大鼠脑损伤时神经细胞c-fos 、c-jun和c-myc基因表达变化
作者：王清华 徐如祥 钟世镇
单位：王清华(第一军医大学 珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学 珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；钟世镇(解剖学研究所，广东 广州 510515 )
关键词：脑损伤；fos基因；jun基因；myc基因
第一军医大学学报000203 摘要：目的 观察大鼠脑损伤后不同时间皮质神经细胞早期快反应基因c-fos 、c-jun和c-myc表达变化。方法 应用Northern杂交、原位杂交和免疫组织化学方法检测皮质神经细胞中c-fos、c-jun和c-myc的表达。结果 脑损伤后15 min，伤侧皮质神经细胞出现上述3种基因mRNA的表达，随时间的延长，表达逐渐增加，于伤后3 h达高峰并持续至伤后24 h，伤后72 h恢复至对照水平。c-fos和c-jun蛋白表达亦于伤后15 min出现，c-myc蛋白表达于伤后30 min出现，并均于伤后3 h达高峰，持续至伤后6 h，伤后24 h表达消失。结论 脑损伤后上述3种基因表达特点与其它脑损害不同，可能与损伤机制和继发性神经细胞损害有关。
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中图分类号：R394.2; R651.15 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0120-04
Expression of c-fos, c-jun and c-myc gene in cerebral cortical neurons following brain trauma in rats
WANG Qing-hua，XU Ru-xiang
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, First Millatary Medical University, Guangzhou 510282, China)
ZHONG Shi-zhen
, 百拇医药
(Institute of Anatomy, First Military Medical University, Gangzhou 510515, China)Abstract: Objective To observe the expression of c-fos, c-jun and c-myc genes in cerebral cortical neurons following brain trauma in rats. Methods The expression of c-fos, c-jun and c-myc was detected by using Northern and in situ hybridization and immunocytochemistry. Results The expression of the mRNA of c-fos, c-jun and c-myc genes was observed in neurons 15 min following the injury in the ipsilateral cerebral cortex, which increased gradually and reached their peak at h 6, lasting till h 24 and failed to be detected at h 72. c-fos and c-jun proteins expression were present 15 min after injury and c-myc protein after 30 min, peaking at h 3 and lasting till h 6, and resumed normal level at h 24. Conclusions The expression characteristic of c-fos, c-jun and c-myc gene differs from that in other brain injures, which may be related to different injury mechanism and secondary neuronal damage.
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Key words: brain trauma; fos genes; c-jun genes; c-myc genes
近年越来越多的研究结果表明，癫癎和脑缺血后早期快反应基因 c-fos有不同程度表达，并与继发性病理过程如神经细胞凋亡有关[1、2]。脑损伤后多个早期快反应基因表达的研究尚鲜见报道。本文同时观察了3种早期快反应基因c-fos 、c-jun和c-myc mRNA和蛋白在大鼠脑损伤后的表达水平变化和时相特点，旨在深入探讨早期快反应基因在脑继发性病理过程中的作用。
1 材料与方法
1.1主要试剂及来源
重组人c-fos 、c-jun和c-myc 质粒由军事医学科学院三所八室提供；DEPC、异硫氰酸胍、鲑鱼精子DNA、酵母tRNA购自Sigma公司；蛋白酶K、地高辛标记与检测试剂盒购自Boehringer-Mannheim公司；羊抗c-fos抗体、抗羊ABC试剂盒购自Cambridge Research Chemicals公司；鼠抗c-jun、c-myc抗体和抗鼠SP试剂盒购自Maxim公司。
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1.2实验动物与分组
雄性SD大鼠72只，随机分为正常对照、假手术及脑损伤组。脑损伤组又分为伤后15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h共12组，每组6只。实验前后动物自由饮食、进水。
1.3脑损伤模型
采用自由落体硬膜外脑损伤的方法[3]。实验动物用10%水合氯醛0.35 g/kg.b.w.腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，在左顶骨开窗，硬膜保持完整，用20 g砝码于30 cm高处坠落，制成局灶性脑挫伤，致伤冲击力为600 g.cm。骨窗用锌汀粉封闭。正常对照组不作任何处理，假手术组仅切开头皮和颅骨钻孔而不致脑损伤，术后6 h处死。
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1.4 Northern杂交
伤侧脑皮质总RNA提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法[4]。采用甲醛琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，应用真空印迹法将凝胶上的RNA转移至尼龙膜上，80℃、2 h烘干备用。Northern杂交采用同位素标记的c-fos、c-jun和c-myc DNA探针。杂交液成分：5×SSC，5×Denhardt's液，50%去离子甲酰胺，2%SDS，20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.1%乙桂酰肌酐酸钠，500 mg/L变性鲑鱼精子DNA，50 mg/L酵母tRNA，10%硫酸葡聚糖。10μg/L变性同位素标记c-fos或c-jun或c-myc，42℃水浴杂交24 h。经杂交后漂洗，膜置暗盒内–20℃曝光72 h，Kadark自动洗片机洗片。
1.4 原位杂交
用4%多聚甲醛经升主动脉行灌注固定，取脑组织浸入 4%多聚甲醛内4℃后固定48 h，用振动切片机行40 μm连续冠状切片。切片用0.1 mol/L PBS(pH7.4，DEPC水配制)洗3次，2 mg/L蛋白酶K消化30 min。原位杂交按地高辛标记与检测试剂盒说明书进行。按50μl/切片加入杂交液，42℃杂交24 h。杂交液成分：5×SSC，50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2% SDS，0.1 mol/L二硫苏糖醇，200 mg/L变性鲑鱼精子DNA，50 mg/L酵母tNRA，0.5 mg/L变性的地高辛标记c-fos、c-jun或c-myc DNA探针。经杂交后漂洗，按50μl/切片加入1:1 000抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物，室温过夜。缓冲液1(0.1 mol/L Tris.Cl，pH7.5，0.15 mol/L NaCl)和缓冲液3(0.1 mol/L Tris.Cl，pH9.5，0.15 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2)室温各洗2次，NBT/BCIP 4℃显色过夜。TE终止反应，裱片、伊红复染、脱水、透明、中性树胶封片。
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Northern杂交和原位杂交均设阳性对照和阴性对照实验。阳性对照：单独使用同位素标记或地高辛标记β-actin探针，结果为阳性。阴性对照：杂交前使用100 mg/L的RNA酶37℃孵育30 min或杂交液内不加标记的DNA探针，结果为阴性。
1.5 免疫组织化学
40μm冠状切片用0.01 mol/L PBS (pH7.4) 洗3次，入0.3% H2O2水溶液，室温，30 min。入1:2 000羊抗c-fos抗体或即用型鼠抗c-jun或c-myc抗体，4℃放置48 h。再入1:200生物素化抗羊IgG或抗鼠IgG，室温2 h。再入1:100链亲和素-HRP复合物，室温1 h。DAB显色，裱片、脱水、透明、封片。
免疫组织化学法设阴性对照实验：应用0.01 mol/L PBS(pH7.5)代替羊抗c-fos或鼠抗c-jun或c-myc抗体，结果显示均为阴性。
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2 结果
Northern杂交显示正常对照和假手术组大鼠脑皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA无明显表达。伤后15 min伤侧皮质出现c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达，并随着时间的延长，表达逐渐增加，3种基因mRNA表达均于伤后3 h达高峰，持续至伤后24 h，以后表达逐渐下降，伤后48 h仍有轻度表达，至伤后72 h恢复正常(图1)。
原位杂交发现伤侧脑皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达规律与Northern杂交相同，两种基因mRNA表达以损伤周围最为明显，损伤区边缘仍有明显表达(图 2～4)。
免疫组织化学发现正常对照和假手术组大鼠脑皮质无明显c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达。伤侧脑皮质c-fos和c-jun蛋白表达于伤后15 min即已出现，c-myc蛋白表达于伤后30 min出现，随伤后时间的延长，3种基因蛋白表达逐渐增加，均于伤后3 h达高峰，持续至伤后6 h，以后表达逐渐减弱，至伤后24 h表达消失。c-fos和c-jun蛋白表达以远离损伤区为明显，损伤区边缘及其周围基本无表达，而c-myc蛋白则在损伤区边缘仍有明显表达(图5～7)。
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图1 Northern 杂交结果 ×125
Fig.1 Result of Northern hybridization ×125
Lane 1 to lane 4 corresponds respectively to the c-fos mRNA expression 15 min, 30 min, 1 h and 6 h after the injury, which shows a gradual increase.
图2～4 伤后6 h 损伤周围脑皮质神经细胞c-fos (Fig.2) c-jun (Fig.3)和c-myc (Fig.4) mRNA 表达明显 碱性磷酸酶染色′ 125
Fig.2–4 mRNA expression of c-fos (Fig.2) , c-jun (Fig.3) , c-myc (Fig.4) genes is obvious in the neurons of the cerebral cortex around the lesion 6
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h after injury AP staining ′ 125
图5～7 伤后6 h 脑皮质细胞c-fos(Fig.5) c-jun(Fig.6)和c-myc(Fig.7)蛋白表达以远离损伤区为明显 辣根过氧化物酶染色′ 125
Fig. 5–7 Protein expression by c-fos (Fig.5) , c-jun (Fig.6) , c-myc (Fig.7) genes is obvious in the neurons of the cerebral cortex distant from the
lesion 6 h after injury HRP staining ′ 125
3 讨论
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早期快反应基因c-fos、c-jun和c-myc普遍存在于中枢神经细胞，正常情况下表达水平很低，难于检测。在受到各种外界刺激后，神经细胞早期快反应基因出现快速表达，通过它们的表达蛋白传递和整合信息，作用于目的基因，改变其转录水平，发挥细胞核内第三信使的作用，参与神经细胞的生长、分化和损伤修复的调节[5、6]。研究脑损伤时早期快反应基因表达的意义在于明确它们对继发性病理损害过程发生与发展的影响，尤其是在神经细胞损伤机理与抗损伤修复机制中的作用。
中枢神经系统在受到伤害性刺激时，早期快反应基因c-fos、c-jun出现异常表达。药物诱发癫癎时，脑不同部位出现c-fos、c-jun mRNA及其蛋白表达。c-fos、c-jun mRNA于用药后15 min开始表达，1 h达高峰，16 h后恢复至正常水平。c-fos蛋白30 min后开始表达，2～4 h时处于高峰期，8 h后降至正常。c-jun蛋白表达时间晚于c-fos蛋白，于4 h达高峰，24 h后恢复正常[7、8]。局部脑缺血后30 min，除坏死区域以外的整个同侧大脑皮质出现c-fos mRNA表达并持续至缺血后90 min，缺血后1 h皮质c-fos蛋白开始表达，持续至缺血后8 h[9]。
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目前尚无脑损伤后不同时间早期快反应基因c-fos、c-jun和c-myc mRNA和蛋白表达变化的系统研究。本实验发现大鼠脑损伤后15 min，伤侧皮质出现c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达，并随时间的延长，表达水平逐渐升高，至伤后3 h达高峰，持续至伤后24 h，以后表达逐渐降低，至伤后72 h 恢复正常。表达以损伤周围最为明显。损伤后皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达的时序性及时程与癫癎和脑缺血时不同，可能与损伤机制有关。其表达时相应部位分布特点与具体神经细胞水肿和损害的表达规律相吻合[9]，提示上述3种早期快反应基因表达可能与脑继发性病理过程有关。脑损伤后皮质c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达于伤后15～30 min出现，伤后3～6 h达高峰。c-fos和c-jun蛋白表达以损伤区及其周围以外的区域最明显，表明c-fos和c-jun蛋白表达的意义与mRNA表达不同。Dragunow等[2]在脑缺血的实验中观察到，脑缺血梗塞区坏死细胞未见c-fos和c-jun蛋白表达，而梗塞区以外的区域出现神经细胞凋亡，调亡神经细胞出现c-fos和c-jun蛋白的过度表达。脑损伤边缘区及其周围c-fos、c-jun mRNA表达增加而蛋白表达消失，可能表示损伤区及其周围神经细胞向不可逆损害或坏死发展。在上述区域之外的c-fos和c-jun蛋白表达的意义，可能与神经细胞凋亡有关，也可能与部分神经细胞轴突突起再生有关，后者多见于癫癎[7]。正常情况下，c-myc基因主要参与细胞周期的调控，与细胞的生长、分化有关。脑损伤后c-myc基因表达，尤其是损伤周围c-myc mRNA和蛋白表达同时增加，推测与局部神经细胞轴突反应和反应性胶质细胞增生有关。
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脑损伤后早期快反应基因表达的机制尚未完全阐明。目前认为谷氨酸受体被激活和钙离子内流是引起早期快反应基因表达的两个主要因素[10]。脑损伤时早期谷氨酸释放增加，NMDA受体的激活介导脑损害时早期快反应基因表达。研究发现脑损伤后谷氨酸大量释放、NMDA受体过度激活及钙超载是引起神经细胞水肿和死亡的关键因素[9]，深入探讨脑损伤后早期快反应基因表达调控机制有助于阐明继发性脑损害的分子机制。
资金项目：军队九五杰出中青年人才基金资助项目(96-M-83)
作者简介：王清华(1965-)，男，云南丽江人，1987年毕业于大理医学院，博士，主治医师，电话：85143622
参考文献
1，Dragunow M, Young D, Hughes P et al. Is c-jun involved in nerve cell death following status epilepticus and hypoxic-ischaemic brain injury[J]. Mol Brain Res, 1993, 18(4):347～52.
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2，Dragunow M, Beilharz E, Sirimanne E et al. Immediate-early geneprotein expression in neurons undergoing delayed death, but not necrosis, following hypoxic-ischaemic injury to the young rat brain [J].Mol Brain Res, 1994, 25(1-2):19～33.
3，Feeney DM, Boyeson MG, Linn RT et al. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rats[J]. Brain Res, 1981, 211:67.
4，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987, 162(1):156～9.
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5，Sheng M, Greenberg ME. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system[J]. Neuron, 1990, 4(4):477～85.
6，Angel P, karin M. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation[J]. Biochem biophys Acta, 1991,1072(2-3):129～57.
7，Morgan JI, Curran T. Proto-oncogene transcription factors and epilepsy[J]. Trends pharmacol Sci, 1991, 12(9):343～9.
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8，Herdegen T, Sandkuhler J, Gass P et al. Jun, Fos, kRox, and CREB transcription factor proteins in the rat coxtex: basal expression and induction by spreading depression and epileptic seizures[J]. J comp Neurol, 1993, 333(2):271～88.
9，Siesjo BK. Basic mechanisms of traumatic brain damage[J]. Annal Emerg Med, 1993, 22(6):959～69.
10，Kiessling M, Slamm G, Xie Y et al. Differential transcription and translation of immediate early genes in the gerbil hippocampus after transient global ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13(6):914～24.
收稿日期：1999-03-31, 百拇医药
单位：王清华(第一军医大学 珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学 珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；钟世镇(解剖学研究所，广东 广州 510515 )
关键词：脑损伤；fos基因；jun基因；myc基因
第一军医大学学报000203 摘要：目的 观察大鼠脑损伤后不同时间皮质神经细胞早期快反应基因c-fos 、c-jun和c-myc表达变化。方法 应用Northern杂交、原位杂交和免疫组织化学方法检测皮质神经细胞中c-fos、c-jun和c-myc的表达。结果 脑损伤后15 min，伤侧皮质神经细胞出现上述3种基因mRNA的表达，随时间的延长，表达逐渐增加，于伤后3 h达高峰并持续至伤后24 h，伤后72 h恢复至对照水平。c-fos和c-jun蛋白表达亦于伤后15 min出现，c-myc蛋白表达于伤后30 min出现，并均于伤后3 h达高峰，持续至伤后6 h，伤后24 h表达消失。结论 脑损伤后上述3种基因表达特点与其它脑损害不同，可能与损伤机制和继发性神经细胞损害有关。
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中图分类号：R394.2; R651.15 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0120-04
Expression of c-fos, c-jun and c-myc gene in cerebral cortical neurons following brain trauma in rats
WANG Qing-hua，XU Ru-xiang
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, First Millatary Medical University, Guangzhou 510282, China)
ZHONG Shi-zhen
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(Institute of Anatomy, First Military Medical University, Gangzhou 510515, China)Abstract: Objective To observe the expression of c-fos, c-jun and c-myc genes in cerebral cortical neurons following brain trauma in rats. Methods The expression of c-fos, c-jun and c-myc was detected by using Northern and in situ hybridization and immunocytochemistry. Results The expression of the mRNA of c-fos, c-jun and c-myc genes was observed in neurons 15 min following the injury in the ipsilateral cerebral cortex, which increased gradually and reached their peak at h 6, lasting till h 24 and failed to be detected at h 72. c-fos and c-jun proteins expression were present 15 min after injury and c-myc protein after 30 min, peaking at h 3 and lasting till h 6, and resumed normal level at h 24. Conclusions The expression characteristic of c-fos, c-jun and c-myc gene differs from that in other brain injures, which may be related to different injury mechanism and secondary neuronal damage.
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Key words: brain trauma; fos genes; c-jun genes; c-myc genes
近年越来越多的研究结果表明，癫癎和脑缺血后早期快反应基因 c-fos有不同程度表达，并与继发性病理过程如神经细胞凋亡有关[1、2]。脑损伤后多个早期快反应基因表达的研究尚鲜见报道。本文同时观察了3种早期快反应基因c-fos 、c-jun和c-myc mRNA和蛋白在大鼠脑损伤后的表达水平变化和时相特点，旨在深入探讨早期快反应基因在脑继发性病理过程中的作用。
1 材料与方法
1.1主要试剂及来源
重组人c-fos 、c-jun和c-myc 质粒由军事医学科学院三所八室提供；DEPC、异硫氰酸胍、鲑鱼精子DNA、酵母tRNA购自Sigma公司；蛋白酶K、地高辛标记与检测试剂盒购自Boehringer-Mannheim公司；羊抗c-fos抗体、抗羊ABC试剂盒购自Cambridge Research Chemicals公司；鼠抗c-jun、c-myc抗体和抗鼠SP试剂盒购自Maxim公司。
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1.2实验动物与分组
雄性SD大鼠72只，随机分为正常对照、假手术及脑损伤组。脑损伤组又分为伤后15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h共12组，每组6只。实验前后动物自由饮食、进水。
1.3脑损伤模型
采用自由落体硬膜外脑损伤的方法[3]。实验动物用10%水合氯醛0.35 g/kg.b.w.腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，在左顶骨开窗，硬膜保持完整，用20 g砝码于30 cm高处坠落，制成局灶性脑挫伤，致伤冲击力为600 g.cm。骨窗用锌汀粉封闭。正常对照组不作任何处理，假手术组仅切开头皮和颅骨钻孔而不致脑损伤，术后6 h处死。
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1.4 Northern杂交
伤侧脑皮质总RNA提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法[4]。采用甲醛琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，应用真空印迹法将凝胶上的RNA转移至尼龙膜上，80℃、2 h烘干备用。Northern杂交采用同位素标记的c-fos、c-jun和c-myc DNA探针。杂交液成分：5×SSC，5×Denhardt's液，50%去离子甲酰胺，2%SDS，20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.1%乙桂酰肌酐酸钠，500 mg/L变性鲑鱼精子DNA，50 mg/L酵母tRNA，10%硫酸葡聚糖。10μg/L变性同位素标记c-fos或c-jun或c-myc，42℃水浴杂交24 h。经杂交后漂洗，膜置暗盒内–20℃曝光72 h，Kadark自动洗片机洗片。
1.4 原位杂交
用4%多聚甲醛经升主动脉行灌注固定，取脑组织浸入 4%多聚甲醛内4℃后固定48 h，用振动切片机行40 μm连续冠状切片。切片用0.1 mol/L PBS(pH7.4，DEPC水配制)洗3次，2 mg/L蛋白酶K消化30 min。原位杂交按地高辛标记与检测试剂盒说明书进行。按50μl/切片加入杂交液，42℃杂交24 h。杂交液成分：5×SSC，50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2% SDS，0.1 mol/L二硫苏糖醇，200 mg/L变性鲑鱼精子DNA，50 mg/L酵母tNRA，0.5 mg/L变性的地高辛标记c-fos、c-jun或c-myc DNA探针。经杂交后漂洗，按50μl/切片加入1:1 000抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物，室温过夜。缓冲液1(0.1 mol/L Tris.Cl，pH7.5，0.15 mol/L NaCl)和缓冲液3(0.1 mol/L Tris.Cl，pH9.5，0.15 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2)室温各洗2次，NBT/BCIP 4℃显色过夜。TE终止反应，裱片、伊红复染、脱水、透明、中性树胶封片。
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Northern杂交和原位杂交均设阳性对照和阴性对照实验。阳性对照：单独使用同位素标记或地高辛标记β-actin探针，结果为阳性。阴性对照：杂交前使用100 mg/L的RNA酶37℃孵育30 min或杂交液内不加标记的DNA探针，结果为阴性。
1.5 免疫组织化学
40μm冠状切片用0.01 mol/L PBS (pH7.4) 洗3次，入0.3% H2O2水溶液，室温，30 min。入1:2 000羊抗c-fos抗体或即用型鼠抗c-jun或c-myc抗体，4℃放置48 h。再入1:200生物素化抗羊IgG或抗鼠IgG，室温2 h。再入1:100链亲和素-HRP复合物，室温1 h。DAB显色，裱片、脱水、透明、封片。
免疫组织化学法设阴性对照实验：应用0.01 mol/L PBS(pH7.5)代替羊抗c-fos或鼠抗c-jun或c-myc抗体，结果显示均为阴性。
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2 结果
Northern杂交显示正常对照和假手术组大鼠脑皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA无明显表达。伤后15 min伤侧皮质出现c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达，并随着时间的延长，表达逐渐增加，3种基因mRNA表达均于伤后3 h达高峰，持续至伤后24 h，以后表达逐渐下降，伤后48 h仍有轻度表达，至伤后72 h恢复正常(图1)。
原位杂交发现伤侧脑皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达规律与Northern杂交相同，两种基因mRNA表达以损伤周围最为明显，损伤区边缘仍有明显表达(图 2～4)。
免疫组织化学发现正常对照和假手术组大鼠脑皮质无明显c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达。伤侧脑皮质c-fos和c-jun蛋白表达于伤后15 min即已出现，c-myc蛋白表达于伤后30 min出现，随伤后时间的延长，3种基因蛋白表达逐渐增加，均于伤后3 h达高峰，持续至伤后6 h，以后表达逐渐减弱，至伤后24 h表达消失。c-fos和c-jun蛋白表达以远离损伤区为明显，损伤区边缘及其周围基本无表达，而c-myc蛋白则在损伤区边缘仍有明显表达(图5～7)。
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图1 Northern 杂交结果 ×125
Fig.1 Result of Northern hybridization ×125
Lane 1 to lane 4 corresponds respectively to the c-fos mRNA expression 15 min, 30 min, 1 h and 6 h after the injury, which shows a gradual increase.
图2～4 伤后6 h 损伤周围脑皮质神经细胞c-fos (Fig.2) c-jun (Fig.3)和c-myc (Fig.4) mRNA 表达明显 碱性磷酸酶染色′ 125
Fig.2–4 mRNA expression of c-fos (Fig.2) , c-jun (Fig.3) , c-myc (Fig.4) genes is obvious in the neurons of the cerebral cortex around the lesion 6
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h after injury AP staining ′ 125
图5～7 伤后6 h 脑皮质细胞c-fos(Fig.5) c-jun(Fig.6)和c-myc(Fig.7)蛋白表达以远离损伤区为明显 辣根过氧化物酶染色′ 125
Fig. 5–7 Protein expression by c-fos (Fig.5) , c-jun (Fig.6) , c-myc (Fig.7) genes is obvious in the neurons of the cerebral cortex distant from the
lesion 6 h after injury HRP staining ′ 125
3 讨论
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早期快反应基因c-fos、c-jun和c-myc普遍存在于中枢神经细胞，正常情况下表达水平很低，难于检测。在受到各种外界刺激后，神经细胞早期快反应基因出现快速表达，通过它们的表达蛋白传递和整合信息，作用于目的基因，改变其转录水平，发挥细胞核内第三信使的作用，参与神经细胞的生长、分化和损伤修复的调节[5、6]。研究脑损伤时早期快反应基因表达的意义在于明确它们对继发性病理损害过程发生与发展的影响，尤其是在神经细胞损伤机理与抗损伤修复机制中的作用。
中枢神经系统在受到伤害性刺激时，早期快反应基因c-fos、c-jun出现异常表达。药物诱发癫癎时，脑不同部位出现c-fos、c-jun mRNA及其蛋白表达。c-fos、c-jun mRNA于用药后15 min开始表达，1 h达高峰，16 h后恢复至正常水平。c-fos蛋白30 min后开始表达，2～4 h时处于高峰期，8 h后降至正常。c-jun蛋白表达时间晚于c-fos蛋白，于4 h达高峰，24 h后恢复正常[7、8]。局部脑缺血后30 min，除坏死区域以外的整个同侧大脑皮质出现c-fos mRNA表达并持续至缺血后90 min，缺血后1 h皮质c-fos蛋白开始表达，持续至缺血后8 h[9]。
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目前尚无脑损伤后不同时间早期快反应基因c-fos、c-jun和c-myc mRNA和蛋白表达变化的系统研究。本实验发现大鼠脑损伤后15 min，伤侧皮质出现c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达，并随时间的延长，表达水平逐渐升高，至伤后3 h达高峰，持续至伤后24 h，以后表达逐渐降低，至伤后72 h 恢复正常。表达以损伤周围最为明显。损伤后皮质c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达的时序性及时程与癫癎和脑缺血时不同，可能与损伤机制有关。其表达时相应部位分布特点与具体神经细胞水肿和损害的表达规律相吻合[9]，提示上述3种早期快反应基因表达可能与脑继发性病理过程有关。脑损伤后皮质c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达于伤后15～30 min出现，伤后3～6 h达高峰。c-fos和c-jun蛋白表达以损伤区及其周围以外的区域最明显，表明c-fos和c-jun蛋白表达的意义与mRNA表达不同。Dragunow等[2]在脑缺血的实验中观察到，脑缺血梗塞区坏死细胞未见c-fos和c-jun蛋白表达，而梗塞区以外的区域出现神经细胞凋亡，调亡神经细胞出现c-fos和c-jun蛋白的过度表达。脑损伤边缘区及其周围c-fos、c-jun mRNA表达增加而蛋白表达消失，可能表示损伤区及其周围神经细胞向不可逆损害或坏死发展。在上述区域之外的c-fos和c-jun蛋白表达的意义，可能与神经细胞凋亡有关，也可能与部分神经细胞轴突突起再生有关，后者多见于癫癎[7]。正常情况下，c-myc基因主要参与细胞周期的调控，与细胞的生长、分化有关。脑损伤后c-myc基因表达，尤其是损伤周围c-myc mRNA和蛋白表达同时增加，推测与局部神经细胞轴突反应和反应性胶质细胞增生有关。
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脑损伤后早期快反应基因表达的机制尚未完全阐明。目前认为谷氨酸受体被激活和钙离子内流是引起早期快反应基因表达的两个主要因素[10]。脑损伤时早期谷氨酸释放增加，NMDA受体的激活介导脑损害时早期快反应基因表达。研究发现脑损伤后谷氨酸大量释放、NMDA受体过度激活及钙超载是引起神经细胞水肿和死亡的关键因素[9]，深入探讨脑损伤后早期快反应基因表达调控机制有助于阐明继发性脑损害的分子机制。
资金项目：军队九五杰出中青年人才基金资助项目(96-M-83)
作者简介：王清华(1965-)，男，云南丽江人，1987年毕业于大理医学院，博士，主治医师，电话：85143622
参考文献
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收稿日期：1999-03-31, 百拇医药