实验性脑损伤后脑组织内腺苷、肌苷含量的变化及其意义
作者：童武松 卢亦成 江基尧 朱诚 徐尔理
单位：卢亦成(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；江基尧(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；朱诚(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；童武松(解放军第411医院神经外科，上海 200081)；徐尔理(解放军第411医院神经内科)
关键词：脑损伤；色谱法；高效液相；腺苷；肌苷
第二军医大学学报000204 摘 要：目的: 研究大鼠急性脑损伤后腺苷含量变化及其生化代谢。方法：采用大鼠液压脑损伤模型，用高效液相色谱法测定大鼠脑损伤前后脑皮质内腺苷和肌苷含量。结果：大鼠脑损伤后10 min，伤侧大脑皮质内腺苷含量即明显升高(P<0.01，与对照组比较)，伤后30 min升至最高值，伤后2 h腺苷含量恢复正常水平。肌苷含量变化与腺苷基本相同。结论：腺苷参与继发性脑损伤后的病理生理过程。
, 百拇医药
分类号：R 651.15 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0111-03
Contents changes of adenosine and inosine in cerebral cortex after experimental brain injury
LU Yi-Cheng
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
JIANG Ji-Yao
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Cheng
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
TONG Wu-Song
(Department of Neurosurgery，No. 411 Hospital of PLA, Shanghai 200081, China)
XU Er-Li
(Department of Neurology, No. 411 Hospital of PLA)
ABSTRACT：Objective: To investigate the changes of adenosine concentration in cerebral cortex after experimental brain injury and its biochemical metabolism. Methods: In rat fluid-percussion brain injury model, high performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure the concentration of adenosine and inosine in brain cortex before and after trauma. Results: A sharp increase of adenosine concentration occurred immediately after brain injury. Thirty minutes after trauma the adenosine concentration reached the highest peak (P<0.01), and returned to normal level 2 hours later. Inosine changed in the same way with the time of returning to normal level delayed slightly. Conclusion: Adenosine participates in the pathophysiology process after second brain injury.
, http://www.100md.com
KEY WORDS：brain injuries; chromatography, high performance liquid; adenosine; inosine▲
腺苷是中枢神经系统内一种重要的内源性保护因子，具有多种生物学活性，可抑制多种兴奋性神经递质释放及神经元的激活，并能扩张血管、抑制血小板凝聚、减轻中性粒细胞介导的血管内膜损伤[1，2]。本研究在液压脑损伤模型基础上，应用高效液相法检测了大鼠急性脑损伤后不同时程伤区脑组织内腺苷、肌苷含量的动态变化，并探讨其生化代谢及意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与致伤 36只雄性SD大鼠体质量(250±10) g，购自上海西普尔-必凯动物有限公司，随机分为对照组和实验组。实验组分别于伤后10，30 min，1，2，4 h断头处死(n=6)。打击强度为(152.0±20.3) kPa，致大鼠中度脑损伤。
, 百拇医药
1.2 伤区脑组织提取液的制备 大鼠按时间组分别断头处死，立即取伤区脑皮质约100～150 mg，用滤纸吸干血水后称量，按1∶3(质量∶体积)加入冷3 mol/L HClO4液，在冰浴中匀浆后，0～4℃ 15 000×g离心15 min，收取上清液按1∶1体积比加入冷2 mol/L KOH中和，再次低温离心，取上清液置于-20℃冰箱中保存，待测。
1.3 脑组织提取液腺苷、肌苷测定 采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相：10 mmol/L NaH2PO4/甲醇(10∶1)；流速1 ml/min；紫外检测波长254 nm；灵敏度0.01 AUFS。进样体积20 μl。外标法峰面积定量。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示。采用t检验和直线相关分析进行数据处理。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 实验色谱图 腺苷、肌苷混合标准样及大鼠脑皮质样本中腺苷、肌苷的色谱图见图1。从图中可以看出，腺苷、肌苷能够得到分离，生物样本中腺苷、肌苷测定无明显杂质干扰。
2.2 脑损伤后大脑皮质内腺苷、肌苷含量的改变 大鼠脑损伤后10 min与对照组比较，腺苷即明显升高(P<0.01)；伤后30 min，升至最高值；伤后2 h，腺苷含量恢复正常水平。肌苷含量的变化规律与腺苷基本相同，只是恢复正常水平的时间为伤后4 h，略滞后于腺苷，见表1。
图1 腺苷和肌苷HPLC分离图
Fig 1 Chromatograms of adenosine and inosine
, 百拇医药
A: Standard compounds; B: Extraction of rat cerebral cortex
表1 大鼠脑损伤后伤侧大脑皮质内腺苷、肌苷含量的改变
Tab 1 Changes of concentrations of adenosine and inosine in corebral certex after brain injury
[n=6,±s, mB/(μmol.g-1)] Group
Control
Time after acute brain injury (t/min)
, 百拇医药
10
30
60
120
240
Adenosine
0.112±0.010
0.583±0.061**
0.713±0.073**
0.203±0.032**
0.134±0.039
, 百拇医药
0.114±0.023
Inosine
0.075±0.017
0.315±0.040**
0.422±0.063**
0.163±0.030**
0.107±0.023*
0.070±0.020
*P<0.05, **P<0.01 vs control group3 讨 论
, 百拇医药
腺苷的形成主要有3种途径[3]：(1)ATP脱磷酸作用形成AMP，AMP经5′-核苷酸酶作用形成腺苷。5′-核苷酸酶位于易受缺血和创伤损害的脑组织内，在细胞能量衰竭期间引起腺苷含量升高，没有高能磷酸盐来源，腺苷通过腺苷脱氨酶代谢为肌苷。(2)脑内腺苷另一种来源可能是环单磷酸腺苷(cAMP)。已有实验证实，在离体的大鼠肾脏，给予外源性cAMP可经细胞外磷酸二酯酶和核苷酸酶作用转化成腺苷，因为这种产生的腺苷与细胞能量异常无关，所以腺苷能自由转化为高能磷酸盐，而没有形成肌苷。(3)腺苷亦能通过S-腺苷同型半胱氨酸水解作用形成。许多研究提示创伤性脑损伤后早期腺苷来源可能是ATP降解。当细胞ATP贮存未受损害时，新合成的腺苷通过腺苷激酶转化成高能中间产物，但当细胞缺乏ATP时，腺苷通过腺苷脱氨酶作用代谢为肌苷，肌苷进一步代谢为次黄嘌呤。本实验发现液压脑损伤后脑皮质组织内肌苷含量显著增加，提示细胞ATP贮存已减少，腺苷可能通过高磷酸盐降解形成(如ATP)。
内源性腺苷具有多种生物学活性，其作用是通过激活神经元细胞膜上腺苷受体来实现的。腺苷激活突触前膜腺苷A1受体影响Ca2+的内流，从而在突触前抑制Ca2+依赖的兴奋性神经递质的释放，如兴奋性氨基酸、乙酰胆碱等[1]。腺苷作用于突触后膜腺苷A1受体则影响K+通道，抑制K+外流和Na+内流，使神经元细胞膜超极化，降低突触后神经元兴奋性[1]。腺苷通过腺苷A1受体还能诱导低温，减少脑代谢速率[4]。腺苷A2受体激活的效应主要是使血管平滑肌松弛、扩张脑血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成[2]。本实验发现，大鼠脑损伤后，腺苷含量立即升高，30 min升至最高峰，于伤后2 h左右降为正常水平。另外，临床研究还发现颅脑伤患者脑脊液中腺苷含量显著升高，且与患者的伤情和预后有关[5]，表明创伤性脑损伤后内源性腺苷出现短暂的升高，可能是应激反应，是神经系统自我保护的表现。
, 百拇医药
由于缺血性及创伤性脑损伤后早期细胞能量代谢紊乱，ATP减少，腺苷的合成受到限制，且脑内存在高效的腺苷失活机制，影响了腺苷的神经保护作用。通过不同途径增加内源性腺苷含量可能对脑损伤具有保护作用[1]。一种途径是阻断或减少神经元突触对腺苷的摄取。已有一些学者采用外源性腺苷类似物治疗动物脑缺血、缺氧及创伤性损伤，发现腺苷受体激动剂环己基腺苷、2-氯腺苷、苯基异丙基腺苷等能明显减轻脑损伤神经元损害[6]。相反，用腺苷受体拮抗剂咖啡因和DPCPX治疗脑缺血动物，发现能加重缺血性脑病理损害[7]。研究表明，腺苷对CNS损伤起着明显的保护作用。
作者简介：童武松(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
参考文献：
[1]Sweeney MI. Neuroprotective effects of adenosine in cerebral ischemia. Window of opportunity[J].Neurosci Biobehav Rev,1997,21(2):207-217.
, 百拇医药
[2]Micacl G. Adenosine receptor subtypes[J].TIPS, 1993,14(10):360-364.
[3]Bell MJ, Kochanek PM,Carcillo JA. Interstitial adenosine, inosine,and hypoxanthine are increased after experimental traumatic brain injury in rat[J].J Neurotrauma, 1998, 15(3):163-169.
[4]Miller LP, Hsu C.Therapeutic potential for adenosine receptor activation in ischemic brain injury[J].J Neurotrauma, 1992,9(Suppl 2): 563-566.
, 百拇医药
[5]Clark RS, Carcillo JA, Kochanek PM，et al. Increased cerebrospinal fluid adenosine concentration in associated with uncoupling of cerebral blood flow and oxidative metabolism after severe injury in humans[J].Neurosurgery,1997,41(2): 1284-1293.
[6]Headrick JP, Vink R. Adenosine agonist improve bioenergetic and neurologic outcome following traumatic brain injury in rats[J].J Neurotrauma, 1993,10(2): S179-186.
[7]Phillis JW. The effects of selective A1 and A2 adenosine receptor antagonists on cerebral ischemic injury in the gerbil[J].Brain Res, 1995, 705(S1-2): 79-84.
收稿日期：1999-10-11
修稿日期：1999-12-30, http://www.100md.com
单位：卢亦成(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；江基尧(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；朱诚(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；童武松(解放军第411医院神经外科，上海 200081)；徐尔理(解放军第411医院神经内科)
关键词：脑损伤；色谱法；高效液相；腺苷；肌苷
第二军医大学学报000204 摘 要：目的: 研究大鼠急性脑损伤后腺苷含量变化及其生化代谢。方法：采用大鼠液压脑损伤模型，用高效液相色谱法测定大鼠脑损伤前后脑皮质内腺苷和肌苷含量。结果：大鼠脑损伤后10 min，伤侧大脑皮质内腺苷含量即明显升高(P<0.01，与对照组比较)，伤后30 min升至最高值，伤后2 h腺苷含量恢复正常水平。肌苷含量变化与腺苷基本相同。结论：腺苷参与继发性脑损伤后的病理生理过程。
, 百拇医药
分类号：R 651.15 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0111-03
Contents changes of adenosine and inosine in cerebral cortex after experimental brain injury
LU Yi-Cheng
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
JIANG Ji-Yao
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Cheng
(Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
TONG Wu-Song
(Department of Neurosurgery，No. 411 Hospital of PLA, Shanghai 200081, China)
XU Er-Li
(Department of Neurology, No. 411 Hospital of PLA)
ABSTRACT：Objective: To investigate the changes of adenosine concentration in cerebral cortex after experimental brain injury and its biochemical metabolism. Methods: In rat fluid-percussion brain injury model, high performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure the concentration of adenosine and inosine in brain cortex before and after trauma. Results: A sharp increase of adenosine concentration occurred immediately after brain injury. Thirty minutes after trauma the adenosine concentration reached the highest peak (P<0.01), and returned to normal level 2 hours later. Inosine changed in the same way with the time of returning to normal level delayed slightly. Conclusion: Adenosine participates in the pathophysiology process after second brain injury.
, http://www.100md.com
KEY WORDS：brain injuries; chromatography, high performance liquid; adenosine; inosine▲
腺苷是中枢神经系统内一种重要的内源性保护因子，具有多种生物学活性，可抑制多种兴奋性神经递质释放及神经元的激活，并能扩张血管、抑制血小板凝聚、减轻中性粒细胞介导的血管内膜损伤[1，2]。本研究在液压脑损伤模型基础上，应用高效液相法检测了大鼠急性脑损伤后不同时程伤区脑组织内腺苷、肌苷含量的动态变化，并探讨其生化代谢及意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与致伤 36只雄性SD大鼠体质量(250±10) g，购自上海西普尔-必凯动物有限公司，随机分为对照组和实验组。实验组分别于伤后10，30 min，1，2，4 h断头处死(n=6)。打击强度为(152.0±20.3) kPa，致大鼠中度脑损伤。
, 百拇医药
1.2 伤区脑组织提取液的制备 大鼠按时间组分别断头处死，立即取伤区脑皮质约100～150 mg，用滤纸吸干血水后称量，按1∶3(质量∶体积)加入冷3 mol/L HClO4液，在冰浴中匀浆后，0～4℃ 15 000×g离心15 min，收取上清液按1∶1体积比加入冷2 mol/L KOH中和，再次低温离心，取上清液置于-20℃冰箱中保存，待测。
1.3 脑组织提取液腺苷、肌苷测定 采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相：10 mmol/L NaH2PO4/甲醇(10∶1)；流速1 ml/min；紫外检测波长254 nm；灵敏度0.01 AUFS。进样体积20 μl。外标法峰面积定量。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示。采用t检验和直线相关分析进行数据处理。, 百拇医药
2 结 果
2.1 实验色谱图 腺苷、肌苷混合标准样及大鼠脑皮质样本中腺苷、肌苷的色谱图见图1。从图中可以看出，腺苷、肌苷能够得到分离，生物样本中腺苷、肌苷测定无明显杂质干扰。
2.2 脑损伤后大脑皮质内腺苷、肌苷含量的改变 大鼠脑损伤后10 min与对照组比较，腺苷即明显升高(P<0.01)；伤后30 min，升至最高值；伤后2 h，腺苷含量恢复正常水平。肌苷含量的变化规律与腺苷基本相同，只是恢复正常水平的时间为伤后4 h，略滞后于腺苷，见表1。
图1 腺苷和肌苷HPLC分离图
Fig 1 Chromatograms of adenosine and inosine
, 百拇医药
A: Standard compounds; B: Extraction of rat cerebral cortex
表1 大鼠脑损伤后伤侧大脑皮质内腺苷、肌苷含量的改变
Tab 1 Changes of concentrations of adenosine and inosine in corebral certex after brain injury
[n=6,
±s, mB/(μmol.g-1)] GroupControl
Time after acute brain injury (t/min)
, 百拇医药
10
30
60
120
240
Adenosine
0.112±0.010
0.583±0.061**
0.713±0.073**
0.203±0.032**
0.134±0.039
, 百拇医药
0.114±0.023
Inosine
0.075±0.017
0.315±0.040**
0.422±0.063**
0.163±0.030**
0.107±0.023*
0.070±0.020
*P<0.05, **P<0.01 vs control group3 讨 论
, 百拇医药
腺苷的形成主要有3种途径[3]：(1)ATP脱磷酸作用形成AMP，AMP经5′-核苷酸酶作用形成腺苷。5′-核苷酸酶位于易受缺血和创伤损害的脑组织内，在细胞能量衰竭期间引起腺苷含量升高，没有高能磷酸盐来源，腺苷通过腺苷脱氨酶代谢为肌苷。(2)脑内腺苷另一种来源可能是环单磷酸腺苷(cAMP)。已有实验证实，在离体的大鼠肾脏，给予外源性cAMP可经细胞外磷酸二酯酶和核苷酸酶作用转化成腺苷，因为这种产生的腺苷与细胞能量异常无关，所以腺苷能自由转化为高能磷酸盐，而没有形成肌苷。(3)腺苷亦能通过S-腺苷同型半胱氨酸水解作用形成。许多研究提示创伤性脑损伤后早期腺苷来源可能是ATP降解。当细胞ATP贮存未受损害时，新合成的腺苷通过腺苷激酶转化成高能中间产物，但当细胞缺乏ATP时，腺苷通过腺苷脱氨酶作用代谢为肌苷，肌苷进一步代谢为次黄嘌呤。本实验发现液压脑损伤后脑皮质组织内肌苷含量显著增加，提示细胞ATP贮存已减少，腺苷可能通过高磷酸盐降解形成(如ATP)。
内源性腺苷具有多种生物学活性，其作用是通过激活神经元细胞膜上腺苷受体来实现的。腺苷激活突触前膜腺苷A1受体影响Ca2+的内流，从而在突触前抑制Ca2+依赖的兴奋性神经递质的释放，如兴奋性氨基酸、乙酰胆碱等[1]。腺苷作用于突触后膜腺苷A1受体则影响K+通道，抑制K+外流和Na+内流，使神经元细胞膜超极化，降低突触后神经元兴奋性[1]。腺苷通过腺苷A1受体还能诱导低温，减少脑代谢速率[4]。腺苷A2受体激活的效应主要是使血管平滑肌松弛、扩张脑血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成[2]。本实验发现，大鼠脑损伤后，腺苷含量立即升高，30 min升至最高峰，于伤后2 h左右降为正常水平。另外，临床研究还发现颅脑伤患者脑脊液中腺苷含量显著升高，且与患者的伤情和预后有关[5]，表明创伤性脑损伤后内源性腺苷出现短暂的升高，可能是应激反应，是神经系统自我保护的表现。
, 百拇医药
由于缺血性及创伤性脑损伤后早期细胞能量代谢紊乱，ATP减少，腺苷的合成受到限制，且脑内存在高效的腺苷失活机制，影响了腺苷的神经保护作用。通过不同途径增加内源性腺苷含量可能对脑损伤具有保护作用[1]。一种途径是阻断或减少神经元突触对腺苷的摄取。已有一些学者采用外源性腺苷类似物治疗动物脑缺血、缺氧及创伤性损伤，发现腺苷受体激动剂环己基腺苷、2-氯腺苷、苯基异丙基腺苷等能明显减轻脑损伤神经元损害[6]。相反，用腺苷受体拮抗剂咖啡因和DPCPX治疗脑缺血动物，发现能加重缺血性脑病理损害[7]。研究表明，腺苷对CNS损伤起着明显的保护作用。
作者简介：童武松(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
参考文献：
[1]Sweeney MI. Neuroprotective effects of adenosine in cerebral ischemia. Window of opportunity[J].Neurosci Biobehav Rev,1997,21(2):207-217.
, 百拇医药
[2]Micacl G. Adenosine receptor subtypes[J].TIPS, 1993,14(10):360-364.
[3]Bell MJ, Kochanek PM,Carcillo JA. Interstitial adenosine, inosine,and hypoxanthine are increased after experimental traumatic brain injury in rat[J].J Neurotrauma, 1998, 15(3):163-169.
[4]Miller LP, Hsu C.Therapeutic potential for adenosine receptor activation in ischemic brain injury[J].J Neurotrauma, 1992,9(Suppl 2): 563-566.
, 百拇医药
[5]Clark RS, Carcillo JA, Kochanek PM，et al. Increased cerebrospinal fluid adenosine concentration in associated with uncoupling of cerebral blood flow and oxidative metabolism after severe injury in humans[J].Neurosurgery,1997,41(2): 1284-1293.
[6]Headrick JP, Vink R. Adenosine agonist improve bioenergetic and neurologic outcome following traumatic brain injury in rats[J].J Neurotrauma, 1993,10(2): S179-186.
[7]Phillis JW. The effects of selective A1 and A2 adenosine receptor antagonists on cerebral ischemic injury in the gerbil[J].Brain Res, 1995, 705(S1-2): 79-84.
收稿日期：1999-10-11
修稿日期：1999-12-30, http://www.100md.com