耐TAM大鼠乳腺癌细胞移植瘤的免疫组化研究
作者：房广英 朱森林 苏宁
单位：房广英(武警广东省总队医院病理科，广州 510507)；朱森林(中山医科大学内科，广州 510089)；苏宁(南京铁道医学院病理学教研室，南京 210009)
关键词：耐药细胞株；肿瘤实验性；乳腺肿瘤；三苯氧胺；免疫组织化学；大鼠
临床与实验病理学杂志000232
中图分类号 R737.9 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)02-0170-02
内分泌治疗已作为一种辅助措施广泛应用于乳腺癌的临床治疗，并取得满意疗效，其中三苯氧胺(tamoxifen，TAM)为研究最多、应用最广的药物，它不仅有效地用于乳腺癌的治疗，而且已用于乳腺癌高危人群的预防，并认为这是最好的预防药物〔1〕。但是，随着TAM的广泛应用，耐药问题也显突出。为进一步观察耐TAM大鼠乳腺癌细胞在活体内的形态学特性，我们应用SD大鼠进行动物实验，复制成耐TAM乳腺癌动物模型，并观察移植瘤PCNA、ER、PR等在乳腺癌中表达特征。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 乳腺癌细胞系与细胞培养 实验所用的乳腺癌细胞系有2种。S103细胞为SHZ-88细胞系细胞，为7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)诱发的雌性SD大鼠乳腺癌所建细胞系第103代细胞〔2，3〕；Y2细胞为SHZ-88细胞系的亚系，是SHZ-88细胞经2×10-6 mol/L的TAM第二次克隆后形成的耐药细胞〔4〕。两种细胞均培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，Y2细胞培养液中还补充了2×10-6mol/L TAM，以维持其耐药表型。
1.2 动物 封闭群SD种鼠购自上海计划生育研究所，大鼠自行繁殖，为清洁普通动物。7日龄新生幼鼠行胸腺去除术〔5〕，体重13.0±3.1 g，次日即可用于实验。 扩大培养Y2及S103细胞，使细胞密度为2×107个/ml，胸腺去除术后的8日龄幼鼠分成两组，Y组接种Y2细胞，S组接种S103细胞，接种部位均为右腋皮下，细胞数量等同为2×106个/只，进行两种癌细胞致瘤性的对比性实验。接种癌细胞后30天处死大鼠，称瘤重。
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1.3 肿瘤标记物PCNA、ER、PR免疫组化检测 采用免疫组化ABC法检测PCNA、ER、PR。操作步骤如下：新鲜肿瘤组织用10%福尔马林固定，丙酮逐级脱水，石蜡包埋切片，脱蜡后按ABC法进行免疫组化染色制片。PCNA免疫组化染色用PC10单抗，ER、PR则分别用雌二醇多抗和孕酮多抗。
1.4 移植瘤TAM治疗试验 将新生幼鼠分为两组，Y′组接种Y2细胞，S′组接种S103细胞，接种方法及接种细胞数同前。两组分别设两亚组：对照组(CTR组)和TAM处理组(TAM组)。每组鼠8～11只，接种当天即开始治疗：CTR组注射生理盐水0.1 ml；TAM组剂量(/只)：第1周25 μg，第2周50 μg，以后70 μg。每天1次，背部皮下注射，为期4周。4周后处死大鼠，剖出肿瘤，称瘤重。
2 结果
2.1 瘤细胞致瘤性 Y′组鼠共24只，实验过程中死3只。Y2细胞致肿瘤潜伏期为8.13天，致瘤率为100%。S′组鼠共21只，实验过程中死4只。S组潜伏期为6.45天，致瘤率亦为100%。
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2.2 PCNA检测结果 两种移植瘤均为阳性，Y组移植瘤标记指数(1abelling index，LI)为37.08%±10.04%，S组为51.93%±9.4%(P<0.05)。
2.3 ER、PR检测 Y＇组瘤细胞ER为阴性，PR为阳性；S组ER、PR均为阳性。
2.4 TAM治疗试验结果 TAM治疗试验结束时，Y＇组TAM组与S＇组TAM组瘤重统计差异显著(P<0.01)。Y＇组抑瘤率为7.95%，而S＇组为98.45%。Y＇组TAM组与CTR组比，瘤重差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
为了解乳腺癌TAM耐药机制，观察耐药细胞对激素的反应情况，尹科祥等〔4〕用改良双层琼脂培养法对激素依赖性大鼠乳腺癌细胞SHZ-88进行克隆培养，并逐渐提高TAM浓度，建立了耐TAM亚系(Y2细胞)。在耐TAM乳腺癌细胞体外模型的基础上，我们又将其引伸到动物试验。
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实验结果表明，Y2细胞与S103细胞在动物体内致瘤率均为100%，耐药细胞的致瘤性并没有因双层琼脂克隆培养而消失。
PCNA为一种酸性蛋白，是与细胞生长增殖有关的标记物，它与DNA前导链和后随链合成有关。PCNA表达能反映细胞增殖状态。Aaltamaa等〔6〕的研究均支持PCNA LI作为乳腺癌新的预后指标的观点，并认为，PCNA LI能反映乳腺癌的生长增殖情况、恶性程度、侵袭性等〔7〕。我们的实验结果显示Y组肿瘤PCNA LI为37.08%，而S组为51.93%，统计差异显著(P<0.05)。究其原因，我们推测与下列因素有关：(1)Y2细胞可能处于某种“休止”状态；(2)SHZ-88群体中细胞的异质性；(3)PCNA基因变异使其型表达发生改变，从而影响其表达产物的免疫着色。Liu等〔8〕曾用Southern印迹法检测到R3230AC乳腺肿瘤PCNA基因的结构改变。
, 百拇医药 在临床上，ER与PR状态常作为选择乳腺癌内分泌治疗的依据，且与患者预后关系密切。一般认为，ER阳性乳腺癌对内分泌治疗较敏感，预后较好。Y2细胞在体外培养时，ER阴性，PR阳性，移植到体内生长增殖后，其微环境已经改变，但受体状态依然没改变，这进一步证明Y2细胞生物学特性的稳定性。
TAM治疗试验表明，Y＇组TAM抑瘤率仅为7.95%，且瘤重与CTR组无显著差异(P>0.05)。而S＇组TAM抑瘤率为98.45%，与CTR组比，瘤重差异有显著性(P<0.01)。显然，TAM对Y＇组肿瘤无生长抑制作用或作用不明显。
虽然在大鼠与人类间存在种属差异，但研究结果提示，一旦在TAM治疗过程中肿瘤ER转阴，除外检验技术上的失误，还应考虑产生肿瘤耐药性。我们的实验为进一步研究乳腺癌耐药机制提供了较理想的模型和研究方法。
参考文献
, 百拇医药
1，Jordan VC.The strategic use of antiestrogens to control the development and growth of breast cancer.Cancer，1992；70(4)suppl：977～982
2，苏 宁，张晓明，韩月明等.SHZ-88大鼠乳腺癌细胞系的建立及其生物学特性观察.癌症，1991；10(5)：378～381
3，苏 宁，张晓明，韩月明等.DMBA诱发大鼠乳腺癌组织发生学及激素依赖性研究.癌症，1990；9(1)：8～11
4，尹科祥，苏 宁，张瑞英.耐三苯氧胺大鼠乳腺癌细胞株的建立.癌症，1995；14(3)：170～172
5，张晓明，韩月明.小切口胸腺吸除术.南京铁道医学院学报，1989； 8(3)：57～59
, 百拇医药
6，Aaltamaa S，Lipponen P，Papinaho S et al.Proliferating cell nuclear antigen(PC10)immunolabelling and other proliferation indices as prognostic factors in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol，1993；119(5)：288～294
7，Sheen-chen SM，Eng HL，Chou FF et al.The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen in patients with lymph node-positive breast cancer.Arch Surg，1997；132(3)：264～267
8，Liu YC，Bambara RA.Gene expression of PCNA/cyclin in adult tissues and the R3230AC mammary tumor of rat.Biochem Biophys Res Commun，1989；161(2)：873～882
收稿日期：1999-05-24 修回日期：1999-10-29, 百拇医药
单位：房广英(武警广东省总队医院病理科，广州 510507)；朱森林(中山医科大学内科，广州 510089)；苏宁(南京铁道医学院病理学教研室，南京 210009)
关键词：耐药细胞株；肿瘤实验性；乳腺肿瘤；三苯氧胺；免疫组织化学；大鼠
临床与实验病理学杂志000232
中图分类号 R737.9 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)02-0170-02
内分泌治疗已作为一种辅助措施广泛应用于乳腺癌的临床治疗，并取得满意疗效，其中三苯氧胺(tamoxifen，TAM)为研究最多、应用最广的药物，它不仅有效地用于乳腺癌的治疗，而且已用于乳腺癌高危人群的预防，并认为这是最好的预防药物〔1〕。但是，随着TAM的广泛应用，耐药问题也显突出。为进一步观察耐TAM大鼠乳腺癌细胞在活体内的形态学特性，我们应用SD大鼠进行动物实验，复制成耐TAM乳腺癌动物模型，并观察移植瘤PCNA、ER、PR等在乳腺癌中表达特征。
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1 材料与方法
1.1 乳腺癌细胞系与细胞培养 实验所用的乳腺癌细胞系有2种。S103细胞为SHZ-88细胞系细胞，为7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)诱发的雌性SD大鼠乳腺癌所建细胞系第103代细胞〔2，3〕；Y2细胞为SHZ-88细胞系的亚系，是SHZ-88细胞经2×10-6 mol/L的TAM第二次克隆后形成的耐药细胞〔4〕。两种细胞均培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，Y2细胞培养液中还补充了2×10-6mol/L TAM，以维持其耐药表型。
1.2 动物 封闭群SD种鼠购自上海计划生育研究所，大鼠自行繁殖，为清洁普通动物。7日龄新生幼鼠行胸腺去除术〔5〕，体重13.0±3.1 g，次日即可用于实验。 扩大培养Y2及S103细胞，使细胞密度为2×107个/ml，胸腺去除术后的8日龄幼鼠分成两组，Y组接种Y2细胞，S组接种S103细胞，接种部位均为右腋皮下，细胞数量等同为2×106个/只，进行两种癌细胞致瘤性的对比性实验。接种癌细胞后30天处死大鼠，称瘤重。
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1.3 肿瘤标记物PCNA、ER、PR免疫组化检测 采用免疫组化ABC法检测PCNA、ER、PR。操作步骤如下：新鲜肿瘤组织用10%福尔马林固定，丙酮逐级脱水，石蜡包埋切片，脱蜡后按ABC法进行免疫组化染色制片。PCNA免疫组化染色用PC10单抗，ER、PR则分别用雌二醇多抗和孕酮多抗。
1.4 移植瘤TAM治疗试验 将新生幼鼠分为两组，Y′组接种Y2细胞，S′组接种S103细胞，接种方法及接种细胞数同前。两组分别设两亚组：对照组(CTR组)和TAM处理组(TAM组)。每组鼠8～11只，接种当天即开始治疗：CTR组注射生理盐水0.1 ml；TAM组剂量(/只)：第1周25 μg，第2周50 μg，以后70 μg。每天1次，背部皮下注射，为期4周。4周后处死大鼠，剖出肿瘤，称瘤重。
2 结果
2.1 瘤细胞致瘤性 Y′组鼠共24只，实验过程中死3只。Y2细胞致肿瘤潜伏期为8.13天，致瘤率为100%。S′组鼠共21只，实验过程中死4只。S组潜伏期为6.45天，致瘤率亦为100%。
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2.2 PCNA检测结果 两种移植瘤均为阳性，Y组移植瘤标记指数(1abelling index，LI)为37.08%±10.04%，S组为51.93%±9.4%(P<0.05)。
2.3 ER、PR检测 Y＇组瘤细胞ER为阴性，PR为阳性；S组ER、PR均为阳性。
2.4 TAM治疗试验结果 TAM治疗试验结束时，Y＇组TAM组与S＇组TAM组瘤重统计差异显著(P<0.01)。Y＇组抑瘤率为7.95%，而S＇组为98.45%。Y＇组TAM组与CTR组比，瘤重差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
为了解乳腺癌TAM耐药机制，观察耐药细胞对激素的反应情况，尹科祥等〔4〕用改良双层琼脂培养法对激素依赖性大鼠乳腺癌细胞SHZ-88进行克隆培养，并逐渐提高TAM浓度，建立了耐TAM亚系(Y2细胞)。在耐TAM乳腺癌细胞体外模型的基础上，我们又将其引伸到动物试验。
, http://www.100md.com
实验结果表明，Y2细胞与S103细胞在动物体内致瘤率均为100%，耐药细胞的致瘤性并没有因双层琼脂克隆培养而消失。
PCNA为一种酸性蛋白，是与细胞生长增殖有关的标记物，它与DNA前导链和后随链合成有关。PCNA表达能反映细胞增殖状态。Aaltamaa等〔6〕的研究均支持PCNA LI作为乳腺癌新的预后指标的观点，并认为，PCNA LI能反映乳腺癌的生长增殖情况、恶性程度、侵袭性等〔7〕。我们的实验结果显示Y组肿瘤PCNA LI为37.08%，而S组为51.93%，统计差异显著(P<0.05)。究其原因，我们推测与下列因素有关：(1)Y2细胞可能处于某种“休止”状态；(2)SHZ-88群体中细胞的异质性；(3)PCNA基因变异使其型表达发生改变，从而影响其表达产物的免疫着色。Liu等〔8〕曾用Southern印迹法检测到R3230AC乳腺肿瘤PCNA基因的结构改变。
, 百拇医药 在临床上，ER与PR状态常作为选择乳腺癌内分泌治疗的依据，且与患者预后关系密切。一般认为，ER阳性乳腺癌对内分泌治疗较敏感，预后较好。Y2细胞在体外培养时，ER阴性，PR阳性，移植到体内生长增殖后，其微环境已经改变，但受体状态依然没改变，这进一步证明Y2细胞生物学特性的稳定性。
TAM治疗试验表明，Y＇组TAM抑瘤率仅为7.95%，且瘤重与CTR组无显著差异(P>0.05)。而S＇组TAM抑瘤率为98.45%，与CTR组比，瘤重差异有显著性(P<0.01)。显然，TAM对Y＇组肿瘤无生长抑制作用或作用不明显。
虽然在大鼠与人类间存在种属差异，但研究结果提示，一旦在TAM治疗过程中肿瘤ER转阴，除外检验技术上的失误，还应考虑产生肿瘤耐药性。我们的实验为进一步研究乳腺癌耐药机制提供了较理想的模型和研究方法。
参考文献
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1，Jordan VC.The strategic use of antiestrogens to control the development and growth of breast cancer.Cancer，1992；70(4)suppl：977～982
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4，尹科祥，苏 宁，张瑞英.耐三苯氧胺大鼠乳腺癌细胞株的建立.癌症，1995；14(3)：170～172
5，张晓明，韩月明.小切口胸腺吸除术.南京铁道医学院学报，1989； 8(3)：57～59
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6，Aaltamaa S，Lipponen P，Papinaho S et al.Proliferating cell nuclear antigen(PC10)immunolabelling and other proliferation indices as prognostic factors in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol，1993；119(5)：288～294
7，Sheen-chen SM，Eng HL，Chou FF et al.The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen in patients with lymph node-positive breast cancer.Arch Surg，1997；132(3)：264～267
8，Liu YC，Bambara RA.Gene expression of PCNA/cyclin in adult tissues and the R3230AC mammary tumor of rat.Biochem Biophys Res Commun，1989；161(2)：873～882
收稿日期：1999-05-24 修回日期：1999-10-29, 百拇医药