粤西籍人群Fv Leiden基因突变的初步调查
作者：李凤芹 杨志刚 刘国勋 凌光鑫 蔡望伟 谢朝阳 杨勤
单位：李凤芹(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；杨志刚(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；刘国勋(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；凌光鑫(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；蔡望伟(海南医学院 生化教研室)；谢朝阳(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)
关键词：基因；突变；因子 V
广东医学院学报000202 摘要 目的：了解 Fv Leiden (因子 V Leiden)基因突变 在广东籍正常人群中发生的情况。方法：用两种引物多聚酶链反应 方法检测 130例广东雷州籍正常人和3例静脉血栓患者 Fv Leiden 基因突变情况。 结果：所有的样本均未检出 Fv Leiden突变。结论：粤西籍正常人中尚未发现Fv Leide n 突变。
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【中图分类号】 Q 347 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0122-02
Detection of Fv Leiden mutation in w estern Guangdong population
Li Fengqin，Yang Zhigang Liu Guoxun，et al
(Research Lab of Blood Diseases，Affi liated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，524001)
Abstract Objective：To detect the Factor V Leiden (Fv Leiden) mutation in healthy individuals from western Gua ngdong population.Methods：Fv Lei den mutation was analysed by polymerase chain reaction using two kinds of pr imers in 130 samples of healthy people. Results：No Fv Leiden mutation wa s found in all samples.Conclusion：It is showed that Fv Leiden mutation was not found in western Guangdong population yet.
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Key words：Genes；Mutation；Factor V
近年来，研究发现 V因子 Arg506→Gln 突变( Fv 1691 碱基 G→A，命名 Fv Leiden)导致 Va 因子不能被活化的蛋白C(A ctivated Protein C，APC)所灭活，使有此突变的纯合子 或杂合子易罹患静脉血栓。凝血因子V 基因突变引起的活化蛋白 C抵抗(AP C Resistance，APCR)在血栓性疾病中的作用已引起医学界的极 大关注。国外报道，临床出现静脉血栓的患者超过半数是由此缺陷引起的[1，2] 。本文用两种不同的引物设计对 130名广东省雷州籍正常人及 3例静脉血栓患 者进行了 Fv Leiden 基因突变的检测；130 名正常人中有 57 例献血员及上述 3例静脉血栓患者还进行了 APC-APTT (活化部分凝 血活酶时间)试验，结果报道如下。
1 材料与方法
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1.1研究对象
广东省雷州籍正常人 130例(男 69例，女 51例，17～41岁，平均 25.2岁)和3例静脉血栓患者均为男性，年龄 47～52岁，平均 50岁。
1.2 DNA分析方法
1.2.1 染色体 DNA 提取 将抗凝血按照低渗溶解红细胞方法提取基因 组 DNA。
1.2.2 多聚酶链反应(PCR)及限制性内切酶分析 (1) PCR扩增 所用 两条引物[2]为上游引物 5′TGCCCAGTGC TTAACAA GAC CA 3′；下游引物 5′ ATGATGTTTGATTCATAA AACT 3′。PCR反应体系：总体积为 25 μL，其中含待测 DNA 5 μL，2 mmol/L dNTP 2.5 μL，Taq聚合酶0.6 U，25 mmol/L MgC l2 5.0 μL，10×buffer 2.5 μL， 上游引物0.5 μ mol/L0.5 μL，下游引物0.5 μ mol/L 0.5 μL，加水补足为25 μL。94℃变性1 min，55℃复性50 s，72℃延 伸 1 min，共 31个循环。(2) 酶切消化扩增产物 取 PCR产物 15 μL，加限制性内切酶 Mnl I(MBI 产品)5 U 及相应酶切缓冲 液 37℃水浴过夜。 (3) 电泳分析酶切产物 取 10 μL 酶切产物上 样，在 3%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外线灯下观察酶切结果并照相。 (4) 确定基因型 根据限制性片段长度多态性 (RFLP) 电泳图谱，确定基因 型。Fv Leiden 突变的纯合子，杂合子由英国伦敦皇家医院 Kins VJ博士惠赠。
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1.2.3 序列特异性引物 PCR(PCR-SSP)分析Fv Leid en PCR 用以扩增正常或突变等位基因的序列特异性引物如下：根据文献[ 3]合成下游引物。为增加其特异性，在3′。末端突变点前增加了一个不配对碱基， 将原来的 T改为A 。 下游正常引物 5′GGACAAAATACCTGTATTCCAC 3′(5 06G)； 下游异常引物5′ GGACAAAATACCTGTATTCCAT 3′ ( 506A)； 上游引物 PR-6967 (1581→1602) 根据文献[2]合成： 5′ TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3′。 反应体系为 25 μL。上游引物 6967 1.0 μ mol/L0.2 μL， 下游引物 506 G或 506 A 1.0 μ mol/L0.2 μL.，余所加 反应物同前。每标本做两管，一管加 506 G，而另一管加 506 A。 PC R反应程序同前。吸扩增后产物 10 μL。2%琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，紫 外线灯下直接观察结果。
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2 结果
粤西籍正常人中尚未发现 Fv Leiden 突变。
3 讨论
PCR-RFLP 方法中，PCR 扩增产物为一267 bp的片段。对于没 有 Fv Leiden 突变的个体该片段存在 2 个Mnl I 酶切位点， 可将该扩增产物切成 3个片段：163 bp，67 bp，37 bp。如果发生了 Fv Leiden突变，则其中一个 Mnl I酶切位点消失，扩增产物被酶 切成 2个片段： 200 bp，67 bp。因此，野生型酶切后为 163 bp， 67 bp，37 bp；突变纯合子酶切后为 200 bp，67 bp；杂合子酶切 后为 200 bp，163 bp，67 bp，37 bp (见图1)。由于 37 bp 片段分子量较小，琼脂糖电泳中难以显示清楚。
PCR-SSP 方法中 PCR扩增产物为一112 bp的片段。如加引物 506 G有区带出现而用异常引物 506 A 无区带出现时，为正常基因；如加 引物 506 G无区带出现而用异常引物 506 A有区带出现时，为有突变基 因纯合子；如加引物 506 G和 506 A 均有区带出现时，为杂合子(见图 2)。
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M：PUC Mix Marker；1：PCR 扩 增 产物；2： 已知杂合子； 3：已知纯合子； 4： 野生型 M： PUC Mix Marker；1，2：已知纯合子； 3，4：已知杂合子；5，6：野生型Fv 是重要的凝血因子，在内源性凝血途径中起到关键作用。Fv 基因第 1 691位核苷酸发生点突变(G→A，Fv Leiden)，致 APC 裂解 Fv。位点消失，使灭活 Fv。，发生障碍。 Fv Leiden突变者发 生血栓的危险性要比正常人群高出5～10倍。这种突变已为欧洲白种人患遗传性 血栓症最常见的原因之一。文献已报道在欧洲正常人中 Fv Leiden 突变 的发生率为2%～5%[1]，瑞典、希腊分别可高达 7%和 15%[4] 。但 Fv Leiden 有明显的种族差异。据报道在亚洲的印度西北部及沙特 阿拉伯分别仅为1.2% 及0.98%。而非洲、美国印地安人、澳大利亚土著 人以及日本、我国的香港、台湾以及大陆的许多学者在他们的研究报告中并未发现 Fv Leiden 改变[4-6]。最近罗佳滨等报道 102名正常中国人 中发现 2例 Fv Leiden 突变杂合子[7]。吴竟生等报道在 28名 正常人中发现 1例 Fv Leiden 突变杂合子[8]。本文对 130 名正常粤西籍人及 3例静脉血栓患者进行检测并未发现 Fv Leiden 突变。我们推测 Fv Leiden 突变不仅存在种族上的差异，而且也可 能存在着地区上的差异， Fv Leiden 突变在我国至少在粤西地区不是 一种常见的遗传缺陷。
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图1 PCR 扩增产物及 Mnl I 酶切结果
图2 PCR-SSP扩增产物
基金项目：1996年广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”项目
作者简介：李凤芹，女，1969年10月出生，学士，主治医师
作者单位：杨勤(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)
参考文献
[1] Dahlback B.Inherited thrombop hilia：resistance to activated protein C as a pathogenic factor of venous thromboembolism.Blood，1995，85：607
, 百拇医药
[2]Bertina RM，Koeleman BPC，Koster T，et al.Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C.Nature，1994，36 9：64
[3] Bellissmo DB.Improved method for factor V Leiden typing by PCR-SSP. Throm Haemost，1996，75(3)：520
[4] Rees DC，Cox M，Clegg JB.World dis tribution of factor V Leiden .Lancet， 1995，346：1133
[5] Chan LC，Bourke C，Lam CK，et al.La ck of activated Protein C resistance in healthy Hong Kong Chinese blood donors-correlation with absence of A rg506 Gln mutation of Factor V g ene.Thromb Haemost，1996，75：522
, 百拇医药
[6] pepe G，Rickards O，Vanegas OC，et al.Prevalence of factor V Leiden mut ation in non-European population.Thr omb Haemost，1997，77：329
[7] 罗佳滨，关月，马洪星，等. 凝血因子 V 基因点突变 1691A 在不同种族人群中的分布.中华遗传学杂志，1996，13：219
[8] 吴竟生，顾建明，Morrissy JH，等.一例 Fv Leid en 基因突变所致抗活化的蛋白 C 现象. 中华血液学杂志，1997，1 8：453
收稿日期：1999-11-25；修订日期：2000-02-22, 百拇医药
单位：李凤芹(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；杨志刚(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；刘国勋(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；凌光鑫(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)；蔡望伟(海南医学院 生化教研室)；谢朝阳(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)
关键词：基因；突变；因子 V
广东医学院学报000202 摘要 目的：了解 Fv Leiden (因子 V Leiden)基因突变 在广东籍正常人群中发生的情况。方法：用两种引物多聚酶链反应 方法检测 130例广东雷州籍正常人和3例静脉血栓患者 Fv Leiden 基因突变情况。 结果：所有的样本均未检出 Fv Leiden突变。结论：粤西籍正常人中尚未发现Fv Leide n 突变。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q 347 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0122-02
Detection of Fv Leiden mutation in w estern Guangdong population
Li Fengqin，Yang Zhigang Liu Guoxun，et al
(Research Lab of Blood Diseases，Affi liated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，524001)
Abstract Objective：To detect the Factor V Leiden (Fv Leiden) mutation in healthy individuals from western Gua ngdong population.Methods：Fv Lei den mutation was analysed by polymerase chain reaction using two kinds of pr imers in 130 samples of healthy people. Results：No Fv Leiden mutation wa s found in all samples.Conclusion：It is showed that Fv Leiden mutation was not found in western Guangdong population yet.
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Key words：Genes；Mutation；Factor V
近年来，研究发现 V因子 Arg506→Gln 突变( Fv 1691 碱基 G→A，命名 Fv Leiden)导致 Va 因子不能被活化的蛋白C(A ctivated Protein C，APC)所灭活，使有此突变的纯合子 或杂合子易罹患静脉血栓。凝血因子V 基因突变引起的活化蛋白 C抵抗(AP C Resistance，APCR)在血栓性疾病中的作用已引起医学界的极 大关注。国外报道，临床出现静脉血栓的患者超过半数是由此缺陷引起的[1，2] 。本文用两种不同的引物设计对 130名广东省雷州籍正常人及 3例静脉血栓患 者进行了 Fv Leiden 基因突变的检测；130 名正常人中有 57 例献血员及上述 3例静脉血栓患者还进行了 APC-APTT (活化部分凝 血活酶时间)试验，结果报道如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1研究对象
广东省雷州籍正常人 130例(男 69例，女 51例，17～41岁，平均 25.2岁)和3例静脉血栓患者均为男性，年龄 47～52岁，平均 50岁。
1.2 DNA分析方法
1.2.1 染色体 DNA 提取 将抗凝血按照低渗溶解红细胞方法提取基因 组 DNA。
1.2.2 多聚酶链反应(PCR)及限制性内切酶分析 (1) PCR扩增 所用 两条引物[2]为上游引物 5′TGCCCAGTGC TTAACAA GAC CA 3′；下游引物 5′ ATGATGTTTGATTCATAA AACT 3′。PCR反应体系：总体积为 25 μL，其中含待测 DNA 5 μL，2 mmol/L dNTP 2.5 μL，Taq聚合酶0.6 U，25 mmol/L MgC l2 5.0 μL，10×buffer 2.5 μL， 上游引物0.5 μ mol/L0.5 μL，下游引物0.5 μ mol/L 0.5 μL，加水补足为25 μL。94℃变性1 min，55℃复性50 s，72℃延 伸 1 min，共 31个循环。(2) 酶切消化扩增产物 取 PCR产物 15 μL，加限制性内切酶 Mnl I(MBI 产品)5 U 及相应酶切缓冲 液 37℃水浴过夜。 (3) 电泳分析酶切产物 取 10 μL 酶切产物上 样，在 3%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外线灯下观察酶切结果并照相。 (4) 确定基因型 根据限制性片段长度多态性 (RFLP) 电泳图谱，确定基因 型。Fv Leiden 突变的纯合子，杂合子由英国伦敦皇家医院 Kins VJ博士惠赠。
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1.2.3 序列特异性引物 PCR(PCR-SSP)分析Fv Leid en PCR 用以扩增正常或突变等位基因的序列特异性引物如下：根据文献[ 3]合成下游引物。为增加其特异性，在3′。末端突变点前增加了一个不配对碱基， 将原来的 T改为A 。 下游正常引物 5′GGACAAAATACCTGTATTCCAC 3′(5 06G)； 下游异常引物5′ GGACAAAATACCTGTATTCCAT 3′ ( 506A)； 上游引物 PR-6967 (1581→1602) 根据文献[2]合成： 5′ TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3′。 反应体系为 25 μL。上游引物 6967 1.0 μ mol/L0.2 μL， 下游引物 506 G或 506 A 1.0 μ mol/L0.2 μL.，余所加 反应物同前。每标本做两管，一管加 506 G，而另一管加 506 A。 PC R反应程序同前。吸扩增后产物 10 μL。2%琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，紫 外线灯下直接观察结果。
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2 结果
粤西籍正常人中尚未发现 Fv Leiden 突变。
3 讨论
PCR-RFLP 方法中，PCR 扩增产物为一267 bp的片段。对于没 有 Fv Leiden 突变的个体该片段存在 2 个Mnl I 酶切位点， 可将该扩增产物切成 3个片段：163 bp，67 bp，37 bp。如果发生了 Fv Leiden突变，则其中一个 Mnl I酶切位点消失，扩增产物被酶 切成 2个片段： 200 bp，67 bp。因此，野生型酶切后为 163 bp， 67 bp，37 bp；突变纯合子酶切后为 200 bp，67 bp；杂合子酶切 后为 200 bp，163 bp，67 bp，37 bp (见图1)。由于 37 bp 片段分子量较小，琼脂糖电泳中难以显示清楚。
PCR-SSP 方法中 PCR扩增产物为一112 bp的片段。如加引物 506 G有区带出现而用异常引物 506 A 无区带出现时，为正常基因；如加 引物 506 G无区带出现而用异常引物 506 A有区带出现时，为有突变基 因纯合子；如加引物 506 G和 506 A 均有区带出现时，为杂合子(见图 2)。
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M：PUC Mix Marker；1：PCR 扩 增 产物；2： 已知杂合子； 3：已知纯合子； 4： 野生型 M： PUC Mix Marker；1，2：已知纯合子； 3，4：已知杂合子；5，6：野生型Fv 是重要的凝血因子，在内源性凝血途径中起到关键作用。Fv 基因第 1 691位核苷酸发生点突变(G→A，Fv Leiden)，致 APC 裂解 Fv。位点消失，使灭活 Fv。，发生障碍。 Fv Leiden突变者发 生血栓的危险性要比正常人群高出5～10倍。这种突变已为欧洲白种人患遗传性 血栓症最常见的原因之一。文献已报道在欧洲正常人中 Fv Leiden 突变 的发生率为2%～5%[1]，瑞典、希腊分别可高达 7%和 15%[4] 。但 Fv Leiden 有明显的种族差异。据报道在亚洲的印度西北部及沙特 阿拉伯分别仅为1.2% 及0.98%。而非洲、美国印地安人、澳大利亚土著 人以及日本、我国的香港、台湾以及大陆的许多学者在他们的研究报告中并未发现 Fv Leiden 改变[4-6]。最近罗佳滨等报道 102名正常中国人 中发现 2例 Fv Leiden 突变杂合子[7]。吴竟生等报道在 28名 正常人中发现 1例 Fv Leiden 突变杂合子[8]。本文对 130 名正常粤西籍人及 3例静脉血栓患者进行检测并未发现 Fv Leiden 突变。我们推测 Fv Leiden 突变不仅存在种族上的差异，而且也可 能存在着地区上的差异， Fv Leiden 突变在我国至少在粤西地区不是 一种常见的遗传缺陷。
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图1 PCR 扩增产物及 Mnl I 酶切结果
图2 PCR-SSP扩增产物
基金项目：1996年广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”项目
作者简介：李凤芹，女，1969年10月出生，学士，主治医师
作者单位：杨勤(广东医学院附属医院血液研究室， 湛江 524001)
参考文献
[1] Dahlback B.Inherited thrombop hilia：resistance to activated protein C as a pathogenic factor of venous thromboembolism.Blood，1995，85：607
, 百拇医药
[2]Bertina RM，Koeleman BPC，Koster T，et al.Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C.Nature，1994，36 9：64
[3] Bellissmo DB.Improved method for factor V Leiden typing by PCR-SSP. Throm Haemost，1996，75(3)：520
[4] Rees DC，Cox M，Clegg JB.World dis tribution of factor V Leiden .Lancet， 1995，346：1133
[5] Chan LC，Bourke C，Lam CK，et al.La ck of activated Protein C resistance in healthy Hong Kong Chinese blood donors-correlation with absence of A rg506 Gln mutation of Factor V g ene.Thromb Haemost，1996，75：522
, 百拇医药
[6] pepe G，Rickards O，Vanegas OC，et al.Prevalence of factor V Leiden mut ation in non-European population.Thr omb Haemost，1997，77：329
[7] 罗佳滨，关月，马洪星，等. 凝血因子 V 基因点突变 1691A 在不同种族人群中的分布.中华遗传学杂志，1996，13：219
[8] 吴竟生，顾建明，Morrissy JH，等.一例 Fv Leid en 基因突变所致抗活化的蛋白 C 现象. 中华血液学杂志，1997，1 8：453
收稿日期：1999-11-25；修订日期：2000-02-22, 百拇医药