铅对大鼠肠道神经元和血管平滑肌细胞NOS活性的影响
作者：孔杏云 廖丽民 雷德亮 黄菊芳 文晓丹
单位：孔杏云(卫生学教研室 长沙 410078)；廖丽民(卫生学教研室 长沙 410078)；雷德亮(神经生物学研究室 长沙 410078)；黄菊芳(神经生物学研究室 长沙 410078)；文晓丹(神经生物学研究室 长沙 41 0078)
关键词：铅；中毒；一氧化氮合酶*；肠；小；大鼠
湖南医科大学学报000213[摘要] 用β-NADPH组织化学方法研究铅对大鼠肠壁肌间 神经丛内神经元和血管平滑肌一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结果发现：腹腔注射醋酸铅(40mg.kg-1)15d后，大鼠肠道NOS阳性神经元和阳性纤维数量减少，且阳性神经 元的形态也有不同程度的改变，肠壁内血管平滑肌NOS活性下降。上述变化提示NO的生成减 少可能是铅中毒时腹绞痛的机制之一。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R595.2 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0135-03
Influence of lead on activity of nitric oxide synthase in neurons and vessel smooth muscle of small intestine in rats
KONG Xing-yun, LIAO Li-min
(Department of Hygiene)
LEI De-liang, HUANG Ju-fang, WEN Xiao-dan
(Department of Neurobiology, Hunan Med ical University Changsha 410078)
, http://www.100md.com
[Abstract] The β-NADPH histochemical method was used to stud y the effect of lead on activity of nitric oxide synthase(NOS) in neurons and ve ssel smooth muscles of intestinal wall in rats. The results showed that the numb er of NOS positive neurons and fibers was decreased and degenerative changes of some NOS positive neurons were found after the lead acetate intraperitoneal inje ction. The activity of NOS in the vessel smooth muscles was reduced. It suggests that lead colic may be induced by reduction of NO in the neurons which innervat e the gut smooth muscles.
, http://www.100md.com
[Key words] lead; poisoning; nitric oxide synthase*; int estine,small; rats
消化道、泌尿生殖道和血管壁等处的平滑肌主要接受以一 氧化氮(nitric oxide, NO)为递质的神经支配。这部分非肾上腺能，非胆硷能的植物性神 经称为氮能神经，其效应能使相应部位的平滑肌松驰。支配胃肠道的氮能神经递质NO来源于胃肠道粘膜下及肌间神经丛的含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的神经元。临床上铅中毒时出现腹绞痛，视网膜小动脉痉挛。此等症状，主要是铅作用于肠道和血管平滑肌所致，是否与铅抑制了肠道NOS神经元活性导致NO生成减少有关其毒作用机制仍不清楚。作者用β-NADPH组织化学方法，观察铅对大鼠肠壁肌间神经丛神经元和血管平滑肌细胞NOS活性影响，试图从一个侧面探讨铅对肠道和血管平滑肌的毒作用与NO的关系，为研究铅所致的腹绞痛和小动脉痉挛的毒作用机制开辟新的思路。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 湖南医科大学动物室提供成年健康雌性Wistar大鼠18只(体重18 0～200g)。
1.2 方法
1.2.1 实验动物染毒 将大鼠随机分为实验组(n=12)、实验对照组(n=4) 和正常组(n=2)。实验组动物按40mg.kg-1(体重)的剂量经腹腔注射醋酸铅溶 液，每天一次，分别染毒15d(n=6)和30d(n=6)；实验对照组每天腹腔注射等量 双蒸水；正常组动物不作任何处理。
1.2.2 组织化学标本制备 动物经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg.kg -1)麻醉，开胸经左心室插管至升主动脉，剪开右心房，先灌注生理盐水约100ml，随后 灌注含4%多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)约300ml，持续30min灌毕。剪开腹壁，取 小肠约3～5cm。纵向剪开肠管，用手术刀片将粘膜层和肌层分离，置于上述固定液中后固 定1h。
, 百拇医药
1.2.3 β-NADPH染色 将上述经后固定的组织用0.1M Tris.HCl(pH8.0) 漂洗5min，2次，参照文献[1]作β-NADPH组化染色，显示NOS阳性神经元。常规贴片，脱水，透明，封片，Olympus显微镜观察、摄像。
2 结 果
正常组和实验对照组大鼠肠壁肌间神经丛内可见NOS阳性神经元和神经纤维(图1，4)，肌间 神经丛内阳性神经元呈团簇状分布，每个细胞簇由10～20个阳性细胞组成。NOS阳性神经元 多为圆形，胞浆为蓝色，胞核不着色(图2，4)。NOS阳性神经纤维在肌间神经丛内交织成网 格状(图1，3)。血管壁平滑肌内NOS阳性产物隐约可见(图1)。正常组和实验对照组之间NOS 阳性神经元及阳性纤维的形态、数量和分布基本一致。
实验组醋酸铅腹腔注射15d后，见肌间神经丛NOS阳性神经元细胞团簇中的细胞数较正常组 和实验对照组减少，NOS染色变浅，部分神经元形态不规则，边缘不整齐，出现退行性改变 ；偶见NOS阳性纤维残存截段；30d后上述改变进一步加重。血管平滑肌亦未见NOS阳性产 物(图5，6)。
, 百拇医药
图1～6 大鼠小肠肌层铺片
β-NADPH组织化学染色显 示对照组NOS阳性神经元(↑)和血管壁NOS阳性产物(▲)(图1，3 ×20；图2，4 ×40)；实验 组(图5 ×20;图6 ×40) NOS阳性神经元染色变淡，突起染色(↑)，部分神经元体积变小， 形态不规则(▲)
Fig.1～6 Whole-mounted sections of muscular la yer of small intestine of the rats
Stained with β-NADPH histochemical method, NOS positive neurons(↑) and NOS po sitive product on vessels (▲) in control group(Fig1,3 ×20; Fig 2,4 ×40); NOS positive neurons with light staining, the processes were not be stained(↑) and the shape of some neurons was irregular in the experimental groups(▲)(Fig.5 ×2 0; Fig.6 ×40).
, 百拇医药
3 讨 论
NO广泛分布于生物体内的各个部位，包括中枢神经和周围神经系统及血管内皮系统各种组织 。NO具有传递信息、松弛血管平滑肌等生理机能。内源性NO是从L-精氨酸经一氧化氮合酶( NOS)催化而成。在神经组织和血管内皮细胞中有神经元性NOS(nNOS)和内皮性NOS(eNOS)的分 布。
本实验结果显示，铅对肠壁NOS阳性神经元的影响包括：酶活性下降，NOS阳性神经元的数量 减少，部分NOS阳性神经元退行性变，NOS阳性纤维也有不同程度的损伤，并随着染毒时间的 延长而加剧。因肠道NOS阳性神经元催化左旋精氨酸生成的NO作为支配肠道平滑肌的氮能神 经递质可使肠道平滑肌松弛，肠壁NOS阳性神经元酶活性被抑制，使NO生成减少。这说明铅 可使NOS阳性神经元酶活性受到抑制和损伤。
铅中毒的临床表现可见面色苍白，眼底动脉痉挛，暂时性的血压升高。本实验观察到对照组 大鼠肠壁血管平滑肌有NOS阳性产物，而实验组则未见有NOS阳性产物。这说明，铅除了抑制肠道NOS阳性神经元的酶活性外，同时对血管平滑肌NOS的酶活性也有抑制作用，导致NO生成减少。这可能是铅引起血管痉挛的重要机制之一。
, 百拇医药
综合本实验结果和国外学者的报道，铅引起NO下降的机制，可能包括以下几个方面：①Blaz ka等报道[2]NOS是铅的靶分子之一，可抑制血管内皮细胞NO的合成，使脑血管内 皮细胞NOS(eNOS)催化生成的NO减少50%。②铅可抑制卟啉代谢过程中的血红素合成酶，使血 红蛋白和四氢生物嘌呤的合成障碍。后二者均是NOS分子结构的重要组成成分[3,4]。③不少学者的研究表明，铅可与钙竞争钙通道及钙调蛋白(CaM)。由于铅与CaM 的亲和力更强，使钙不能与CaM结合。依赖于钙/钙调蛋白(Ca/CaM)的NOS活性受到抑制而导 致NO生成减少[5,6]。
本实验观察的铅对大鼠肠道神经元和血管平滑肌NOS阳性细胞的影响结果，从一个方面为研 究铅绞 痛和血管痉挛的作用机制及其防治提供了新的思路和启示。但NOS活性变化与铅负荷及引起 铅绞痛的剂量-反应关系，还有待进一步研究。
参考文献：
, 百拇医药
[1] Lei DL, Yang DL, Liu HM. Local injection kainic acid cau ses widespread degeneration of NADPH-d neurons and induction of NADPH-d in neu rons, endothelial cells and reactive astrocytes[J]. Brain Res, 1996,730:199-20 6.
[2] Blazka ME, Harry GJ, Luster MI. Effect of lead acetate on nitrite produc tion by murine brain endothelial cell cultures[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 199 4,126:191-194.
[3] Purdy SE, Blair JA, Leeming RJ, et al. Effect of lead on tetrahydro- biopterin synthesis and salvage: A cause of neurological dysfunction[J]. Int J Environ Studies, 1981,17:141-145.
[4] 韩济生主编.神经科学原理[M].北京：北京医科大学出版社，第二版，1999：556 -557.
[5] Clarkson TW. Molecular and ionic mimicry of toxic metals[J]. Annu Rev P harmacol Toxicol, 1993,32:545-571.
[6] Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthase in mammals[J]. Biochem J, 1994,298:258-294., 百拇医药
单位：孔杏云(卫生学教研室 长沙 410078)；廖丽民(卫生学教研室 长沙 410078)；雷德亮(神经生物学研究室 长沙 410078)；黄菊芳(神经生物学研究室 长沙 410078)；文晓丹(神经生物学研究室 长沙 41 0078)
关键词：铅；中毒；一氧化氮合酶*；肠；小；大鼠
湖南医科大学学报000213[摘要] 用β-NADPH组织化学方法研究铅对大鼠肠壁肌间 神经丛内神经元和血管平滑肌一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结果发现：腹腔注射醋酸铅(40mg.kg-1)15d后，大鼠肠道NOS阳性神经元和阳性纤维数量减少，且阳性神经 元的形态也有不同程度的改变，肠壁内血管平滑肌NOS活性下降。上述变化提示NO的生成减 少可能是铅中毒时腹绞痛的机制之一。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R595.2 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0135-03
Influence of lead on activity of nitric oxide synthase in neurons and vessel smooth muscle of small intestine in rats
KONG Xing-yun, LIAO Li-min
(Department of Hygiene)
LEI De-liang, HUANG Ju-fang, WEN Xiao-dan
(Department of Neurobiology, Hunan Med ical University Changsha 410078)
, http://www.100md.com
[Abstract] The β-NADPH histochemical method was used to stud y the effect of lead on activity of nitric oxide synthase(NOS) in neurons and ve ssel smooth muscles of intestinal wall in rats. The results showed that the numb er of NOS positive neurons and fibers was decreased and degenerative changes of some NOS positive neurons were found after the lead acetate intraperitoneal inje ction. The activity of NOS in the vessel smooth muscles was reduced. It suggests that lead colic may be induced by reduction of NO in the neurons which innervat e the gut smooth muscles.
, http://www.100md.com
[Key words] lead; poisoning; nitric oxide synthase*; int estine,small; rats
消化道、泌尿生殖道和血管壁等处的平滑肌主要接受以一 氧化氮(nitric oxide, NO)为递质的神经支配。这部分非肾上腺能，非胆硷能的植物性神 经称为氮能神经，其效应能使相应部位的平滑肌松驰。支配胃肠道的氮能神经递质NO来源于胃肠道粘膜下及肌间神经丛的含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的神经元。临床上铅中毒时出现腹绞痛，视网膜小动脉痉挛。此等症状，主要是铅作用于肠道和血管平滑肌所致，是否与铅抑制了肠道NOS神经元活性导致NO生成减少有关其毒作用机制仍不清楚。作者用β-NADPH组织化学方法，观察铅对大鼠肠壁肌间神经丛神经元和血管平滑肌细胞NOS活性影响，试图从一个侧面探讨铅对肠道和血管平滑肌的毒作用与NO的关系，为研究铅所致的腹绞痛和小动脉痉挛的毒作用机制开辟新的思路。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 湖南医科大学动物室提供成年健康雌性Wistar大鼠18只(体重18 0～200g)。
1.2 方法
1.2.1 实验动物染毒 将大鼠随机分为实验组(n=12)、实验对照组(n=4) 和正常组(n=2)。实验组动物按40mg.kg-1(体重)的剂量经腹腔注射醋酸铅溶 液，每天一次，分别染毒15d(n=6)和30d(n=6)；实验对照组每天腹腔注射等量 双蒸水；正常组动物不作任何处理。
1.2.2 组织化学标本制备 动物经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg.kg -1)麻醉，开胸经左心室插管至升主动脉，剪开右心房，先灌注生理盐水约100ml，随后 灌注含4%多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)约300ml，持续30min灌毕。剪开腹壁，取 小肠约3～5cm。纵向剪开肠管，用手术刀片将粘膜层和肌层分离，置于上述固定液中后固 定1h。
, 百拇医药
1.2.3 β-NADPH染色 将上述经后固定的组织用0.1M Tris.HCl(pH8.0) 漂洗5min，2次，参照文献[1]作β-NADPH组化染色，显示NOS阳性神经元。常规贴片，脱水，透明，封片，Olympus显微镜观察、摄像。
2 结 果
正常组和实验对照组大鼠肠壁肌间神经丛内可见NOS阳性神经元和神经纤维(图1，4)，肌间 神经丛内阳性神经元呈团簇状分布，每个细胞簇由10～20个阳性细胞组成。NOS阳性神经元 多为圆形，胞浆为蓝色，胞核不着色(图2，4)。NOS阳性神经纤维在肌间神经丛内交织成网 格状(图1，3)。血管壁平滑肌内NOS阳性产物隐约可见(图1)。正常组和实验对照组之间NOS 阳性神经元及阳性纤维的形态、数量和分布基本一致。
实验组醋酸铅腹腔注射15d后，见肌间神经丛NOS阳性神经元细胞团簇中的细胞数较正常组 和实验对照组减少，NOS染色变浅，部分神经元形态不规则，边缘不整齐，出现退行性改变 ；偶见NOS阳性纤维残存截段；30d后上述改变进一步加重。血管平滑肌亦未见NOS阳性产 物(图5，6)。
, 百拇医药
图1～6 大鼠小肠肌层铺片
β-NADPH组织化学染色显 示对照组NOS阳性神经元(↑)和血管壁NOS阳性产物(▲)(图1，3 ×20；图2，4 ×40)；实验 组(图5 ×20;图6 ×40) NOS阳性神经元染色变淡，突起染色(↑)，部分神经元体积变小， 形态不规则(▲)
Fig.1～6 Whole-mounted sections of muscular la yer of small intestine of the rats
Stained with β-NADPH histochemical method, NOS positive neurons(↑) and NOS po sitive product on vessels (▲) in control group(Fig1,3 ×20; Fig 2,4 ×40); NOS positive neurons with light staining, the processes were not be stained(↑) and the shape of some neurons was irregular in the experimental groups(▲)(Fig.5 ×2 0; Fig.6 ×40).
, 百拇医药
3 讨 论
NO广泛分布于生物体内的各个部位，包括中枢神经和周围神经系统及血管内皮系统各种组织 。NO具有传递信息、松弛血管平滑肌等生理机能。内源性NO是从L-精氨酸经一氧化氮合酶( NOS)催化而成。在神经组织和血管内皮细胞中有神经元性NOS(nNOS)和内皮性NOS(eNOS)的分 布。
本实验结果显示，铅对肠壁NOS阳性神经元的影响包括：酶活性下降，NOS阳性神经元的数量 减少，部分NOS阳性神经元退行性变，NOS阳性纤维也有不同程度的损伤，并随着染毒时间的 延长而加剧。因肠道NOS阳性神经元催化左旋精氨酸生成的NO作为支配肠道平滑肌的氮能神 经递质可使肠道平滑肌松弛，肠壁NOS阳性神经元酶活性被抑制，使NO生成减少。这说明铅 可使NOS阳性神经元酶活性受到抑制和损伤。
铅中毒的临床表现可见面色苍白，眼底动脉痉挛，暂时性的血压升高。本实验观察到对照组 大鼠肠壁血管平滑肌有NOS阳性产物，而实验组则未见有NOS阳性产物。这说明，铅除了抑制肠道NOS阳性神经元的酶活性外，同时对血管平滑肌NOS的酶活性也有抑制作用，导致NO生成减少。这可能是铅引起血管痉挛的重要机制之一。
, 百拇医药
综合本实验结果和国外学者的报道，铅引起NO下降的机制，可能包括以下几个方面：①Blaz ka等报道[2]NOS是铅的靶分子之一，可抑制血管内皮细胞NO的合成，使脑血管内 皮细胞NOS(eNOS)催化生成的NO减少50%。②铅可抑制卟啉代谢过程中的血红素合成酶，使血 红蛋白和四氢生物嘌呤的合成障碍。后二者均是NOS分子结构的重要组成成分[3,4]。③不少学者的研究表明，铅可与钙竞争钙通道及钙调蛋白(CaM)。由于铅与CaM 的亲和力更强，使钙不能与CaM结合。依赖于钙/钙调蛋白(Ca/CaM)的NOS活性受到抑制而导 致NO生成减少[5,6]。
本实验观察的铅对大鼠肠道神经元和血管平滑肌NOS阳性细胞的影响结果，从一个方面为研 究铅绞 痛和血管痉挛的作用机制及其防治提供了新的思路和启示。但NOS活性变化与铅负荷及引起 铅绞痛的剂量-反应关系，还有待进一步研究。
参考文献：
, 百拇医药
[1] Lei DL, Yang DL, Liu HM. Local injection kainic acid cau ses widespread degeneration of NADPH-d neurons and induction of NADPH-d in neu rons, endothelial cells and reactive astrocytes[J]. Brain Res, 1996,730:199-20 6.
[2] Blazka ME, Harry GJ, Luster MI. Effect of lead acetate on nitrite produc tion by murine brain endothelial cell cultures[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 199 4,126:191-194.
[3] Purdy SE, Blair JA, Leeming RJ, et al. Effect of lead on tetrahydro- biopterin synthesis and salvage: A cause of neurological dysfunction[J]. Int J Environ Studies, 1981,17:141-145.
[4] 韩济生主编.神经科学原理[M].北京：北京医科大学出版社，第二版，1999：556 -557.
[5] Clarkson TW. Molecular and ionic mimicry of toxic metals[J]. Annu Rev P harmacol Toxicol, 1993,32:545-571.
[6] Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthase in mammals[J]. Biochem J, 1994,298:258-294., 百拇医药