碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞粘附、增殖和分化的影响
作者：郑磊 王前 魏宽海 裴国献
单位：郑磊(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)；王前(第一军医大学南方医院 检验科，广东 广州 510515)；魏宽海(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)；裴国献(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；骨髓基质细胞；粘附；增殖；分化
第一军医大学学报000216 摘要： 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质细胞(BMSC)粘附、增殖和分化等生物学效应的影响。方法 利用体视学计数、四唑盐(MTT)比色法及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒分别测定不同浓度bFGF诱导一定时间后BMSC的粘附特性、增殖和分化情况的变化。结果10 ng/ml bFGF明显促进BMSC的粘附，但是200 ng/ml bFGF反而不利于细胞粘附；在细胞增殖和分化测定中，100 ng/ml bFGF明显促进细胞增殖，但细胞碱性磷酸酶含量也最低。结论 碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的，可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节，这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关。
, http://www.100md.com
中图分类号: R318.01 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-S0004-02
Biological effects of basic fibroblast growth factor on bone marrow stromal cells
ZHENG Lei，WEI Kuan-hai，Pei Guo-xian
(Department of Orthopedics and Traumatology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
WANG Qian
(Department of Clinical Laboratory, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To investigate the biological effects of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells(BMSC). Methods BMSCs were subjected to the treatment with different concentrations of bFGF, after which the attached cells were estimated with stereological method, cell proliferation measured with methylthiazol tetrazolium (MTT) method and cell differentiation with alkaline phosphatase (ALP) measurement kit. Results 10 ng/ml bFGF can promote cell adhension significantly, while 200 ng/ml bFGF inhibited cell adhesion; we also found that 100 ng/ml bFGF could significantly promote cell proliferation, and cellular ALP level, however, was reduced to the lowest of all groups. Conclusion bFGF may have complicated and multiple biological effects on BMSC, regulating cell adhension, proliferation and differentiation. Its effects are concentration-dependent.
, http://www.100md.com
Key words: basic fibroblast growth factor; bone marrow stromal cells; cell adhension; cell proliferation; cell differentiation
骨组织工程中种子细胞的选择与培养是最基本的环节，目前其来源有骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。相比之下，以骨髓为最优[1]。但是骨髓基质细胞具有多向分化潜能，可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和肌细胞等多方向转化[2]。 因此，为了提高骨髓的成骨效率，有必要选择合适的培养条件，以促进骨髓基质细胞的(Bone marrow stromal cells,BMSC)分裂增殖并定向分化为成骨细胞。本实验旨在观察碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)对骨髓基质细胞粘附、增殖与分化的影响，以期建立一种理想的培养体系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1主要仪器与试剂
相差显微镜(Olympus)，752紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，Bio-rad 450型酶联免疫检测仪(Pharmacia Biotech)、四唑盐MTT、碱性成纤维细胞生长因子bFGF(暨南大学生物系)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物制品公司)
1.2方法
1.2.1骨髓基质细胞的培养 取4～6周健康新西兰大白兔，双侧股部剪毛，碘酒、酒精消毒后，用 16号骨穿针自股骨大转子部穿入股骨骨髓腔，20 ml注射器抽吸双侧股骨骨髓共3 ml，混入无血清的1640培养基反复抽吸吹打。离心，除去上层脂肪细胞，再经滤网过滤，4号针头反复抽吸，制成单细胞悬液。加入3.5 ml含15% 胎牛血清(FBS)的培养基以3×106单个核细胞/ml的细胞数接种入培养瓶中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，5 d后半量换液，以后2～3 d半量换液1次。待细胞汇合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态及生长情况。
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1.2.2细胞粘附特性测定 将基本长满细胞的培养瓶内原培养基倒去，加入bFGF浓度分别为0、5、10、50、100、200 ng/ml的诱导培养基，置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下诱导培养24 h。消化计数，以2×104个细胞/孔接种于96孔板，1 h后吸去诱导培养基，0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PBS)轻洗3次，4%多聚甲醛固定。显微镜下采用体视学的方法，计算孔内粘附细胞数目。每组记数5个区域，计算出平均值，并用细胞个数/mm2来表示。
1.2.3细胞增殖测定 将传至第3代细胞以5×103 /孔密度接种于96孔培养板，每孔加入完全培养基200μl，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。24 h细胞完全贴壁后吸去培养基，分别加入不同的诱导培养基200μl，bFGF浓度分别为0、5、10、50、100、200 ng/ml，每组5孔，分别于第2、4、6天用四唑盐(MTT)比色法分析BMSC的存活和增殖能力。
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1.2.4细胞分化测定 细胞接种同上，分别于第2、4、6 天用考马斯亮蓝法测细胞总蛋白质，用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测细胞碱性磷酸酶活性。
1.3统计方法
使用SPSS统计软件对数据进行方差分析。
表1 bFGF对骨髓基质细胞粘附特性的影响(细胞/mm2)
Tab.1 The effect of bFGF on the cell adhension of BMSC (cells/mm2) Time
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
, http://www.100md.com
50 ng/ml
100 ng/ml
200 ng/ml
1 h
52.6±15.6
73.8±16.3*
154.2±30.6**
83.5±20.6*
66.6±18.4
25.5±8.8**
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 6
, 百拇医药
表2 bFGF对骨髓基质细胞增殖的影响(Dλ值)
Tab.2 The effect of bFGF on the cell proliferation of BMSC (Dλ value) Time (d)
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
50 ng/ml
100 ng/ml
200 ng/ml
2
0.141±0.005
, http://www.100md.com
0.146±0.004
0.147±0.007
0.152±0.007
0.163±0.011*
0.154±0.009
4
0.191±0.011
0.196±0.015
0.205±0.016
0.222±0.022*
0.260±0.020**
, http://www.100md.com
0.224±0.001*
6
0.293±0.016
0.302±0.023
0.307±0.031
0.330±0.020
0.348±0.017**
0.340±0.017*
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 5
表3 bFGF对骨髓基质细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性的影响(mU/mg蛋白质)
, 百拇医药
Tab.3 The effect of bFGF on the alkaline phosphatase activity in BMSC (mU/mg protein) Time (d)
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
50 ng/ml
100 ng/ml
200 ng/ml
2
2.5±0.7
2.2±0.6
, 百拇医药
1.9±0.7
1.6±0.7
1.4±0.5
1.6±0.6
4
4.4±0.6
4.1±0.8
3.9±0.7
3.1±0.9
2.9±0.8*
3.1±0.8
6
, 百拇医药
7.1±0.9
6.6±0.9
6.0±1.1
5.3±1.0*
4.9±0.9*
5.3±0.9*
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 5
2 结果与讨论
bFGF对骨髓基质细胞粘附、增殖和分化的影响分别见表1、表2和表3。
bFGF是一种肝素粘和多肽，分子量为25 kD，存在于骨组织中，具有多种细胞生物活性,包括影响细胞的粘附、增殖与分化的作用。(1)细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[3]。以往的研究表明bFGF有助于内皮细胞在聚氨酯材料上的粘附，且与bFGF促进内皮细胞表达β1整合素受体有关[4]。基于此，我们研究了bFGF对骨髓基质细胞粘附特性的影响。结果发现，10 ng/ml bFGF诱导 24 h后，细胞粘附数增加最明显，显著高于对照组(P<0.01)。随着bFGF浓度增加，细胞粘附数并不相应增加，100 ng/ml bFGF诱导后，细胞粘附数与对照组无明显差异，200 ng/ml bFGF诱导后，细胞粘附数甚至显著低于对照组(P<0.01)。机理可能与配体与受体的结合及结合后的反应有关。bFGF是否也是通过影响骨髓基质细胞β1整合素受体表达来改变其粘附特性，尚需进一步研究。(2)本实验中我们观察到bFGF对BMSC具有明显的促增殖作用，加入bFGF后在4 d时细胞数量明显增加，但bFGF加入的剂量与细胞生长之间并不完全是一个正性促增殖作用，在100 ng/ml达到最大促生长作用，而在200 ng/ml浓度时反而不如前者效果明显。这其中的机理可能与bFGF剂量加大时，其亲和受体亲和性下降或细胞内转化通道的阻滞有关。(3)碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一，在体外钙化中起着关键性作用。本实验结果显示bFGF加入剂量在100 ng/ml时细胞碱性磷酸酶活性最低，说明此时骨髓基质细胞的分化程度最低。由此看来，碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的，可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节，这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金项目(39970743)
作者简介：郑 磊(1974-)，男，江西宜春人，1997年毕业于第一军医大学，硕士，医师，联系电话：85142141
参考文献
1，魏宽海, 裴国献. 组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择[J]. 国外医学.创伤与外科基本问题分册, 1998, 19(3):155～8.
2，Beresford JN. Osteogenic stem cells and the stromal system of bone and marrow[J]. Clin Orthop, 1989, 240:270～7.
3，Boyan BD, Hummert TS, Dean DD et al. Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response[J]. Biomaterials, 1996, 17(2):137～46.
4，周序珑, 邓漪平. 碱性成纤维细胞生长因子对内皮细胞在聚氨酯材料上粘附的影响[J]. 生物医学工程学杂志, 1998, 15(3):214～7.
收稿日期：1999-12-01, 百拇医药
单位：郑磊(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)；王前(第一军医大学南方医院 检验科，广东 广州 510515)；魏宽海(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)；裴国献(第一军医大学南方医院 创伤骨科，广东 广州 510515)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；骨髓基质细胞；粘附；增殖；分化
第一军医大学学报000216 摘要： 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质细胞(BMSC)粘附、增殖和分化等生物学效应的影响。方法 利用体视学计数、四唑盐(MTT)比色法及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒分别测定不同浓度bFGF诱导一定时间后BMSC的粘附特性、增殖和分化情况的变化。结果10 ng/ml bFGF明显促进BMSC的粘附，但是200 ng/ml bFGF反而不利于细胞粘附；在细胞增殖和分化测定中，100 ng/ml bFGF明显促进细胞增殖，但细胞碱性磷酸酶含量也最低。结论 碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的，可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节，这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关。
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中图分类号: R318.01 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-S0004-02
Biological effects of basic fibroblast growth factor on bone marrow stromal cells
ZHENG Lei，WEI Kuan-hai，Pei Guo-xian
(Department of Orthopedics and Traumatology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
WANG Qian
(Department of Clinical Laboratory, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To investigate the biological effects of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells(BMSC). Methods BMSCs were subjected to the treatment with different concentrations of bFGF, after which the attached cells were estimated with stereological method, cell proliferation measured with methylthiazol tetrazolium (MTT) method and cell differentiation with alkaline phosphatase (ALP) measurement kit. Results 10 ng/ml bFGF can promote cell adhension significantly, while 200 ng/ml bFGF inhibited cell adhesion; we also found that 100 ng/ml bFGF could significantly promote cell proliferation, and cellular ALP level, however, was reduced to the lowest of all groups. Conclusion bFGF may have complicated and multiple biological effects on BMSC, regulating cell adhension, proliferation and differentiation. Its effects are concentration-dependent.
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Key words: basic fibroblast growth factor; bone marrow stromal cells; cell adhension; cell proliferation; cell differentiation
骨组织工程中种子细胞的选择与培养是最基本的环节，目前其来源有骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。相比之下，以骨髓为最优[1]。但是骨髓基质细胞具有多向分化潜能，可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和肌细胞等多方向转化[2]。 因此，为了提高骨髓的成骨效率，有必要选择合适的培养条件，以促进骨髓基质细胞的(Bone marrow stromal cells,BMSC)分裂增殖并定向分化为成骨细胞。本实验旨在观察碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)对骨髓基质细胞粘附、增殖与分化的影响，以期建立一种理想的培养体系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1主要仪器与试剂
相差显微镜(Olympus)，752紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，Bio-rad 450型酶联免疫检测仪(Pharmacia Biotech)、四唑盐MTT、碱性成纤维细胞生长因子bFGF(暨南大学生物系)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物制品公司)
1.2方法
1.2.1骨髓基质细胞的培养 取4～6周健康新西兰大白兔，双侧股部剪毛，碘酒、酒精消毒后，用 16号骨穿针自股骨大转子部穿入股骨骨髓腔，20 ml注射器抽吸双侧股骨骨髓共3 ml，混入无血清的1640培养基反复抽吸吹打。离心，除去上层脂肪细胞，再经滤网过滤，4号针头反复抽吸，制成单细胞悬液。加入3.5 ml含15% 胎牛血清(FBS)的培养基以3×106单个核细胞/ml的细胞数接种入培养瓶中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，5 d后半量换液，以后2～3 d半量换液1次。待细胞汇合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态及生长情况。
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1.2.2细胞粘附特性测定 将基本长满细胞的培养瓶内原培养基倒去，加入bFGF浓度分别为0、5、10、50、100、200 ng/ml的诱导培养基，置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下诱导培养24 h。消化计数，以2×104个细胞/孔接种于96孔板，1 h后吸去诱导培养基，0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PBS)轻洗3次，4%多聚甲醛固定。显微镜下采用体视学的方法，计算孔内粘附细胞数目。每组记数5个区域，计算出平均值，并用细胞个数/mm2来表示。
1.2.3细胞增殖测定 将传至第3代细胞以5×103 /孔密度接种于96孔培养板，每孔加入完全培养基200μl，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。24 h细胞完全贴壁后吸去培养基，分别加入不同的诱导培养基200μl，bFGF浓度分别为0、5、10、50、100、200 ng/ml，每组5孔，分别于第2、4、6天用四唑盐(MTT)比色法分析BMSC的存活和增殖能力。
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1.2.4细胞分化测定 细胞接种同上，分别于第2、4、6 天用考马斯亮蓝法测细胞总蛋白质，用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测细胞碱性磷酸酶活性。
1.3统计方法
使用SPSS统计软件对数据进行方差分析。
表1 bFGF对骨髓基质细胞粘附特性的影响(细胞/mm2)
Tab.1 The effect of bFGF on the cell adhension of BMSC (cells/mm2) Time
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
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50 ng/ml
100 ng/ml
200 ng/ml
1 h
52.6±15.6
73.8±16.3*
154.2±30.6**
83.5±20.6*
66.6±18.4
25.5±8.8**
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 6
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表2 bFGF对骨髓基质细胞增殖的影响(Dλ值)
Tab.2 The effect of bFGF on the cell proliferation of BMSC (Dλ value) Time (d)
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
50 ng/ml
100 ng/ml
200 ng/ml
2
0.141±0.005
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0.146±0.004
0.147±0.007
0.152±0.007
0.163±0.011*
0.154±0.009
4
0.191±0.011
0.196±0.015
0.205±0.016
0.222±0.022*
0.260±0.020**
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0.224±0.001*
6
0.293±0.016
0.302±0.023
0.307±0.031
0.330±0.020
0.348±0.017**
0.340±0.017*
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 5
表3 bFGF对骨髓基质细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性的影响(mU/mg蛋白质)
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Tab.3 The effect of bFGF on the alkaline phosphatase activity in BMSC (mU/mg protein) Time (d)
0 ng/ml
5 ng/ml
10 ng/ml
50 ng/ml
100 ng/ml
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2
2.5±0.7
2.2±0.6
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1.9±0.7
1.6±0.7
1.4±0.5
1.6±0.6
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4.4±0.6
4.1±0.8
3.9±0.7
3.1±0.9
2.9±0.8*
3.1±0.8
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7.1±0.9
6.6±0.9
6.0±1.1
5.3±1.0*
4.9±0.9*
5.3±0.9*
Mean±SD; * P< 0.05, ** P<0.01 vs control group, n = 5
2 结果与讨论
bFGF对骨髓基质细胞粘附、增殖和分化的影响分别见表1、表2和表3。
bFGF是一种肝素粘和多肽，分子量为25 kD，存在于骨组织中，具有多种细胞生物活性,包括影响细胞的粘附、增殖与分化的作用。(1)细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[3]。以往的研究表明bFGF有助于内皮细胞在聚氨酯材料上的粘附，且与bFGF促进内皮细胞表达β1整合素受体有关[4]。基于此，我们研究了bFGF对骨髓基质细胞粘附特性的影响。结果发现，10 ng/ml bFGF诱导 24 h后，细胞粘附数增加最明显，显著高于对照组(P<0.01)。随着bFGF浓度增加，细胞粘附数并不相应增加，100 ng/ml bFGF诱导后，细胞粘附数与对照组无明显差异，200 ng/ml bFGF诱导后，细胞粘附数甚至显著低于对照组(P<0.01)。机理可能与配体与受体的结合及结合后的反应有关。bFGF是否也是通过影响骨髓基质细胞β1整合素受体表达来改变其粘附特性，尚需进一步研究。(2)本实验中我们观察到bFGF对BMSC具有明显的促增殖作用，加入bFGF后在4 d时细胞数量明显增加，但bFGF加入的剂量与细胞生长之间并不完全是一个正性促增殖作用，在100 ng/ml达到最大促生长作用，而在200 ng/ml浓度时反而不如前者效果明显。这其中的机理可能与bFGF剂量加大时，其亲和受体亲和性下降或细胞内转化通道的阻滞有关。(3)碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一，在体外钙化中起着关键性作用。本实验结果显示bFGF加入剂量在100 ng/ml时细胞碱性磷酸酶活性最低，说明此时骨髓基质细胞的分化程度最低。由此看来，碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的，可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节，这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关。
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基金项目：国家自然科学基金项目(39970743)
作者简介：郑 磊(1974-)，男，江西宜春人，1997年毕业于第一军医大学，硕士，医师，联系电话：85142141
参考文献
1，魏宽海, 裴国献. 组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择[J]. 国外医学.创伤与外科基本问题分册, 1998, 19(3):155～8.
2，Beresford JN. Osteogenic stem cells and the stromal system of bone and marrow[J]. Clin Orthop, 1989, 240:270～7.
3，Boyan BD, Hummert TS, Dean DD et al. Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response[J]. Biomaterials, 1996, 17(2):137～46.
4，周序珑, 邓漪平. 碱性成纤维细胞生长因子对内皮细胞在聚氨酯材料上粘附的影响[J]. 生物医学工程学杂志, 1998, 15(3):214～7.
收稿日期：1999-12-01, 百拇医药