人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选
作者：罗荣城 尤长宣 韩焕兴 胡栋平 王传斌 苏瑾
单位：罗荣城(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；尤长宣(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；韩焕兴(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；胡栋平(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；王传斌(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；苏瑾(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)
关键词：乙型肝炎表面抗原；干扰素；融合蛋白；Fab
第一军医大学学报000224 摘要: 目的 探讨如何在无药物抗性改变，无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白原核表达载体。方法 在IFN-α基因两端加上XbaⅠ酶切位点后用PCR法扩增，再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗HBsAg-Fab片段表达载体的相应位点上，构建anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。取PCR扩增得到的IFN-αDNA，用地高辛标记系统进行化学标记，制备IFN-αDNA探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌，增菌后，以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA，点样于硝酸纤维膜上，80℃烤2 h，预杂交液42℃，2 h膜预杂交，标记探针42℃，4 h杂交，洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗HBsAg-Fab片段表达载体为阴性对照，IFN-α质粒为阳性对照。阳性克隆再以SacⅠ和XbaⅠ酶切，琼脂糖电泳鉴定。结果 40株转化细胞中筛选出7个阳性克隆， 酶切鉴定显示两者符合率达100%，成功地筛选出了anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。结论 人源HBsAg抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体的成功构建和筛选，为表达该融合蛋白打下了基础。
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中图分类号：R512.6 文献标识码：A
文章编号：1000-2588 (2000) 02-0100-03
Selection of the expression vector for the fusion protein of human anti-HBs antibody Fab fragment and interferon-α
LUO Rong-cheng，YOU Chang-xuan，WANG Chuan-bin，SU Jin
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
HAN Huan-xing，HU Dong-ping
, 百拇医药
(Center of Clinical Immunology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
Abstract: Objective To select the expression vector for human anti-HBs antibody Fab fragment and interferon-α(IFN-α) fusion protein in E. Coli quickly and accurately. Methods The gene of IFN-αwas amplified with PCR before the attachment by the endonuclease-XbaⅠsites to both of its endings, and was then recombined into the corresponding site in the plasmid of Fab fragment of HBsAg antibody which was selected from combinatorial antibody libraries, to construct the fusion protein vector. The digoxin probe was prepared with IFN-αDNA labeled by digoxin marking system. xL1-blue was used to transform the constructed vector. The vector DNA was obtained by treating the vector with lysozyme and boiling after proliferation. The supernatant containing the vector DNA was spread over the nitrocellulose membrane in tiny drops and baked at 80℃ for 2 h, and then was pre-hybridized in pre-hybridization solution at 42℃ for 2 h and hybridized with the probe at 42℃ for 4 h. The anti-HBs Fab phagemid was set as positive control and IFN-αplasmid as negative control. Coloratoin was performed using enzyme-marked anti-digoxin antibody and corresponding substrate. The positive clones underwent endonuclease-SacⅠ, XbaⅠhydrolysis and agarose gel analysis for verification. Results Seven positive clones were selected from the 40 strains. The results of the verification exactly conformed to that of hybridization. Conclusion This method is relatively simple and reliable in construction and selecting of the expression vector for human anti-HBs Fab fragment and IFN-αfusion protein, and it paves way for the expression of this fusion protein in E. Coli.
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Key words: IFN-α; HbsAg; Fab; fusion protein
人源抗HBsAg Fab片段的制备成功代表了乙型肝炎病毒基因工程抗体技术的最新成就[1]，而IFN-α是目前治疗病毒性肝炎最有效的药物，且具有一定的抗肿瘤活性[2～3]。两者在分子水平上重组，构建人源抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体，可以表达该融合蛋白并将其用于慢性乙型病毒性肝炎、HBsAg阳性肝癌的导向治疗。该法具有如下几个优点：(1)传统的导向治疗载体一般采用鼠源性单抗，存在着异源性和大分子蛋白等问题。人源抗HBsAg抗体Fab片段不仅克服了异源性问题，而且穿透力强，具有较高的抗原亲和力和特异性。(2)构建融合蛋白表达载体，可以利用抗体的导向性将IFN-α输送到病变细胞局部，从而降低了IFN-α的应用剂量，减少毒副作用和减轻病人的经济负担。(3)导向治疗时通常是采用化学或物理的方法将细胞毒性药物交联于单抗上，而在分子水平重组构建的融合蛋白表达质粒，不仅可以避免理化交联法不稳定、难制备等缺点，还可以通过大肠杆菌进行表达，实现大量廉价生产。
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这种融合蛋白载体的构建需经过二次克隆过程，目前未见设有两个系统以便于两次插入筛选的载体，这类基因克隆载体的筛选完全是根据DNA分子大小，单纯依靠电泳纯化进行筛选，工作量大且在技术上有一定的难度。本实验采用地高辛标记IFN-αDNA制备IFN-α探针，以探针杂交筛选阳性克隆，而后以酶切进一步鉴定，准确而快速地筛选到了构建成功的HbsAg抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体，为表达该融合蛋白打下了基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、菌株 抗-HbsAg Fab片段表达载体，菌株xL1-blue均由第二军医大学全军临床免疫中心提供；IFN-α质粒由第二军医大学遗传研究所提供。
1.1.2 酶和试剂 工具酶均购自Promega公司；地高辛标记检测试剂盒为Buebringer产品。DNA杂交炉为Hoefer公司产品。
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1.2方法
1.2.1 PCR产物的设计和目的基因的扩增及融合蛋白载体的构建 根据引物设计原则及IFN-α质粒的DNA序列设计引物1和引物2，并且两端分别加上XbaⅠ酶切位点。以IFN-α质粒为模板，30轮扩增IFN-α目的基因。将纯化的人源抗-HBsAg Fab片段表达载体经XbaⅠ酶切并做去磷酸化处理，与XbaⅠ酶切的IFN-α目的基因按摩尔数之比为1∶1混合，T4 Ligase连接，0.8%的琼脂糖凝胶电泳回收未插入IFN-α的质粒。将转化的感受态细胞涂于含氨苄青霉素(Amp)、四环素(Tet)的平板，取单克隆接种于含Amp、Tet的LB培养液，37℃增菌至饱和。
1.2.2细菌转化并增菌制备载体DNA 采用MgCl2聚乙二醇一步法转化感受态xL1-Blue菌，铺于LB板增菌为单克隆，取40个克隆在5 ml SB中增菌至饱和，后取2 ml离心沉淀并用PBS洗两次，以300 μl STET(含溶菌酶200 μg酶)稀释、悬浮，冰浴5 min后置沸水中煮沸2 min，14 000 r/min离心15 min，上清即含载体DNA。
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1.2.3探针标记、DNA杂交筛选阳性克隆 参照试剂盒说明制备标记IFN-αDNA探针，取制备待筛选载体DNA 2μl，单纯抗HBsAg Fab片段表达载体为阴性对照，IFN-α质粒为阳性对照，点样于硝酸纤维膜上，室温干燥后置80℃烤箱2 h，42℃分别作预杂交2 h、杂交4 h，充分洗涤后用酶标抗地高辛抗体和相应底物显色。
1.2.4 融合蛋白载体的酶切鉴定 抽提、纯化阳性克隆的质粒，以XbaⅠ和载体上其他单一酶点SacⅠ酶切鉴定，同时设酶切单纯抗HBsAg Fab片段表达载体及DNA标准相对分子质量作对照。
2 结果
2.1 IFN-αDNA的制备及抗HBsAg抗体片段与IFN-α融合蛋白表达载体的构建
以IFN-α质粒为模板，通过PCR，我们扩增得到了预期大小的目的基因片段(图3)。PCR产物相对分子质量约为0.5 kb，与IFN-αDNA的理论值相符。上述制备的IFN-αDNA和XbaⅠ酶切过的人源HBsAg抗体Fab片段表达载体DNA在T4连接酶的作用下连接，构建抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白的表达载体(图1)。
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2.2 融合蛋白表达载体的DNA探针杂交筛选
在良好的阳性和阴性控制下，只有插入了IFN-α片段的阳性克隆才能与探针杂交，出现阳性免疫印迹结果(图2)。用IFN-α质粒直接点样的阳性对照出现明显的显色，Fab片段表达质粒点样的阴性对照不出现显色，1、8、16、22、25 共5个阳性克隆出现明显显色，其余未出现明显显色的克隆判定为阴性克隆。用此方法分两批共筛选出7个阳性克隆。
2.3 非插入点和插入点的酶切鉴定
为证实筛选结果的可靠性，对阳性克隆质粒DNA作非插入点和插入点的单酶切鉴定。应用限制性内切酶Sac-Ⅰ酶切阳性载体和单纯Fab载体，电泳显示相对分子质量的差别。应用XbaⅠ酶切鉴定插入点是否插入目的片段(图3)。连接成功的阳性克隆质粒DNA相对分子质量应为5.2 kb (Fab 4.7 kb+IFN-α0.5 kb)，位于相对分子质量为4.7 kb的Fab片段表达质粒之后。XbaⅠ酶切后，阳性克隆DNA形成单纯Fab载体和插入片段两条单一区带。
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图1 抗HBsAg Fab-IFN-融合蛋白表达载体构建示意图
Fig.1 The construction of the expression vector for the fusion protein of anti-HBs Fab fragment and IFN-a
图2 地高辛标记IFN-α DNA探针筛选阳性克隆(C为阳性对照)
Fig.2 The selection of positive clones with digoxin probe hybridization
图3 SacⅠ、XbaⅠ酶切鉴定阳性克隆
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Fig.3 1% agarose gel analysis of positive clone with endonuclease hydrolysis.M-λ: DNA/Hind Ⅲ marker(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564)；a: digestion of IFN-αDNA with XbaⅠ; b: digestion of Fab DNA with Sac-Ⅰ; c: digestion of fusion protein vector DNA with Sac-Ⅰ; d: digestion of fusion protein vector DNA with XbaⅠ
3 讨论
噬菌体抗体库技术不需杂交瘤途径，且能在原核细胞中表达出人源性抗体，它代表了基因工程抗体技术的最前沿，被誉为单克隆抗体制备技术上的革命性进展[4～6]。该技术也为抗体的体外修饰、改造和介导其它基因表达产物提供了极大的方便。近年来，已有许多在基因基础上进行抗体亲合力修饰，交联其他生物活性物质的报道，大大拓展了抗体的应用领域。
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本实验是在从已建人源抗体文库中筛选出了特异表达抗HBsAg Fab片段的阳性表达载体的基础上[7]，构建抗HBsAg Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体。为减少融合表达对抗体和干扰素活性造成的可能影响，干扰素基因连接在抗HBsAg Fab片段的羧基端并在中间以较长的多肽链相隔。Burioni等[8]曾以内切酶SpeⅠ和NheⅠ将IFN-α基因插入Fab片段重链末端，由此表达出人抗白喉杆菌外毒素和抗HSV抗体Fab酶标抗体。但在本实验中，我们发现内切酶SpeⅠ和NheⅠ不仅价格昂贵，而且活性不高，酶切不完全，故我们选用经济且酶切效果好的内切酶XbaⅠ，将IFN-α基因连接在Fab轻链的羧基端。但第2次克隆过程中，带有插入序列的载体与未带插入序列的载体间没有可供利用的筛选条件，因而筛选过程有一定的难度。
理论上，经酶切、纯化的载体和插入片段的连接应产生很高的阳性率，但由于实际操作中酶切的不完全、反向插入和重复插入、连接的效率以及电泳时实际迁移并非完全与相对分子质量成正比等因素，转化菌形成的目的株(即带有正确插入片段的菌株)很少，在未经其他筛选措施的克隆中尤其如此。本实验阳性克隆的筛选理论上可以根据DNA分子的大小，依靠电泳进行筛选。但由于构建的融合蛋白载体相对分子质量为5.2 kb，单纯Fab表达载体的相对分子质量为4.7 kb，而插入片段仅为0.5 kb左右，且两种载体由于结构有所不同，泳动与分子量的关系也不尽相同，因而单靠电泳分辨有相当的难度，且操作复杂烦琐，工作量大。
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应用特异的DNA序列标记探针进行原位杂交筛选是一种可靠的筛选方法。鉴于放射性标记在实际应用中的缺陷，非放射性标记技术受到普遍的重视，目前常用的地高辛标记法，生物素标记法和荧光素标记法都在广泛应用并获可靠结果。这种探针杂交法对载体制备要求低，一次筛选标本多，本实验杂交筛选的阳性率大于10%，对筛选出来的阳性克隆再用酶切电泳进行鉴定，两者完全相符，就证实了杂交筛选法简便、可靠，是值得推广的方法。
基金项目：国家自然科学基金(39670688)；广州重点科研项目基金(97-Z-65-02)
作者简介：罗荣城(1958-)，男，广东普宁人，1989年毕业于第一军医大学，硕士，教授，电话：85141651
参考文献
1，Zebedee SL, Barbas CF, Hom YL et al. Human combination antibody libraries to hepatitis B surface antigen[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:3175～9.
, 百拇医药
2，李永华, 谭 林, 孙成斋等. 乙肝导向干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J]. 中国实用内科杂志, 1997, 17(3):145～6.
3，刘康达, 汤创猷. 肝癌导向治疗的应用体会[J]. 中国实用外科杂志,1996, 16(10):581～2.
4，Adair JR. Engineering antibody for therapy[J]. Immunol Rev, 1992, 230:5～40.
5，Mats A, Person. Combinatorial libraries[J]. Intern Rev Immunol, 1993, 10:153.
6，Tanha J, Forsyth G, Schorr P et al. Sequence and structure specific antibody from phage display libraries[J]. Mol Immunol, 1997, 34:109～33.
7，韩焕兴, 范例英，胡栋平等. 人抗HBsAg单克隆抗体组合文库的建立[J].中国免疫学杂志, 1996, 12(1):40～2.
8，Burioni R, Plaisant P, Riccio ML et al. Engineering human monoclonal antibody fragments: a recombinant enzyme-linked Fab[J]. Microbiogica, 1995, 18(2):127～3.
收稿日期：1999-02-26, 百拇医药
单位：罗荣城(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；尤长宣(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；韩焕兴(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；胡栋平(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；王传斌(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)；苏瑾(第一军医大学南方医院肿瘤科, 广东 广州510515)
关键词：乙型肝炎表面抗原；干扰素；融合蛋白；Fab
第一军医大学学报000224 摘要: 目的 探讨如何在无药物抗性改变，无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白原核表达载体。方法 在IFN-α基因两端加上XbaⅠ酶切位点后用PCR法扩增，再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗HBsAg-Fab片段表达载体的相应位点上，构建anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。取PCR扩增得到的IFN-αDNA，用地高辛标记系统进行化学标记，制备IFN-αDNA探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌，增菌后，以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA，点样于硝酸纤维膜上，80℃烤2 h，预杂交液42℃，2 h膜预杂交，标记探针42℃，4 h杂交，洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗HBsAg-Fab片段表达载体为阴性对照，IFN-α质粒为阳性对照。阳性克隆再以SacⅠ和XbaⅠ酶切，琼脂糖电泳鉴定。结果 40株转化细胞中筛选出7个阳性克隆， 酶切鉴定显示两者符合率达100%，成功地筛选出了anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。结论 人源HBsAg抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体的成功构建和筛选，为表达该融合蛋白打下了基础。
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中图分类号：R512.6 文献标识码：A
文章编号：1000-2588 (2000) 02-0100-03
Selection of the expression vector for the fusion protein of human anti-HBs antibody Fab fragment and interferon-α
LUO Rong-cheng，YOU Chang-xuan，WANG Chuan-bin，SU Jin
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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(Center of Clinical Immunology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
Abstract: Objective To select the expression vector for human anti-HBs antibody Fab fragment and interferon-α(IFN-α) fusion protein in E. Coli quickly and accurately. Methods The gene of IFN-αwas amplified with PCR before the attachment by the endonuclease-XbaⅠsites to both of its endings, and was then recombined into the corresponding site in the plasmid of Fab fragment of HBsAg antibody which was selected from combinatorial antibody libraries, to construct the fusion protein vector. The digoxin probe was prepared with IFN-αDNA labeled by digoxin marking system. xL1-blue was used to transform the constructed vector. The vector DNA was obtained by treating the vector with lysozyme and boiling after proliferation. The supernatant containing the vector DNA was spread over the nitrocellulose membrane in tiny drops and baked at 80℃ for 2 h, and then was pre-hybridized in pre-hybridization solution at 42℃ for 2 h and hybridized with the probe at 42℃ for 4 h. The anti-HBs Fab phagemid was set as positive control and IFN-αplasmid as negative control. Coloratoin was performed using enzyme-marked anti-digoxin antibody and corresponding substrate. The positive clones underwent endonuclease-SacⅠ, XbaⅠhydrolysis and agarose gel analysis for verification. Results Seven positive clones were selected from the 40 strains. The results of the verification exactly conformed to that of hybridization. Conclusion This method is relatively simple and reliable in construction and selecting of the expression vector for human anti-HBs Fab fragment and IFN-αfusion protein, and it paves way for the expression of this fusion protein in E. Coli.
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Key words: IFN-α; HbsAg; Fab; fusion protein
人源抗HBsAg Fab片段的制备成功代表了乙型肝炎病毒基因工程抗体技术的最新成就[1]，而IFN-α是目前治疗病毒性肝炎最有效的药物，且具有一定的抗肿瘤活性[2～3]。两者在分子水平上重组，构建人源抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体，可以表达该融合蛋白并将其用于慢性乙型病毒性肝炎、HBsAg阳性肝癌的导向治疗。该法具有如下几个优点：(1)传统的导向治疗载体一般采用鼠源性单抗，存在着异源性和大分子蛋白等问题。人源抗HBsAg抗体Fab片段不仅克服了异源性问题，而且穿透力强，具有较高的抗原亲和力和特异性。(2)构建融合蛋白表达载体，可以利用抗体的导向性将IFN-α输送到病变细胞局部，从而降低了IFN-α的应用剂量，减少毒副作用和减轻病人的经济负担。(3)导向治疗时通常是采用化学或物理的方法将细胞毒性药物交联于单抗上，而在分子水平重组构建的融合蛋白表达质粒，不仅可以避免理化交联法不稳定、难制备等缺点，还可以通过大肠杆菌进行表达，实现大量廉价生产。
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这种融合蛋白载体的构建需经过二次克隆过程，目前未见设有两个系统以便于两次插入筛选的载体，这类基因克隆载体的筛选完全是根据DNA分子大小，单纯依靠电泳纯化进行筛选，工作量大且在技术上有一定的难度。本实验采用地高辛标记IFN-αDNA制备IFN-α探针，以探针杂交筛选阳性克隆，而后以酶切进一步鉴定，准确而快速地筛选到了构建成功的HbsAg抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载体，为表达该融合蛋白打下了基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒、菌株 抗-HbsAg Fab片段表达载体，菌株xL1-blue均由第二军医大学全军临床免疫中心提供；IFN-α质粒由第二军医大学遗传研究所提供。
1.1.2 酶和试剂 工具酶均购自Promega公司；地高辛标记检测试剂盒为Buebringer产品。DNA杂交炉为Hoefer公司产品。
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1.2方法
1.2.1 PCR产物的设计和目的基因的扩增及融合蛋白载体的构建 根据引物设计原则及IFN-α质粒的DNA序列设计引物1和引物2，并且两端分别加上XbaⅠ酶切位点。以IFN-α质粒为模板，30轮扩增IFN-α目的基因。将纯化的人源抗-HBsAg Fab片段表达载体经XbaⅠ酶切并做去磷酸化处理，与XbaⅠ酶切的IFN-α目的基因按摩尔数之比为1∶1混合，T4 Ligase连接，0.8%的琼脂糖凝胶电泳回收未插入IFN-α的质粒。将转化的感受态细胞涂于含氨苄青霉素(Amp)、四环素(Tet)的平板，取单克隆接种于含Amp、Tet的LB培养液，37℃增菌至饱和。
1.2.2细菌转化并增菌制备载体DNA 采用MgCl2聚乙二醇一步法转化感受态xL1-Blue菌，铺于LB板增菌为单克隆，取40个克隆在5 ml SB中增菌至饱和，后取2 ml离心沉淀并用PBS洗两次，以300 μl STET(含溶菌酶200 μg酶)稀释、悬浮，冰浴5 min后置沸水中煮沸2 min，14 000 r/min离心15 min，上清即含载体DNA。
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1.2.3探针标记、DNA杂交筛选阳性克隆 参照试剂盒说明制备标记IFN-αDNA探针，取制备待筛选载体DNA 2μl，单纯抗HBsAg Fab片段表达载体为阴性对照，IFN-α质粒为阳性对照，点样于硝酸纤维膜上，室温干燥后置80℃烤箱2 h，42℃分别作预杂交2 h、杂交4 h，充分洗涤后用酶标抗地高辛抗体和相应底物显色。
1.2.4 融合蛋白载体的酶切鉴定 抽提、纯化阳性克隆的质粒，以XbaⅠ和载体上其他单一酶点SacⅠ酶切鉴定，同时设酶切单纯抗HBsAg Fab片段表达载体及DNA标准相对分子质量作对照。
2 结果
2.1 IFN-αDNA的制备及抗HBsAg抗体片段与IFN-α融合蛋白表达载体的构建
以IFN-α质粒为模板，通过PCR，我们扩增得到了预期大小的目的基因片段(图3)。PCR产物相对分子质量约为0.5 kb，与IFN-αDNA的理论值相符。上述制备的IFN-αDNA和XbaⅠ酶切过的人源HBsAg抗体Fab片段表达载体DNA在T4连接酶的作用下连接，构建抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白的表达载体(图1)。
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2.2 融合蛋白表达载体的DNA探针杂交筛选
在良好的阳性和阴性控制下，只有插入了IFN-α片段的阳性克隆才能与探针杂交，出现阳性免疫印迹结果(图2)。用IFN-α质粒直接点样的阳性对照出现明显的显色，Fab片段表达质粒点样的阴性对照不出现显色，1、8、16、22、25 共5个阳性克隆出现明显显色，其余未出现明显显色的克隆判定为阴性克隆。用此方法分两批共筛选出7个阳性克隆。
2.3 非插入点和插入点的酶切鉴定
为证实筛选结果的可靠性，对阳性克隆质粒DNA作非插入点和插入点的单酶切鉴定。应用限制性内切酶Sac-Ⅰ酶切阳性载体和单纯Fab载体，电泳显示相对分子质量的差别。应用XbaⅠ酶切鉴定插入点是否插入目的片段(图3)。连接成功的阳性克隆质粒DNA相对分子质量应为5.2 kb (Fab 4.7 kb+IFN-α0.5 kb)，位于相对分子质量为4.7 kb的Fab片段表达质粒之后。XbaⅠ酶切后，阳性克隆DNA形成单纯Fab载体和插入片段两条单一区带。
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图1 抗HBsAg Fab-IFN-融合蛋白表达载体构建示意图
Fig.1 The construction of the expression vector for the fusion protein of anti-HBs Fab fragment and IFN-a
图2 地高辛标记IFN-α DNA探针筛选阳性克隆(C为阳性对照)
Fig.2 The selection of positive clones with digoxin probe hybridization
图3 SacⅠ、XbaⅠ酶切鉴定阳性克隆
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Fig.3 1% agarose gel analysis of positive clone with endonuclease hydrolysis.M-λ: DNA/Hind Ⅲ marker(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564)；a: digestion of IFN-αDNA with XbaⅠ; b: digestion of Fab DNA with Sac-Ⅰ; c: digestion of fusion protein vector DNA with Sac-Ⅰ; d: digestion of fusion protein vector DNA with XbaⅠ
3 讨论
噬菌体抗体库技术不需杂交瘤途径，且能在原核细胞中表达出人源性抗体，它代表了基因工程抗体技术的最前沿，被誉为单克隆抗体制备技术上的革命性进展[4～6]。该技术也为抗体的体外修饰、改造和介导其它基因表达产物提供了极大的方便。近年来，已有许多在基因基础上进行抗体亲合力修饰，交联其他生物活性物质的报道，大大拓展了抗体的应用领域。
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本实验是在从已建人源抗体文库中筛选出了特异表达抗HBsAg Fab片段的阳性表达载体的基础上[7]，构建抗HBsAg Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体。为减少融合表达对抗体和干扰素活性造成的可能影响，干扰素基因连接在抗HBsAg Fab片段的羧基端并在中间以较长的多肽链相隔。Burioni等[8]曾以内切酶SpeⅠ和NheⅠ将IFN-α基因插入Fab片段重链末端，由此表达出人抗白喉杆菌外毒素和抗HSV抗体Fab酶标抗体。但在本实验中，我们发现内切酶SpeⅠ和NheⅠ不仅价格昂贵，而且活性不高，酶切不完全，故我们选用经济且酶切效果好的内切酶XbaⅠ，将IFN-α基因连接在Fab轻链的羧基端。但第2次克隆过程中，带有插入序列的载体与未带插入序列的载体间没有可供利用的筛选条件，因而筛选过程有一定的难度。
理论上，经酶切、纯化的载体和插入片段的连接应产生很高的阳性率，但由于实际操作中酶切的不完全、反向插入和重复插入、连接的效率以及电泳时实际迁移并非完全与相对分子质量成正比等因素，转化菌形成的目的株(即带有正确插入片段的菌株)很少，在未经其他筛选措施的克隆中尤其如此。本实验阳性克隆的筛选理论上可以根据DNA分子的大小，依靠电泳进行筛选。但由于构建的融合蛋白载体相对分子质量为5.2 kb，单纯Fab表达载体的相对分子质量为4.7 kb，而插入片段仅为0.5 kb左右，且两种载体由于结构有所不同，泳动与分子量的关系也不尽相同，因而单靠电泳分辨有相当的难度，且操作复杂烦琐，工作量大。
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应用特异的DNA序列标记探针进行原位杂交筛选是一种可靠的筛选方法。鉴于放射性标记在实际应用中的缺陷，非放射性标记技术受到普遍的重视，目前常用的地高辛标记法，生物素标记法和荧光素标记法都在广泛应用并获可靠结果。这种探针杂交法对载体制备要求低，一次筛选标本多，本实验杂交筛选的阳性率大于10%，对筛选出来的阳性克隆再用酶切电泳进行鉴定，两者完全相符，就证实了杂交筛选法简便、可靠，是值得推广的方法。
基金项目：国家自然科学基金(39670688)；广州重点科研项目基金(97-Z-65-02)
作者简介：罗荣城(1958-)，男，广东普宁人，1989年毕业于第一军医大学，硕士，教授，电话：85141651
参考文献
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收稿日期：1999-02-26, 百拇医药