小鼠自然杀伤细胞杀瘤分泌途径的探讨
作者：覃汉军 江中喜
单位：覃汉军(广东医学院微生物学和免疫学教研室，湛江 524023)；江中喜(广州医 学院附属二院，广州 510182)
关键词：NK细胞；分泌途径；GHC-3；小鼠
广东医学院学报000208 摘要 目的：探讨小鼠脾自然杀伤(NK)细胞杀伤肿 瘤细胞的分泌途径。方 法：用 MTT法测定小鼠脾 NK细胞不同时间杀伤靶细胞的效应及其培养上 清液和多聚甲醛固封后的杀伤作用。结果：在 2 h内，NK 细胞及其培养上 清液对肿瘤细胞杀伤率分别为 25%和 7%。而经 1% 多聚甲醛固封后的 NK 细胞杀伤率为 11%。 结论：小鼠脾 NK细胞能通过分泌细胞因子如 α 肿瘤坏死因子 (TNFα) 杀伤肿瘤细胞。
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0138-02
, http://www.100md.com
NK 细胞是机体免疫监视的一重要免疫效应细胞，能杀伤多种肿瘤细胞，其杀伤 肿瘤细胞表现无需预先致敏、非抗体和补体依赖，非主要组织相容性复合体Ⅰ 类分子限制性和非特异性等特点。当前所知，参与杀伤的物质多样，作用环节比较 复杂，机制尚未完全明了。本实验通过 MTT法测定小鼠脾 NK细胞杀瘤效应，从而探 讨 NK细胞杀瘤效应途径及作用物，为肿瘤免疫理论和应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 正常 ICR小鼠
雄性，体重(20±2)g(广州医学院动物中心提供)；GHC-3、L929 细胞(广州医学院肿瘤所提供)。
1.2 脾 NK细胞不同时间杀伤靶细胞测定
脾细胞按50∶1与GHC-3靶细胞置于 96孔板中，各组均作三复孔，并设 对照。37℃、5%CO2饱和温度孵育 2 h 后加入 MTT(5 mg/mL) 10 μL，继续孵育 4 h，弃上清后加二甲基亚砜 100 μL，振荡溶解，酶联 仪 570 nm 测OD值，按以上公式计算：杀伤率＝[1-(实验孔平均 O D值-效应孔平均 OD值)/靶细胞孔平均值]×100%。
, 百拇医药
1.3 脾NK细胞培养上清液杀伤活性测定
设脾细胞杀伤靶细胞及单纯细胞对照组，各组均作三复孔在 37℃和 5%CO2 饱和温度孵育2 h，上清液加入空白 96孔板中，然后再加入 GHC-3细 胞，并设各种对照，加 MTT，酶联仪测定 OD值。按以下公式：杀伤率＝[ (靶对照平均OD值-实验孔平均OD值)/靶对照平均OD值]×100%。
1.4 脾NK细胞固封试验[1]
5×106/mL脾细胞悬液经 1%多聚甲醛作用 15 min，离心，Ha nks 洗涤即得处理后的效应细胞。与 1×105/mL对数生长期靶细胞 同上 1.2法行杀伤靶细胞试验， 2 h 后加MTT测定。留上清液再测其杀 伤率。
2 结果
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2.1 脾NK细胞不同时间杀伤靶细胞活性
脾NK细胞与GHC-3细胞作用 0.5 h后开始可测到有杀伤活性。0.5 h，脾NK细胞对GHC-3的杀伤率为5%，1h杀伤率为 19%而 2 h杀 伤率为 25%。在 2 h内，效应细胞对靶细胞的杀伤率与时间呈线性递增关系， 而χ2检验结果表明三个时间段所测得杀伤率不相等，存在时间差异性(见表1)。
表1 不同时间小鼠脾NK细胞对GHC-3的 杀伤作用 作用时间
n
杀伤例数
非杀伤例数
杀伤率%
0.5 h
, 百拇医药
100
5
95
5
1 h
10 0
19
81
19
2 h
100
25
75
25
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χ2＝15.43，P<0.005
2.2 脾NK细胞培养上清液的杀伤活性
用MTT 法测得脾细胞杀伤靶细胞和单纯脾细胞培养上清液对 GHC-3的 2 h杀伤率分别为 12%、7%。
2.3 脾NK细胞固封后的杀伤活性
经 1%多聚甲醛固封脾 NK细胞后，此 NK细胞对 GHC-3的杀伤率为 11%，非固封组对照组为 25%。而固封 NK细胞的培养上清对 L92 9没有测到杀伤力，非固封组对照的杀伤率为 6%。
3 讨论
NK细胞是机体重要的淋巴细胞亚群之一，具有广谱杀瘤作用。有研究报道，NK 细胞通过表面受体识别靶细胞上相应配体并与靶细胞结合，进而释放穿孔素、颗 粒酶等物质杀伤靶细胞，这是 NK细胞介导杀伤肿瘤细胞的一个重要途径[2]。 本文不同时间效靶作用实验结果显示，杀伤率与时间似存在线性递增关系。NK 细胞对 GHC-3细胞的杀伤作用 0.5 h便可见到，2 h 杀伤率为 25 %；脾细胞培养上清液 2h对GHC-3和L929有一定的杀伤作用，提示了 脾 NK细胞除了通过穿孔素或颗粒酶途径诱导靶细胞破坏外，还可通过分泌细胞 因子 TNF。杀伤靶细胞[3]。至于肿瘤细胞作用 2 h之上清液杀伤率尤高 ， 可能是因为 NK细胞受刺激不但分泌更多量 TNF[3]，而且也释放穿孔素、 颗粒酶等，几种活性物质共同作用，提高了杀伤率。
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本实验结果还显示，NK细胞经多聚甲醛固定后，可以完全封闭细胞因子的分泌和 穿孔素、颗粒酶的释放，这与 Nikolal等[4]的研究结果相一致。用多 聚甲醛固定后的NK 细胞进行杀伤试验，结果比正常杀伤率下降 56%，这与 Sung等[5]的研究结果相似，而其上清液已无杀伤力，这更进一步证实了 NK细胞可通过分泌途径杀伤肿瘤细胞。
作者简介：覃汉军，男，1967年11月出生，医学硕士，助教
参考文献
[1] Kartjones EA.Relationship of m acrophage of Ia and membrane Ⅱ-1 expre ssion to antigen presentation.J Immu nol，1985，135：3652
[2]Nakajinma H，Park H，Henkart PA.Synergistic role of granzyme A and B in mediating target cell death by RBL mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin.J Exp Med，1995，181：1037
, 百拇医药
[3] Nakada Y，Tsukatani Y，Kosaka T，et al.Relationship between radical pro duction and natural killer cytotoxic factor(NKCF) in canine natural kill er(NK) cell-mediated cytotoxicity.Ve t Immunol Immunopathol，1997 55(4)：27 3～282
[4] Vujanovic NL，Nagashima，S，Herberm an RB，et al.Nonsecretory apoptotic k illing by humn NK cell.J Immunol，1996，1 57：1117～1126
[5] Sung MW，Nagashima S，Johnson JJ，e t al.The role of apoptosis in antibo dy in antibody-dependend cell-mediat ed cytotoxicity against monolayers o f human squamous cell carcinoma of t he head and neck targets.Cell Immuno l，1996，171：20～29
收稿日期：1999-09-20；修订日期：1999-12-26, 百拇医药
单位：覃汉军(广东医学院微生物学和免疫学教研室，湛江 524023)；江中喜(广州医 学院附属二院，广州 510182)
关键词：NK细胞；分泌途径；GHC-3；小鼠
广东医学院学报000208 摘要 目的：探讨小鼠脾自然杀伤(NK)细胞杀伤肿 瘤细胞的分泌途径。方 法：用 MTT法测定小鼠脾 NK细胞不同时间杀伤靶细胞的效应及其培养上 清液和多聚甲醛固封后的杀伤作用。结果：在 2 h内，NK 细胞及其培养上 清液对肿瘤细胞杀伤率分别为 25%和 7%。而经 1% 多聚甲醛固封后的 NK 细胞杀伤率为 11%。 结论：小鼠脾 NK细胞能通过分泌细胞因子如 α 肿瘤坏死因子 (TNFα) 杀伤肿瘤细胞。
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0138-02
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NK 细胞是机体免疫监视的一重要免疫效应细胞，能杀伤多种肿瘤细胞，其杀伤 肿瘤细胞表现无需预先致敏、非抗体和补体依赖，非主要组织相容性复合体Ⅰ 类分子限制性和非特异性等特点。当前所知，参与杀伤的物质多样，作用环节比较 复杂，机制尚未完全明了。本实验通过 MTT法测定小鼠脾 NK细胞杀瘤效应，从而探 讨 NK细胞杀瘤效应途径及作用物，为肿瘤免疫理论和应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 正常 ICR小鼠
雄性，体重(20±2)g(广州医学院动物中心提供)；GHC-3、L929 细胞(广州医学院肿瘤所提供)。
1.2 脾 NK细胞不同时间杀伤靶细胞测定
脾细胞按50∶1与GHC-3靶细胞置于 96孔板中，各组均作三复孔，并设 对照。37℃、5%CO2饱和温度孵育 2 h 后加入 MTT(5 mg/mL) 10 μL，继续孵育 4 h，弃上清后加二甲基亚砜 100 μL，振荡溶解，酶联 仪 570 nm 测OD值，按以上公式计算：杀伤率＝[1-(实验孔平均 O D值-效应孔平均 OD值)/靶细胞孔平均值]×100%。
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1.3 脾NK细胞培养上清液杀伤活性测定
设脾细胞杀伤靶细胞及单纯细胞对照组，各组均作三复孔在 37℃和 5%CO2 饱和温度孵育2 h，上清液加入空白 96孔板中，然后再加入 GHC-3细 胞，并设各种对照，加 MTT，酶联仪测定 OD值。按以下公式：杀伤率＝[ (靶对照平均OD值-实验孔平均OD值)/靶对照平均OD值]×100%。
1.4 脾NK细胞固封试验[1]
5×106/mL脾细胞悬液经 1%多聚甲醛作用 15 min，离心，Ha nks 洗涤即得处理后的效应细胞。与 1×105/mL对数生长期靶细胞 同上 1.2法行杀伤靶细胞试验， 2 h 后加MTT测定。留上清液再测其杀 伤率。
2 结果
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2.1 脾NK细胞不同时间杀伤靶细胞活性
脾NK细胞与GHC-3细胞作用 0.5 h后开始可测到有杀伤活性。0.5 h，脾NK细胞对GHC-3的杀伤率为5%，1h杀伤率为 19%而 2 h杀 伤率为 25%。在 2 h内，效应细胞对靶细胞的杀伤率与时间呈线性递增关系， 而χ2检验结果表明三个时间段所测得杀伤率不相等，存在时间差异性(见表1)。
表1 不同时间小鼠脾NK细胞对GHC-3的 杀伤作用 作用时间
n
杀伤例数
非杀伤例数
杀伤率%
0.5 h
, 百拇医药
100
5
95
5
1 h
10 0
19
81
19
2 h
100
25
75
25
, http://www.100md.com
χ2＝15.43，P<0.005
2.2 脾NK细胞培养上清液的杀伤活性
用MTT 法测得脾细胞杀伤靶细胞和单纯脾细胞培养上清液对 GHC-3的 2 h杀伤率分别为 12%、7%。
2.3 脾NK细胞固封后的杀伤活性
经 1%多聚甲醛固封脾 NK细胞后，此 NK细胞对 GHC-3的杀伤率为 11%，非固封组对照组为 25%。而固封 NK细胞的培养上清对 L92 9没有测到杀伤力，非固封组对照的杀伤率为 6%。
3 讨论
NK细胞是机体重要的淋巴细胞亚群之一，具有广谱杀瘤作用。有研究报道，NK 细胞通过表面受体识别靶细胞上相应配体并与靶细胞结合，进而释放穿孔素、颗 粒酶等物质杀伤靶细胞，这是 NK细胞介导杀伤肿瘤细胞的一个重要途径[2]。 本文不同时间效靶作用实验结果显示，杀伤率与时间似存在线性递增关系。NK 细胞对 GHC-3细胞的杀伤作用 0.5 h便可见到，2 h 杀伤率为 25 %；脾细胞培养上清液 2h对GHC-3和L929有一定的杀伤作用，提示了 脾 NK细胞除了通过穿孔素或颗粒酶途径诱导靶细胞破坏外，还可通过分泌细胞 因子 TNF。杀伤靶细胞[3]。至于肿瘤细胞作用 2 h之上清液杀伤率尤高 ， 可能是因为 NK细胞受刺激不但分泌更多量 TNF[3]，而且也释放穿孔素、 颗粒酶等，几种活性物质共同作用，提高了杀伤率。
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本实验结果还显示，NK细胞经多聚甲醛固定后，可以完全封闭细胞因子的分泌和 穿孔素、颗粒酶的释放，这与 Nikolal等[4]的研究结果相一致。用多 聚甲醛固定后的NK 细胞进行杀伤试验，结果比正常杀伤率下降 56%，这与 Sung等[5]的研究结果相似，而其上清液已无杀伤力，这更进一步证实了 NK细胞可通过分泌途径杀伤肿瘤细胞。
作者简介：覃汉军，男，1967年11月出生，医学硕士，助教
参考文献
[1] Kartjones EA.Relationship of m acrophage of Ia and membrane Ⅱ-1 expre ssion to antigen presentation.J Immu nol，1985，135：3652
[2]Nakajinma H，Park H，Henkart PA.Synergistic role of granzyme A and B in mediating target cell death by RBL mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin.J Exp Med，1995，181：1037
, 百拇医药
[3] Nakada Y，Tsukatani Y，Kosaka T，et al.Relationship between radical pro duction and natural killer cytotoxic factor(NKCF) in canine natural kill er(NK) cell-mediated cytotoxicity.Ve t Immunol Immunopathol，1997 55(4)：27 3～282
[4] Vujanovic NL，Nagashima，S，Herberm an RB，et al.Nonsecretory apoptotic k illing by humn NK cell.J Immunol，1996，1 57：1117～1126
[5] Sung MW，Nagashima S，Johnson JJ，e t al.The role of apoptosis in antibo dy in antibody-dependend cell-mediat ed cytotoxicity against monolayers o f human squamous cell carcinoma of t he head and neck targets.Cell Immuno l，1996，171：20～29
收稿日期：1999-09-20；修订日期：1999-12-26, 百拇医药