中华眼镜蛇蛇毒因子的简易提纯及鉴定
作者：李晓平 李朝龙 朱正光 丘玉昌 孙燕荣
单位：李晓平(第一军医大学1南方医院肝胆血管外科，广东 广州510515)；李朝龙(第一军医大学1南方医院肝胆血管外科，广东 广州510515)；朱正光(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)；丘玉昌(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)；孙燕荣(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)
关键词：中华眼镜蛇蛇毒；眼镜蛇蛇毒因子
第一军医大学学报000225 摘要: 目的 探索从中华眼镜蛇(Chinese cobra, Naja naja atra)蛇毒中一次性快速分离提纯具有抗补体活性及溶血活性的中华眼镜蛇蛇毒因子(Chinese cobra venom factor, CCVF)的方法。方法 用倒流法将粗毒经DEAE-sephadex A-50柱层析分离提纯，用SDS-PAGE进行纯度鉴定及相对分子质量测定，并鉴定其活性与毒性。结果 本法CCVF得率高于2%，电泳图谱呈单一区带，由3个亚基组成，相对分子质量为145 800，抗补体及溶血活性强，毒性低。结论 本法操作简单，时间短，纯度高，为一实用高效快速提纯方法。
, http://www.100md.com
中图分类号：R282.74 文献标识号：B
文章编号：1000-2588 (2000)-02-0144-03
A new method for quick extraction and purification
of Chinese cobra venom factor (CCVF)
LI Xiao-ping，LI Chao-long
(Department of Hepatobiliary Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
ZHU Zheng-guang，QIU Yu-chang，SUN Yan-rong
, 百拇医药
(Institute of Pharmaceutics, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To isolate and purify the Chinese cobra venom factor (CCVF) with strong anti-complementary activity from the Chinese cobra venom quickly. Methods CCVF was fractionated by ion-exchange chromatography with PEAE-Saphadex A-50 column. By polyacrylamide slab gel electrophoresis, CCVF was identified and the molecular weight was estimated. The complement inhibition activity and the toxicity were tested. Results The extraction rate of CCVF was more than 2%, which presented a homogenous strip on the electrophoresis. With strong anti-complementary activity and low toxicity, CCVF consists of 3 subunites with total molecular weight of 145 800. Conclusion It was an efficient and simple method of CCVF fractionation.
, http://www.100md.com
Key words: Chinese cobra venom; cobra venom factor
20世纪60年代后期国外学者分离纯化出具有抗补体活性的眼镜蛇蛇毒因子[1]。90年代起，眼镜蛇毒因子被大量应用于异种移植超急性排斥反应[2、3]、延迟反应[4、5]以及呼吸窘迫综合征[6]的治疗。既往中华眼镜蛇蛇毒因子分离提纯过程复杂、耗时长、得率低。为了探索快速分离提纯中华眼镜蛇蛇毒因子，本实验建立了一次分离纯化的改良方法，从中华眼镜蛇蛇毒中快速分离纯化中华眼镜蛇蛇毒因子并鉴定其性质，收到良好的效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
中华眼镜蛇蛇毒冻干粉，由广州医学院蛇毒研究所提供；DEAE-Sephadex A-50为瑞典Pharmacia公司产品；低相对分子质量标准蛋白，珠海东风生化试剂厂；HD-95-1核酸蛋白检测仪，上海康华生化仪器；LBS-160自动收集器，上海新波无线电厂；Du520分光光度计，美国Beckman公司；Mini-Protein II 凝胶电泳系统，美国Bio-Rad公司；Bio-Profil 图象分析系统，法国Vilber Lourmat公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1CCVF的分离纯化
1.2.1.1 装柱 采用DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱层析的方法，层析柱内径约4 cm ，柱高60 cm，交换剂床高45 cm，床体积约400 cm3，将DEAE均匀上柱，用800 ml 0.01 mol/L PB(pH7.4，下同)洗柱(20 ml/h)。
1.2.1.2 上样及低盐洗脱 将9 g中华眼镜蛇蛇毒冻干粉溶于约30 ml 0.01 mol/L PB缓冲液中，均匀上样，连上洗脱液，液体流向从上到下，用0.01 mol/L PB缓冲液[7](含0.05 mol/L NaCl)洗脱约700 ml，25 ml/h，流出液为黄色，测951吸光度值小于0.5 mV(灵敏度为1 A)，弃去。
1.2.1.3 倒流法梯度盐洗脱 用含0.05至0.4 mol/L NaCl的0.01 mol/L PB缓冲液[7]梯度盐连于层析柱上方，并缓慢将柱倒置，使液体流向改为从下至上，洗脱液仍连于HD-95-1核酸蛋白检测仪，测250 nm的光密度并不间断记录，灵敏度仍定于1 A。用自动收集管收集有吸收峰的洗脱液并标记，每管4 ml。洗脱过程中，共收集只有1个吸收峰的洗脱液30管，约120 ml m，用DU520分光光度计对收集液紫外280 nm吸光度进行检测，将峰内组分脱盐后冷冻抽干成粉末。
, http://www.100md.com
1.2.2 纯度鉴定 用凝胶浓度为7.5%的非还原性SDS-PAGE电泳测定。
1.2.3 CCVF相对分子质量的测定 用凝胶浓度为12.5%的还原性SDS-PAGE电泳测定。
1.2.4 抗补体活性试验 在5×108/ml的绵羊红细胞中加入等体积1:1 000(V/V)的抗绵羊血红细胞血清，轻轻混匀置于37℃浴箱孵育10 min，制备致敏绵羊红细胞[8]。
取非吸收峰与吸收峰内不同管液共20份各0.1 ml，加入1:20 (V/V)新鲜鼠血清0.4 ml， 混匀，置于37℃水浴孵育3 min，分别加入致敏绵羊红细胞0.1 ml，37℃水浴1 h，判断各管溶血情况。
1.2.5 动物补体测试 取Wistar大鼠6只，0.3 mg/kg?b.w. CCVF腹腔注射，分别测注射前后大鼠血清CH50及C3含量。
, http://www.100md.com
1.2.6 毒性试验 取体质量20 g左右的小白鼠10只，5只皮下多点注射CCVE，每点约20 mg，8 h后剥皮观察有否出血点，5只按以10 mg/kg?b.w.腹腔注射，观察有无死亡。
2 结果
2.1 柱层析结果
共收集经冷冻干燥后活性峰组分的粉末0.2 g，得率为
2.22%(图1)。
2.2 抗补体活性定性试验
吸收峰内各试验管均未见溶血，而非吸收峰各试验管均溶血显著，说明所收集吸收峰各管具有抗补体活性。
2.3动物补体测试
, 百拇医药 大鼠CH50及C3含量均值从注射前的96 U/ml和0.91 mg/ml均降低至注射后接近于0的水平，维持时间接近48 h。
2.4毒性试验
皮下注射组皮下未见出血点，腹腔注射组观察72 h，5只小鼠无一死亡。
2.5纯度鉴定
经聚丙烯酰胺凝胶电泳，呈单一区带(图2A)。
2.6相对分子质量的测定
加入还原剂经聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2B)后的CCVF在图谱上呈现3组带，说明CCVF由3类相对分子质量不同的亚基组成，其相对分子质量为145 800。
, 百拇医药
图1 CCVF DEAE-Sephadex A-50 层析图
Fig.1 Chromatography of CCVF using DEAE-Sephadex A-50
图2 SDS 聚丙烯酰胺电泳图谱
Fig.2 Polyacrylamide slab gel electrophoresis of CCVF
3 讨论
本实验采用倒流法过柱层析，大大缩短了实验时间，从用梯度盐洗脱至结束时间不超过24 h。传统的Sephadex-DEAE洗脱方法使交换柱越压越紧，随着盐浓度的提高，洗脱越来越慢。本实验先从上至下洗柱及低盐洗脱1500 ml，已使交换柱压实及使CCVF附于交换柱。梯度盐洗脱时将柱倒置，洗脱液及CCVF流经交换柱的方向不变，却使洗脱液流向与交换剂的重力方向相反，有利于CCVF的洗脱，显著缩短洗脱时间且对洗脱效果毫无影响。
, 百拇医药
本实验选择适当的盐梯度一次性完成分离纯化，所收集组分纯度高，经测定相对分子质量为145 800，由3类亚基组成，与国外学者[9～10]测得的相对分子质量接近。本方法明显减少分离步骤及次数,在不影响纯度前提下，大大提高了得率和速度。在实验过程中发现CCVF易沉淀，若多次分离，较易损耗。
眼镜蛇毒抗补体的机制是与B因子结合，在D因子作用下，将C3裂解为C3a和C3b从而消耗C3水平，达到将补体典途径和旁路途径同时抑制的作用[11]。本实验说明中华眼镜蛇毒因子具有很强的抗补体活力，能显著降低C3水平，其抑制补体活力不亚于国外提取的CVF且毒性低，为一较佳的低毒性补体抑制剂。以上说明本实验建立了从中华眼镜蛇毒中分离纯化中华眼镜蛇毒因子的快速实用高效简易的方法。
作者简介：李晓平 (1972-)，男，福建漳州人，1994年毕业于第一军医大学，现为第一军医大学在读博士，医师，电话：85147236
, 百拇医药
参考文献
1，Ballow M, Cochrane CG. Two anticomplementary factors in cobra venom: Herolysis of guinea pig erythrocytes by one of them[J]. J Immunol, 1969, 103(5):944～52.
2，Miyatake T. Analysis of cardiac function of discordant heart xenografts using a bloodperfused, isolated, supported heart model[J]. Hokkaido Igaku Zasshi, 1994, 69(1):35～45.
3，Azimzadeh A, Wolf P, Dalmass AP et al. Assessment of hyperacute rejection in rat-to-primate cardiac xenograft model[J]. Transplantation, 1996, 61(9):1305～13.
, http://www.100md.com
4，Candinas D, Belliveau S, Kogamada N et al. T cell independence of macrophage and natural killer cell in filrtration, cytokine production, and endothelial activation during delayed xenograft rejection[J]. Transplantation, 1996, 62(12): 1920～7.
5，Kobayashi T, Taniguchi S, Neethling FA et al. Delayed xenograft rejection of pig-to-baboon cardiac transplants after cobra venom factortherapy [J]. Transplantation, 1997, 64(9): 1255～61.
, 百拇医药 6，任先达, 黄守坚, 孙家钧等. 眼镜蛇毒因子对实验性家犬发呼吸窘迫综合征的保护作用[J]. 中国临床药理学与治疗学杂志, 1998, (3):5～8.
7，舒雨雁, 陈 川, 庄茂辛等. 中华眼镜蛇蛇毒因子的分离纯化及性质的研究[J]. 生物化学与生物物理学报, 1991, 23(1):32～9.
8，Peacock SE, Tomar RH. Manual of laboratory immunology[M]. Philadelphia: Lea & Fehiger, 1980. 210～1.
9，Takahashi H, Hayashi K. Purification and characterization of anticomplement factor (cobra venom factor) from the Naja naja atra venm[J]. Biochim Biophys Acta, 1982, 701(1):102～10.
, 百拇医药
10， Vogel CW, Muller-Eberhard HJ.Cobra venom factor: Improved method for purification and biochemical characterization[J]. J Immunol Methods, 1984, 73(1):203～20.
11，Vogel CW, Smith CA, Muller Eberhard HJ. Cobra venom factor: structural homology with the third component of human complement[J]. J Immunol, 1984, 133(6):3235～41.
收稿日期：2000-01-26, 百拇医药
单位：李晓平(第一军医大学1南方医院肝胆血管外科，广东 广州510515)；李朝龙(第一军医大学1南方医院肝胆血管外科，广东 广州510515)；朱正光(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)；丘玉昌(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)；孙燕荣(第一军医大学药物研究所，广东 广州510515)
关键词：中华眼镜蛇蛇毒；眼镜蛇蛇毒因子
第一军医大学学报000225 摘要: 目的 探索从中华眼镜蛇(Chinese cobra, Naja naja atra)蛇毒中一次性快速分离提纯具有抗补体活性及溶血活性的中华眼镜蛇蛇毒因子(Chinese cobra venom factor, CCVF)的方法。方法 用倒流法将粗毒经DEAE-sephadex A-50柱层析分离提纯，用SDS-PAGE进行纯度鉴定及相对分子质量测定，并鉴定其活性与毒性。结果 本法CCVF得率高于2%，电泳图谱呈单一区带，由3个亚基组成，相对分子质量为145 800，抗补体及溶血活性强，毒性低。结论 本法操作简单，时间短，纯度高，为一实用高效快速提纯方法。
, http://www.100md.com
中图分类号：R282.74 文献标识号：B
文章编号：1000-2588 (2000)-02-0144-03
A new method for quick extraction and purification
of Chinese cobra venom factor (CCVF)
LI Xiao-ping，LI Chao-long
(Department of Hepatobiliary Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
ZHU Zheng-guang，QIU Yu-chang，SUN Yan-rong
, 百拇医药
(Institute of Pharmaceutics, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To isolate and purify the Chinese cobra venom factor (CCVF) with strong anti-complementary activity from the Chinese cobra venom quickly. Methods CCVF was fractionated by ion-exchange chromatography with PEAE-Saphadex A-50 column. By polyacrylamide slab gel electrophoresis, CCVF was identified and the molecular weight was estimated. The complement inhibition activity and the toxicity were tested. Results The extraction rate of CCVF was more than 2%, which presented a homogenous strip on the electrophoresis. With strong anti-complementary activity and low toxicity, CCVF consists of 3 subunites with total molecular weight of 145 800. Conclusion It was an efficient and simple method of CCVF fractionation.
, http://www.100md.com
Key words: Chinese cobra venom; cobra venom factor
20世纪60年代后期国外学者分离纯化出具有抗补体活性的眼镜蛇蛇毒因子[1]。90年代起，眼镜蛇毒因子被大量应用于异种移植超急性排斥反应[2、3]、延迟反应[4、5]以及呼吸窘迫综合征[6]的治疗。既往中华眼镜蛇蛇毒因子分离提纯过程复杂、耗时长、得率低。为了探索快速分离提纯中华眼镜蛇蛇毒因子，本实验建立了一次分离纯化的改良方法，从中华眼镜蛇蛇毒中快速分离纯化中华眼镜蛇蛇毒因子并鉴定其性质，收到良好的效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
中华眼镜蛇蛇毒冻干粉，由广州医学院蛇毒研究所提供；DEAE-Sephadex A-50为瑞典Pharmacia公司产品；低相对分子质量标准蛋白，珠海东风生化试剂厂；HD-95-1核酸蛋白检测仪，上海康华生化仪器；LBS-160自动收集器，上海新波无线电厂；Du520分光光度计，美国Beckman公司；Mini-Protein II 凝胶电泳系统，美国Bio-Rad公司；Bio-Profil 图象分析系统，法国Vilber Lourmat公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1CCVF的分离纯化
1.2.1.1 装柱 采用DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱层析的方法，层析柱内径约4 cm ，柱高60 cm，交换剂床高45 cm，床体积约400 cm3，将DEAE均匀上柱，用800 ml 0.01 mol/L PB(pH7.4，下同)洗柱(20 ml/h)。
1.2.1.2 上样及低盐洗脱 将9 g中华眼镜蛇蛇毒冻干粉溶于约30 ml 0.01 mol/L PB缓冲液中，均匀上样，连上洗脱液，液体流向从上到下，用0.01 mol/L PB缓冲液[7](含0.05 mol/L NaCl)洗脱约700 ml，25 ml/h，流出液为黄色，测951吸光度值小于0.5 mV(灵敏度为1 A)，弃去。
1.2.1.3 倒流法梯度盐洗脱 用含0.05至0.4 mol/L NaCl的0.01 mol/L PB缓冲液[7]梯度盐连于层析柱上方，并缓慢将柱倒置，使液体流向改为从下至上，洗脱液仍连于HD-95-1核酸蛋白检测仪，测250 nm的光密度并不间断记录，灵敏度仍定于1 A。用自动收集管收集有吸收峰的洗脱液并标记，每管4 ml。洗脱过程中，共收集只有1个吸收峰的洗脱液30管，约120 ml m，用DU520分光光度计对收集液紫外280 nm吸光度进行检测，将峰内组分脱盐后冷冻抽干成粉末。
, http://www.100md.com
1.2.2 纯度鉴定 用凝胶浓度为7.5%的非还原性SDS-PAGE电泳测定。
1.2.3 CCVF相对分子质量的测定 用凝胶浓度为12.5%的还原性SDS-PAGE电泳测定。
1.2.4 抗补体活性试验 在5×108/ml的绵羊红细胞中加入等体积1:1 000(V/V)的抗绵羊血红细胞血清，轻轻混匀置于37℃浴箱孵育10 min，制备致敏绵羊红细胞[8]。
取非吸收峰与吸收峰内不同管液共20份各0.1 ml，加入1:20 (V/V)新鲜鼠血清0.4 ml， 混匀，置于37℃水浴孵育3 min，分别加入致敏绵羊红细胞0.1 ml，37℃水浴1 h，判断各管溶血情况。
1.2.5 动物补体测试 取Wistar大鼠6只，0.3 mg/kg?b.w. CCVF腹腔注射，分别测注射前后大鼠血清CH50及C3含量。
, http://www.100md.com
1.2.6 毒性试验 取体质量20 g左右的小白鼠10只，5只皮下多点注射CCVE，每点约20 mg，8 h后剥皮观察有否出血点，5只按以10 mg/kg?b.w.腹腔注射，观察有无死亡。
2 结果
2.1 柱层析结果
共收集经冷冻干燥后活性峰组分的粉末0.2 g，得率为
2.22%(图1)。
2.2 抗补体活性定性试验
吸收峰内各试验管均未见溶血，而非吸收峰各试验管均溶血显著，说明所收集吸收峰各管具有抗补体活性。
2.3动物补体测试
, 百拇医药 大鼠CH50及C3含量均值从注射前的96 U/ml和0.91 mg/ml均降低至注射后接近于0的水平，维持时间接近48 h。
2.4毒性试验
皮下注射组皮下未见出血点，腹腔注射组观察72 h，5只小鼠无一死亡。
2.5纯度鉴定
经聚丙烯酰胺凝胶电泳，呈单一区带(图2A)。
2.6相对分子质量的测定
加入还原剂经聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2B)后的CCVF在图谱上呈现3组带，说明CCVF由3类相对分子质量不同的亚基组成，其相对分子质量为145 800。
, 百拇医药
图1 CCVF DEAE-Sephadex A-50 层析图
Fig.1 Chromatography of CCVF using DEAE-Sephadex A-50
图2 SDS 聚丙烯酰胺电泳图谱
Fig.2 Polyacrylamide slab gel electrophoresis of CCVF
3 讨论
本实验采用倒流法过柱层析，大大缩短了实验时间，从用梯度盐洗脱至结束时间不超过24 h。传统的Sephadex-DEAE洗脱方法使交换柱越压越紧，随着盐浓度的提高，洗脱越来越慢。本实验先从上至下洗柱及低盐洗脱1500 ml，已使交换柱压实及使CCVF附于交换柱。梯度盐洗脱时将柱倒置，洗脱液及CCVF流经交换柱的方向不变，却使洗脱液流向与交换剂的重力方向相反，有利于CCVF的洗脱，显著缩短洗脱时间且对洗脱效果毫无影响。
, 百拇医药
本实验选择适当的盐梯度一次性完成分离纯化，所收集组分纯度高，经测定相对分子质量为145 800，由3类亚基组成，与国外学者[9～10]测得的相对分子质量接近。本方法明显减少分离步骤及次数,在不影响纯度前提下，大大提高了得率和速度。在实验过程中发现CCVF易沉淀，若多次分离，较易损耗。
眼镜蛇毒抗补体的机制是与B因子结合，在D因子作用下，将C3裂解为C3a和C3b从而消耗C3水平，达到将补体典途径和旁路途径同时抑制的作用[11]。本实验说明中华眼镜蛇毒因子具有很强的抗补体活力，能显著降低C3水平，其抑制补体活力不亚于国外提取的CVF且毒性低，为一较佳的低毒性补体抑制剂。以上说明本实验建立了从中华眼镜蛇毒中分离纯化中华眼镜蛇毒因子的快速实用高效简易的方法。
作者简介：李晓平 (1972-)，男，福建漳州人，1994年毕业于第一军医大学，现为第一军医大学在读博士，医师，电话：85147236
, 百拇医药
参考文献
1，Ballow M, Cochrane CG. Two anticomplementary factors in cobra venom: Herolysis of guinea pig erythrocytes by one of them[J]. J Immunol, 1969, 103(5):944～52.
2，Miyatake T. Analysis of cardiac function of discordant heart xenografts using a bloodperfused, isolated, supported heart model[J]. Hokkaido Igaku Zasshi, 1994, 69(1):35～45.
3，Azimzadeh A, Wolf P, Dalmass AP et al. Assessment of hyperacute rejection in rat-to-primate cardiac xenograft model[J]. Transplantation, 1996, 61(9):1305～13.
, http://www.100md.com
4，Candinas D, Belliveau S, Kogamada N et al. T cell independence of macrophage and natural killer cell in filrtration, cytokine production, and endothelial activation during delayed xenograft rejection[J]. Transplantation, 1996, 62(12): 1920～7.
5，Kobayashi T, Taniguchi S, Neethling FA et al. Delayed xenograft rejection of pig-to-baboon cardiac transplants after cobra venom factortherapy [J]. Transplantation, 1997, 64(9): 1255～61.
, 百拇医药 6，任先达, 黄守坚, 孙家钧等. 眼镜蛇毒因子对实验性家犬发呼吸窘迫综合征的保护作用[J]. 中国临床药理学与治疗学杂志, 1998, (3):5～8.
7，舒雨雁, 陈 川, 庄茂辛等. 中华眼镜蛇蛇毒因子的分离纯化及性质的研究[J]. 生物化学与生物物理学报, 1991, 23(1):32～9.
8，Peacock SE, Tomar RH. Manual of laboratory immunology[M]. Philadelphia: Lea & Fehiger, 1980. 210～1.
9，Takahashi H, Hayashi K. Purification and characterization of anticomplement factor (cobra venom factor) from the Naja naja atra venm[J]. Biochim Biophys Acta, 1982, 701(1):102～10.
, 百拇医药
10， Vogel CW, Muller-Eberhard HJ.Cobra venom factor: Improved method for purification and biochemical characterization[J]. J Immunol Methods, 1984, 73(1):203～20.
11，Vogel CW, Smith CA, Muller Eberhard HJ. Cobra venom factor: structural homology with the third component of human complement[J]. J Immunol, 1984, 133(6):3235～41.
收稿日期：2000-01-26, 百拇医药