中国姥鲨软骨源新生血管抑制因子(Sp8)的分离纯化及生物学活性陈建鹤

http://www.100md.com 《第二军医大学学报》 2000年第2期

     作者：焦炳华 缪为民 王路 王梁华 缪辉南

    单位：焦炳华(第二军医大学基础医学部卫 生毒理学教研室，上海 200433)；王梁华(第二军医大学基础医学部卫 生毒理学教研室，上海 200433)； 缪辉南(第二军医大学基础医学部卫 生毒理学教研室，上海 200433)；陈建鹤(解放军第422医院内二科，广东湛江 524005)；缪为民(第二军医大学基础医学部微生物学教研室)；王路(第二军医大学基础医学部微生物学教研室)

    关键词：鲨鱼软骨；抑制因子；新生血管；抗肿瘤活性

    摘 要摘 要：目的：从中国姥鲨软骨组织抽提蛋白质中筛选具有新生血管抑制活性和抗肿瘤活性的分子。方法：盐酸胍抽提姥鲨软骨蛋白,采用超滤和分子筛柱层析等方法分离纯化获得相对分子质量为8.3×10³的蛋白质(Sp8),以体外抑制血管内皮细胞增殖、体内抑制新生血管生长和抑制小鼠移植S180肉瘤生长作为筛选指标。结果：Sp8可在体外抑制血管内皮细胞增殖，40 μg/ml浓度时抑制率为20%；在体内具有抑制新生血管生长的作用，兔角膜模型抑制率为72.7%，鸡胚模型(CAM)抑制率为79%；并能明显抑制小鼠体内移植S180肉瘤的生长(P<0.001)。结论：Sp8介导了鲨鱼软骨中的抗肿瘤活性，其作用可能是通过抑制肿瘤诱生新生血管形成这一途径来实现的。

    分类号：R 282.740.5 文献标识码：A

    文章编号：0258-879X(2000)02-0107-04

    Isolation,purification and biological characterization of an angiogenesis inhibitor (Sp8) derived from

    sinica cetorhinos maximus cartilage

    JIAO Bing-Hua

    (Department of Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    WANG Liang-Hua

    (Department of Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    MIAO Hui-Nan

    (Department of Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    CHEN Jian-He

    (Department of Internal medicine No.2, No. 422 Hospital of PLA,Zhanjang 524005, Guangdong, China)

    MIAO Wei-Min

    (Department of Microbiology, Department of Basic medicine,Second Military Medical University)

    WANG Lu

    (Department of Microbiology, Department of Basic medicine,Second Military Medical University)

    ABSTRACT：Objective: To screen shark cartilage-derived active proteins which can inhibit angiogenesis and tumor growth. Methods: Shark cartilage-derived proteins were extracted by 1 mol/L guanidine hydrochloride. Highly purified Sp8 was obtained by ultrafiltration and Superdex 75 column chromatography. The activities of Sp8 were studied on its inhibition of vascular endothelial cell growth, angiogenesis both on rabbit cornea and chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay, and growth of transplanted S180 sarcoma in mice. Results: (1) Sp8 could inhibit the growth of vascular endothelial cells in vitro. At the concentration of 40 μg/ml, the inhibitory rate was 20%. (2) Sp8 showed strong inhibition of angiogenesis, the inhibitory rate reached 72.7% on rabbit cornea and 79% on CAM model, respectively. (3) Sp8 could efficiently reduce the mass of S180 sarcoma growing in mice, IC50 on this model was less than l00 μg/kg. Conclusion: Sp8 mediates at least part of the anti-tumor activity endowed by shark cartilage and may work through the inhibition of tumor-induced angiogenesis.

    KEY WORDS：shark cartilage; nhibitor factors,angiogenesis;anti-tumor activity▲

    新生血管的形成和生长与实体肿瘤的生长和转移关系密切^[1]。已有的研究结果表明，鲨鱼软骨组织中含有较强的新生血管抑制活性和抗肿瘤活性，但介导这些活性的物质基础仍无定论。本研究在抽提分离和纯化鲨鱼软骨源蛋白质的基础上，用内皮细胞增殖抑制、新生血管生长抑制和小鼠S180移植瘤生长抑制模型筛选活性蛋白质。

    1 材料和方法

    1.1 材料和仪器 鲨鱼软骨：取自渤海深海姥鲨(cetorhinos maxium)下颌软骨。SD大鼠、昆明种小鼠和新西兰家兔均由第二军医大学实验动物中心提供。大鼠肺源毛细血管内皮细胞(rat pulmonary capillary endothelial cells, RCE)、新生牛主动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells, BAE)由本室制备。 Superdex 75,Sephacryl S-200, Sephadex G-25为瑞典Pharmacia公司产品；盐酸胍为比利时Jassen公司产品；MES，Tricine为美国Amersco公司产品；低相对分子质量蛋白质标准，非放射性细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司；胶原酶Ⅱ型、Ⅳ型为美国Sigma公司产品；超滤器、超滤膜与 PVDF膜均为美国Millipore公司产品；冷冻离心机为美国Du Pond 公司产品；高级蛋白质纯化系统为美国Waters公司产品，型号650 E。

    1.2 方法

    1.2.1 Sp8的抽提和纯化 将2 000 g鲨鱼软骨经高速组织捣碎机捣碎,浸泡于10 L抽提缓冲液(1 mol/L盐酸胍，0.02 mol/L MES, pH 6.0)中，室温抽提120 h后将抽提混合物于4℃, 1.1×10⁴×g 离心，去除软骨碎片，经Millipore超滤器超滤，获得相对分子质量<3.0×10⁴的蛋白质组分,再经Superdex 75柱层析纯化，获得高纯度的Sp8。

    1.2.2 理化性质检测 纯化产物的Tricine-SDS-PAGE按照Schagger等^[2]建立的方法进行。

    1.2.3 活性分析 大鼠肺源毛细血管内皮细胞培养按Chen等^[3]方法进行。血管内皮细胞增殖抑制试验采用MTT法。家兔眼角膜新生血管形成抑制试验参照Langer等^[4]建立的方法进行：将马流产杆菌内毒素与实验样品(LPS 140 μg, Sp8 40 μg)同时包埋于ethylene-vinyl acetate (EVA)，制成缓释胶膜移植于家兔眼角膜板层之中，观察兔角膜内新生血管生长情况，10 d后记录结果，血管生长的面积(S)=C/12×3.1416×[r²-(r-l)²]，其中，C：钟点数，r：角膜的半径，l：长度；抑制率=[(S_对照-S_样品)/S_对照]×100%。鸡胚尿囊膜(chick embryo choriallantoic membrane, CAM)新生血管形成抑制试验参照Taylor等^[5]建立的方法进行：将实验样品包埋于EVA中制成缓释胶膜，置9 d龄鸡胚尿囊膜无血管区，3 d后解剖取出尿囊膜，固定后拍照记录分析结果。体内抑瘤实验按国家卫生部新药临床前研究规程进行，抑制率=[(对照组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/实验组肿瘤质量]×100%。

    2 结 果

    2.1 Sp8的纯化与鉴定 根据国内外的研究结果，特别是我们实验室早期的工作结果^[6]，鲨鱼软骨抗肿瘤活性主要存在于相对分子质量<3.0×10⁴的组分中，我们重点研究了较小分子质量组分的蛋白质构成特征和活性分布，结果发现1.5×10⁴蛋白质(Sp15)在该组分中为最主要的分子，Sp8次之。经Superdex 75柱层析(图1)，采用小体积收集洗脱液(组分D)，可以获得较高纯度的Sp8。为精确分析其相对分子质量，我们选用了适于分析相对分子质量较小蛋白质的Tricine-SDS-PAGE法，确定其相对分子质量为8.3×10³(图2)。

    图1 鲨鱼软骨蛋白质组分Superdex 75柱层析图

    Fig 1 Superdex 75 column chromatography of proteins

    derived from shark cartilage

    A,C,E: Unidentified fractions; B: Ysozyme-lide molecule

    (Sp15); D: Angiogenesis inhibitor (Sp8)

    S

    图2 鲨鱼软骨蛋白质组分的Tricine-SDS-PAGE电泳分析

    Fig 2 Tricine-SDS-PAGE of proteins

    derived from shark cartilage

    1: Protein marker; 2: Shark cartilage proteins extracted by Gu-HCl；

    3: Purified Sp8 from ultrafiltrated with 3.10×10⁴ kPa

    membrane Superdex 75 chromatography

    2.2 Sp8的生物学活性分析

    2.2.1 Sp8对血管内皮细胞增殖的抑制活性 实验发现，Sp8抑制血管内皮细胞增殖作用在10 μg/ml的浓度下显示出12%的抑制率，浓度升高到40 μg/ml时，抑制率也相应增高到20%(图3)。实验同时发现，Sp8的这种抑制活性是稳定和持久的，体外培养单层汇合的血管内皮细胞1∶2传代培养后，约需2～3 d才能生长至汇合状态。如果加入Sp8，即使其浓度低至5.0 μg/ml，1周后细胞仍不能生长至汇合状态;而换液去除Sp8后，细胞则恢复原来的生长速度。实验同时表明，Sp8对B16, L929细胞增殖均无明显抑制作用。

    图3 Sp8抗血管内皮细胞和肿瘤细胞的增殖活性

    Fig 3 Anti-proliferation effect of Sp8 to vascular

    endothelial and tumor cells

    ○: RCE (rat pulmonary capillary endothelial cells; ●: BAE

    (bovine aortic endothelial cells); △: L929 (mouse

    fibroblasts); ▲:B16(mouse melanoma cells)

    2.2.2 Sp8对新生血管的抑制活性 目前,公认的血管生长抑制模型有两种,即兔角膜诱生新生血管抑制模型和鸡胚尿囊膜血管生长抑制模型。我们同时在这两种模型上检测了 Sp8的相关活性。结果表明, Sp8对79%的鸡胚尿囊膜新生血管生长具有抑制作用，对兔角膜LPS诱生的新生血管生长的抑制率达到72.7%(表1)，表明Sp8可能是中国姥鲨软骨源新生血管抑制因子。

    2.2.3 Sp8的抗肿瘤活性 Sp8在体内可以抑制新生血管的生长，体外对血管内皮细胞的增殖也具有一定的抑制作用。恶性肿瘤的生长和转移有赖于在其周围形成新的血管以供应其快速生长所需的营养物质^[1]，我们比较了 Sp8的这种抑制新生血管生长的活性是否与抑制恶性肿瘤的生长有关。昆明种小鼠皮下接种2×10⁷ S180肉瘤细胞后，次日分别腹腔给予50，100，200 μg/kg 的Sp8连续7 d，腹腔注射PBS作为对照。结果表明Sp8具有强烈的抑制恶性肿瘤生长的作用，这种抑制作用表现为瘤体积明显缩小，几乎100%地控制了皮肤恶性溃疡的发生。这种作用在一定程度上可随剂量的增加而加强，即100 μg/kg组强于50 μg/kg组，但200 μg/kg组较100 μg/kg组的疗效无明显增强(表2)。

    表1 Sp8抑制LPS诱导的兔角膜新生血管生长

    Tab 1 Sp8 inhibits LPS-induced angiogenesis in rabbit cornea model

    (n=4)

    Sample^a

    Angiogenesis

    Inhibition rate (%)^d

    Length(l/mm)

    Clock No.^b

    Area(A/mm²)^c

    LPS

    5.0±0.3

    5.6

    46.90±4.32

    0

    Sp8+LPS

    1.2±0.2^***

    4.0^***

    12.82±3.13^***

    72.7<sup>***

    ***</sup>P<0.01 vs LPS; ^a: LPS 140 μg, Sp8 40 μg; ^b: Angiogenesis area in the whole cornea (the clock number is 12); ^c: Area(S)=C/12×3.1416×[r²-(r-l)²]；C： Clock number; r: Radius of cornea; l: Length; ^d: Inhibition rate=[(S_control-S_sample)/S_control]×100% 表2 Sp8抑制S180肉瘤在小鼠体内的生长

    Tab 2 Sp8 inhibits the growth of S180 sarcoma in mice

    (n=10)

    Sample

    Dosage [ρ_B/(mg^.kg^-1)]

    Tumor mass (m/g, ±s)

    Inhibition rate (%)^a

    P value

    Sp8

    0.050

    0.71±0.12

    21.1

    <0.05

    0.100

    0.41±0.11

    54.4

    <0.001

    0.200

    0.39±0.05

    56.7

    <0.001

    CTX

    3.0

    0.62±0.13

    31.1

    <0.01

    PBS

    0

    0.90±0.15

    0

    0

    ^a: Inhibition rate=[(tumor mass of control group-tumor mass of experiment group)/tumor mass of experimental group]×100% 3 讨 论

    新生血管的形成和生长是生命过程中的基本现象，它不仅参与了多种生理过程，也参与了多种病理过程。研究表明，恶性实体肿瘤的生长和转移有赖于在其周围形成丰富的血管网，控制新生血管生长，已经成为防治恶性肿瘤的新途径。

    软骨是成体动物少数无血管组织之一，软骨不仅在发育分化过程中无血管形成，成体后仍可抵御新生血管的侵入，推测软骨的这些特性与软骨组织中含有一种或一类能抑制新生血管生长的活性因子有关。Langer等^[7]用盐酸胍抽提鲨鱼软骨组织，得到的粗提物在兔角膜血管抑制模型上，对V2肉瘤诱生的新生血管生长的抑制率达 75%，从而有效地抑制了所移植的V2肉瘤的生长。Oikawa等^[8]也用盐酸胍抽提鲨鱼软骨组织，抽提物经超滤、丙酮沉淀等方法初步纯化后发现，抑制血管生长的活性物质主要存在于相对分子质量为1×10⁴～1×10⁵的组分中。目前，对于鲨鱼软骨组织中具有这种活性的蛋白质分子的理化性质及其精细的纯化缺乏深入研究。

    我们的研究发现，鲨鱼软骨存在一种相对分子质量约为8.3×10³的蛋白质(Sp8)，具有抑制体外培养的血管内皮细胞增殖和体内新生血管生长抑制活性。根据血管生成的基本过程,血管内皮细胞的增殖是新生血管形成的一个重要环节。我们的研究结果表明，对于新生血管的形成，抑制血管内皮细胞的增殖仅是其中的机制之一，我们正在研究Sp8是否具有抑制血管生成过程中另外环节的活性，如抑制金属蛋白酶降解基质蛋白，抑制血管内皮细胞的移行等。Sp8能显著地抑制小鼠体内所移植的S180肉瘤的生长，表现为瘤体积缩小，防止了90%的S180肉瘤对皮肤的侵犯而导致恶性皮肤溃疡的发生，但对荷S180腹水瘤小鼠的生存时间未发现有显著的延长作用。关于Sp8对其他恶性实体肿瘤(抗瘤谱)的研究正在进行之中。

    目前，国外学者研究牛软骨提取蛋白抑制新生血管生长时，分别报道了不同相对分子质量的抑制因子，但有关鲨鱼软骨源的抑制因子尚未见报道。我们发现和纯化的Sp8蛋白很可能就是中国姥鲨软骨中介导这种抑制新生血管生长活性的抑制因子。

    基金项目：国家摼盼鍞科技攻关计划医药生物关键技术重点项目(96-C02-01-12)

    作者简介：陈建鹤(1969～)，男(汉族)，硕士，主治医师

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    [8]Oikawa T, Ashino-Fuse H, Shimamura M, et al. A novel angiogenic inhibitor derived from Japanese shark cartilage (Ⅰ) extraction and estimation of inhibitory activities toward tumor and embryonic angiogenesis[J]. Cancer Lett, 1990, 51(3): 181-186.

    收稿日期：1999-07-19

    修稿日期：1999-11-10

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2000/02/01/14/420.htm