4种细胞因子对K562/S及其耐药细胞株K562/A02积蓄柔红霉素的影响
作者：平宝红 周淑芸 刘启发 杨纯正
单位：平宝红(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；周淑芸(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；刘启发(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；杨纯正(中国医学科学院血液病研究所，天津 300020)
关键词：白血病；多药耐药性；细胞因子；药物积蓄作用
第一军医大学学报000208 摘要：目的 通过检测4种常用细胞因子对白血病细胞株K562/S及其多药耐药细胞株K562/A02积蓄柔红霉素(DNR)能力的影响，评价细胞因子在抗白血病细胞多药耐药性方面的应用前景。方法 用流式细胞仪及荧光法检测重组人α-干扰素(IFN-α)、白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、重组人粒-单集落刺激因子(GM-CSF)对K562/S及K562/A02积蓄柔红霉素能力的影响。结果 IL-2、TNF、GM -CSF作用后K562/S及K562/A02细胞株对柔红霉素的积蓄无改变，而IFN-α可显著提高耐药细胞系K562/A02细胞内DNR浓度，在150 min时升高了4.01倍(P<0.05)。结论 小剂量(500 U/ml)α-干扰素作用后，多药耐药细胞株K562/A02对抗肿瘤药物DNR的积蓄作用大大提高，提示IFN-α具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。
, 百拇医药
中图分类号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0158-03
Effect of 4 cytokines on intracellular accumulation of daunorubicin in K562/A02
PING Bao-hong，ZHOU Shu-yun，LIU Qi-fa
(Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
YANG Chun-zheng
, 百拇医药 (Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)Abstract: Objective To explore measures to overcome multidrug resistance of leukemia cells. Methods The effects of 4 cytokines on intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/S and K562/A02 cells were studied by spectrofluorimetry and flow cytometric analysis. Results IFN-α(500 U/ml) could enhance the accumulation of DNR in K562/A02 cells. DNR concentration in K562/A02 was increased by 4.01 folds when cultured with IFN-αfor 150 min, while the other 3 cytokines had no effect on the accumulation of DNR in K562/S and K562/A02 cells. Conclusion IFN-α(500 U/ml) can markedly enhance the intracellular accumulation of DNR in K562/A02 cells.
, 百拇医药
Key words: leukemia; multidrug resistance; cytokines; accumulation effect; daunorubicin
1 材料和方法
1.1 材料
K562/S及K562/A02细胞均为中国医学科学院血液学研究所药物室提供；药物及试剂106 U/ml重组人α-干扰素 (IFNα) 由英国威康基金会提供、106 U/ml 肿瘤坏死因子(TNF)，105 U/ml 白细胞介素(IL-2)购自军事医学科学院，300 mg/L 重组人粒-单集落刺激因子(GM-CSF)由美国先灵葆雅药厂生产。
1.2 培养基
为含15%新生小牛血清，400 U/ml 庆大霉素的RPMI 1640培养液(Sigma)。
, 百拇医药
1.3 荧光法测定柔红霉素(DNR)积蓄
参照文献[1]所述方法，取对数生长期的K562/S及K562/A02细胞悬液(浓度为4×108/L)并分为4组，各组分别加入TNF、IFN-α、IL-2、GM-CSF使其终浓度分别为500、500、250、0.15 mg/L。孵育24 h后离心并均用等量RPMI 1640稀释。37℃水浴振荡片刻后各组均加入 DNR使其终浓度为 2 m mol/L。各组分别于0、10、20、30、60、90、120、180、210 min后取出悬液1.0 ml，其中0.8 ml在荧光分光光度仪上测定荧光强度，另0.2 ml以菲林酚法进行细胞蛋白定量。根据标准曲线计算单位蛋白浓度中的DNR量。未加细胞因子孵育者为对照组。每个试验重复3次。
1.5 流式细胞仪(FACS)分析细胞内DNR浓度
参照文献[2]方法，用EPICSCA临床型流式细胞仪检测。参照步骤1.3，发现150 min时K562/A02细胞内DNR浓度达高峰且较稳定，故取150 min为实验点。各组分别经同样浓度IFN-α、IL-2、TNF、GM-CSF、DNR作用后取0时间点为空白对照，150 min时各取细胞悬液2.0 ml，冰浴以终止DNR的进一步摄取，应用FACS 进行测定细胞内DNA浓度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 荧光法测定4种细胞因子对K562/S及K562/A02细胞内DNR积聚的影响
K562/A02细胞经IFN-α作用后细胞内DNR含量明显上升，150 min时为(2 798.42±135.69)m g/mg蛋白，未加用组为(693.96±12.73)m g/mg，150 min时提高了4.01倍，两者间存在显著性差异(P<0.05)。K562/S细胞内IFN-α作用组与对照组无显著差异，分别为(3671.81±30.23)表1 经4种细胞因子作用后K562/A02细胞内DNR积蓄改变(μg/mg蛋白)m g/mg和(3525.09±161.61)m g/mg，P>0.05(图1)。而IL-2、TNF、GM-CSF对K562/A02及K562/S细胞内药物积蓄无影响(表1)。
Tab.1 The effects of 4 cytokines on intracellular DNR accumulation in K562/A02 Cumulative dose of DNR at different time points (μg/mg pro.)
, 百拇医药
Group
0
60
120
150
K562/A02
0
441.031±13.322
688.064±11.112
693.96±12.73
K562/A02+IL-2
0
, 百拇医药
4 339.012±11.138
694.012±13.617
890.12±10.973
K562/A02+IFN-α
0
1 648.012±13.713
2 590.033±10.104
2 798.42±13.567
K562/A02+TNF
0
442.834±9.888
, 百拇医药
690.795±15.014
891.314±12.531
2.2流式细胞仪分析结果
将K562/A02细胞经IFN-α作用组与对照组的DNR峰合并，发现两者波峰不同，IFN-α作用组的波峰明显右移，表明500 U/ml IFN-α具有提高耐药细胞株K562/A02细胞内DNR浓度的作用(图2)。IFN-α、TNF、GM-CSF作用后K562/S及K562/A02与对照组的DNR峰合并发现均为同一峰，表明IL-2、TNF、GM-CSF对K562/S及K562/A02细胞积蓄DNR无影响。
图1 IFN-α对K562/S及K562/A02细胞内DNR浓度影响
, http://www.100md.com
Fig.1 The effect of IFN-α on intracellular DNR accnmulation in K562/S and K562/A02 cells
图2 FACS检测经2μmol/L DNR孵育150 min时K562/A02及K562/A02+IFN-α荧光强度
Fig.2 The change of DNR concentration in K562/A02 and K562/A02 cells after cultured with IFN-α
3 讨论
干扰素是一种糖蛋白，具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒等作用。一些研究表明IFN-α与抗癌药物合用可治疗一些复发、难治肿瘤，取得了常规治疗达不到的效果，但IFN-α恢复抗癌药物敏感性的机制还不清楚。本研究结果显示IFN-α作用后，K562/A02细胞对抗癌抗物DNR的积蓄能力明显提高，提示IFN-α通过恢复多药耐药细胞的药物积蓄能力而恢复抗癌药物对肿瘤的杀伤能力。Scala[3]也有相似的结果。
, 百拇医药
本实验所采用的K562/A02耐药细胞系是典型的多药耐药细胞，对多种亲脂类抗肿瘤药具有耐药性，使DNR的积蓄能力明显下降[4]。本实验结果显示IFN-α作用后，K562/A02细胞株对DNR的积蓄能力大大提高，而对其亲代敏感细胞对药物的敏感性无明显影响。我们推测其作用机制有以下几种可能性：(1)直接抑制P-糖蛋白(P-170)功能，从而导致其泵出药物能力下降；(2)作用于蛋白质合成环节，使P-170合成减少；(3)改变细胞膜通透性，使药物流入大于流出，从而提高细胞对药物的积蓄能力；(4)抑制mdr1基因的表达；(5)通过影响多药耐药性相关蛋白(MRP)、蛋白激酶(PKC)等途径而起作用。以上推测尚需进一步研究证实。
IFN-α毒副作用小，具有较大的研究价值及应用前景，IFN-α有可能成为安全有效的逆转剂。然而IFN对MDR的影响尚存在分歧，Michieli[5]对63例白血病检测，发现IFN-α治疗后，P-170阳性细胞明显增加，似乎提示IFN-α诱导MDR1/P-170表达。IFN-α在此方面的作用尚需深入研究。
, 百拇医药
作者简介：平宝红(1966-)，女，河南睢县人，1989年毕业于第一军医大学，讲师、主治医师，电话：85141615
参考文献
1，马建国, 杨纯正, 李 中等. 白血病细胞内柔红霉素的测定[J]. 药物分析杂志, 1992, 12(1):9～12.
2，何一心, 杨少光, 张淑清等. 多药耐药细胞的鉴别和分离[J]. 中华血液学杂志, 1992, 13(6):13～4.
3，Scala S, Pacelli R, laffaioli RV et al. Reversal of adriamycin resistance by recombinant α-Interferon in multidrug resist Human Colon Carcioma Lovo-Doxorubicin Cells[J]. Cancer Res, 1991, 51(18): 4898～902.
4，栾凤君, 杨纯正, 马建国. 一株人红白血病多药耐药细胞系K562/A02的建立及其耐药性的研究[J]. 中华肿瘤杂志, 1993, 15(2):101～3.
5，Michieli M, Raspadovi D, Damiani D et al. The expression of the multi-drug resistance-associated glycoprotein in B-cell chronic lyphocytic leukemic[J]. Br J Hematol, 1991, 77(4):460～5.
收稿日期：1999-03-29, http://www.100md.com
单位：平宝红(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；周淑芸(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；刘启发(第一军医大学南方医院血液科，广东 广州 510515)；杨纯正(中国医学科学院血液病研究所，天津 300020)
关键词：白血病；多药耐药性；细胞因子；药物积蓄作用
第一军医大学学报000208 摘要：目的 通过检测4种常用细胞因子对白血病细胞株K562/S及其多药耐药细胞株K562/A02积蓄柔红霉素(DNR)能力的影响，评价细胞因子在抗白血病细胞多药耐药性方面的应用前景。方法 用流式细胞仪及荧光法检测重组人α-干扰素(IFN-α)、白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、重组人粒-单集落刺激因子(GM-CSF)对K562/S及K562/A02积蓄柔红霉素能力的影响。结果 IL-2、TNF、GM -CSF作用后K562/S及K562/A02细胞株对柔红霉素的积蓄无改变，而IFN-α可显著提高耐药细胞系K562/A02细胞内DNR浓度，在150 min时升高了4.01倍(P<0.05)。结论 小剂量(500 U/ml)α-干扰素作用后，多药耐药细胞株K562/A02对抗肿瘤药物DNR的积蓄作用大大提高，提示IFN-α具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。
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中图分类号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0158-03
Effect of 4 cytokines on intracellular accumulation of daunorubicin in K562/A02
PING Bao-hong，ZHOU Shu-yun，LIU Qi-fa
(Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
YANG Chun-zheng
, 百拇医药 (Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)Abstract: Objective To explore measures to overcome multidrug resistance of leukemia cells. Methods The effects of 4 cytokines on intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/S and K562/A02 cells were studied by spectrofluorimetry and flow cytometric analysis. Results IFN-α(500 U/ml) could enhance the accumulation of DNR in K562/A02 cells. DNR concentration in K562/A02 was increased by 4.01 folds when cultured with IFN-αfor 150 min, while the other 3 cytokines had no effect on the accumulation of DNR in K562/S and K562/A02 cells. Conclusion IFN-α(500 U/ml) can markedly enhance the intracellular accumulation of DNR in K562/A02 cells.
, 百拇医药
Key words: leukemia; multidrug resistance; cytokines; accumulation effect; daunorubicin
1 材料和方法
1.1 材料
K562/S及K562/A02细胞均为中国医学科学院血液学研究所药物室提供；药物及试剂106 U/ml重组人α-干扰素 (IFNα) 由英国威康基金会提供、106 U/ml 肿瘤坏死因子(TNF)，105 U/ml 白细胞介素(IL-2)购自军事医学科学院，300 mg/L 重组人粒-单集落刺激因子(GM-CSF)由美国先灵葆雅药厂生产。
1.2 培养基
为含15%新生小牛血清，400 U/ml 庆大霉素的RPMI 1640培养液(Sigma)。
, 百拇医药
1.3 荧光法测定柔红霉素(DNR)积蓄
参照文献[1]所述方法，取对数生长期的K562/S及K562/A02细胞悬液(浓度为4×108/L)并分为4组，各组分别加入TNF、IFN-α、IL-2、GM-CSF使其终浓度分别为500、500、250、0.15 mg/L。孵育24 h后离心并均用等量RPMI 1640稀释。37℃水浴振荡片刻后各组均加入 DNR使其终浓度为 2 m mol/L。各组分别于0、10、20、30、60、90、120、180、210 min后取出悬液1.0 ml，其中0.8 ml在荧光分光光度仪上测定荧光强度，另0.2 ml以菲林酚法进行细胞蛋白定量。根据标准曲线计算单位蛋白浓度中的DNR量。未加细胞因子孵育者为对照组。每个试验重复3次。
1.5 流式细胞仪(FACS)分析细胞内DNR浓度
参照文献[2]方法，用EPICSCA临床型流式细胞仪检测。参照步骤1.3，发现150 min时K562/A02细胞内DNR浓度达高峰且较稳定，故取150 min为实验点。各组分别经同样浓度IFN-α、IL-2、TNF、GM-CSF、DNR作用后取0时间点为空白对照，150 min时各取细胞悬液2.0 ml，冰浴以终止DNR的进一步摄取，应用FACS 进行测定细胞内DNA浓度。
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2 结果
2.1 荧光法测定4种细胞因子对K562/S及K562/A02细胞内DNR积聚的影响
K562/A02细胞经IFN-α作用后细胞内DNR含量明显上升，150 min时为(2 798.42±135.69)m g/mg蛋白，未加用组为(693.96±12.73)m g/mg，150 min时提高了4.01倍，两者间存在显著性差异(P<0.05)。K562/S细胞内IFN-α作用组与对照组无显著差异，分别为(3671.81±30.23)表1 经4种细胞因子作用后K562/A02细胞内DNR积蓄改变(μg/mg蛋白)m g/mg和(3525.09±161.61)m g/mg，P>0.05(图1)。而IL-2、TNF、GM-CSF对K562/A02及K562/S细胞内药物积蓄无影响(表1)。
Tab.1 The effects of 4 cytokines on intracellular DNR accumulation in K562/A02 Cumulative dose of DNR at different time points (μg/mg pro.)
, 百拇医药
Group
0
60
120
150
K562/A02
0
441.031±13.322
688.064±11.112
693.96±12.73
K562/A02+IL-2
0
, 百拇医药
4 339.012±11.138
694.012±13.617
890.12±10.973
K562/A02+IFN-α
0
1 648.012±13.713
2 590.033±10.104
2 798.42±13.567
K562/A02+TNF
0
442.834±9.888
, 百拇医药
690.795±15.014
891.314±12.531
2.2流式细胞仪分析结果
将K562/A02细胞经IFN-α作用组与对照组的DNR峰合并，发现两者波峰不同，IFN-α作用组的波峰明显右移，表明500 U/ml IFN-α具有提高耐药细胞株K562/A02细胞内DNR浓度的作用(图2)。IFN-α、TNF、GM-CSF作用后K562/S及K562/A02与对照组的DNR峰合并发现均为同一峰，表明IL-2、TNF、GM-CSF对K562/S及K562/A02细胞积蓄DNR无影响。
图1 IFN-α对K562/S及K562/A02细胞内DNR浓度影响
, http://www.100md.com
Fig.1 The effect of IFN-α on intracellular DNR accnmulation in K562/S and K562/A02 cells
图2 FACS检测经2μmol/L DNR孵育150 min时K562/A02及K562/A02+IFN-α荧光强度
Fig.2 The change of DNR concentration in K562/A02 and K562/A02 cells after cultured with IFN-α
3 讨论
干扰素是一种糖蛋白，具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒等作用。一些研究表明IFN-α与抗癌药物合用可治疗一些复发、难治肿瘤，取得了常规治疗达不到的效果，但IFN-α恢复抗癌药物敏感性的机制还不清楚。本研究结果显示IFN-α作用后，K562/A02细胞对抗癌抗物DNR的积蓄能力明显提高，提示IFN-α通过恢复多药耐药细胞的药物积蓄能力而恢复抗癌药物对肿瘤的杀伤能力。Scala[3]也有相似的结果。
, 百拇医药
本实验所采用的K562/A02耐药细胞系是典型的多药耐药细胞，对多种亲脂类抗肿瘤药具有耐药性，使DNR的积蓄能力明显下降[4]。本实验结果显示IFN-α作用后，K562/A02细胞株对DNR的积蓄能力大大提高，而对其亲代敏感细胞对药物的敏感性无明显影响。我们推测其作用机制有以下几种可能性：(1)直接抑制P-糖蛋白(P-170)功能，从而导致其泵出药物能力下降；(2)作用于蛋白质合成环节，使P-170合成减少；(3)改变细胞膜通透性，使药物流入大于流出，从而提高细胞对药物的积蓄能力；(4)抑制mdr1基因的表达；(5)通过影响多药耐药性相关蛋白(MRP)、蛋白激酶(PKC)等途径而起作用。以上推测尚需进一步研究证实。
IFN-α毒副作用小，具有较大的研究价值及应用前景，IFN-α有可能成为安全有效的逆转剂。然而IFN对MDR的影响尚存在分歧，Michieli[5]对63例白血病检测，发现IFN-α治疗后，P-170阳性细胞明显增加，似乎提示IFN-α诱导MDR1/P-170表达。IFN-α在此方面的作用尚需深入研究。
, 百拇医药
作者简介：平宝红(1966-)，女，河南睢县人，1989年毕业于第一军医大学，讲师、主治医师，电话：85141615
参考文献
1，马建国, 杨纯正, 李 中等. 白血病细胞内柔红霉素的测定[J]. 药物分析杂志, 1992, 12(1):9～12.
2，何一心, 杨少光, 张淑清等. 多药耐药细胞的鉴别和分离[J]. 中华血液学杂志, 1992, 13(6):13～4.
3，Scala S, Pacelli R, laffaioli RV et al. Reversal of adriamycin resistance by recombinant α-Interferon in multidrug resist Human Colon Carcioma Lovo-Doxorubicin Cells[J]. Cancer Res, 1991, 51(18): 4898～902.
4，栾凤君, 杨纯正, 马建国. 一株人红白血病多药耐药细胞系K562/A02的建立及其耐药性的研究[J]. 中华肿瘤杂志, 1993, 15(2):101～3.
5，Michieli M, Raspadovi D, Damiani D et al. The expression of the multi-drug resistance-associated glycoprotein in B-cell chronic lyphocytic leukemic[J]. Br J Hematol, 1991, 77(4):460～5.
收稿日期：1999-03-29, http://www.100md.com