997;145:397
5 Montgomery CT,Tenaglia EA,Robson JA.Axonal growth into tubes implanted within lesions in the spinal cords of adult rat.Exo Neurol,1996;137:277
, 百拇医药
6 Tarlov IM.Spinal cord compression studies.Ⅲ-Time limits for recovery after gradual compression on dogs.Arch Neurol Psychiatry,1954；71:588
7 王福庄，刘连生.大鼠脊髓诱发电位与脊髓损伤的关系.生理学杂志，1985；1：222
8 Sarnowski RJ,Crocco RQ,Vogel HB,et al.Spinal evoked response in the cat:Comparison of skin,lamina,and dural recordings.J Neurosurg,1975;43:329
9 Fehlings MG,Tator CH,Dean Linder R,et al.Motor and somatosensory potentials recorded from the rat.electroenceph Clin Neuroanat,1988;69:65
10 Xu XM.Roles of Schwann cells in the repair and regeneration of the central nervous system.Chin J Neuroanat,1996;12:16
收稿日期：1999-07-17, http://www.100md.com