软骨细胞培养支架的研究进展
作者：李宇 王传家 吴利标
单位：李宇(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)；王传家(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)；吴利标(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)
关键词：
实用美容整形外科杂志000222 随着材料学、生命科学及相关学科的发展，一门新的学科正在兴起，即组织工程技术。它是应用生物学和工程学的原理，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门学科，其基本方法是：将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的具备良好生物相容性和可降解性的聚合物支架，形成细胞支架复合物，然后，将这种复合物移植到动物体内组织缺损部位，最终形成一个与机体本身在组织学及生化组成上完全相同的组织，从而完成组织缺损的修复与再造[1]。这正是现代医学区别于以往生物科学的显著特点，可望成为现代医学发展的第三个里程碑。
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组织工程自1988年提出以来，引起世界范围的广泛关注，十余年来得到了迅猛的发展。1990年Vacanti等人利用组织工程技术，再生新的软骨，标志着组织工程技术已进入一个新的阶段[2]。1997年曹谊林等利用该方法成功地再生了具有人耳廓形态的软骨组织[3]，在医学界引起了轰动，并纷纷运用该方法进行其它组织的预制和再生。
1 软骨细胞培养支架的提出
因外伤或疾病可引起软骨缺损，由于软骨缺乏再生能力，需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，由于可引起免疫排斥反应，导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。
体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chestreman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节[4]。1977年，Green等人以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是他第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复[5]。
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2 软骨细胞培养支架的研究
细胞培养支架的选择是组织工程研究的焦点之一[6]。良好的细胞培养支架，除具有良好的生物相容性和可降解性[2]，还具有亲水性和良好的细胞吸附性，可预测吸收时间，便于塑形，尽可能少出现感染[7]。作为一种良好的可降解性聚合物支架应有利于营养物质均一扩散到细胞之间，有利于细胞与细胞之间的联系，促进新组织的形成[1]。
软骨细胞培养支架对于运用组织工程技术修复软骨缺损是非常重要的，软骨细胞培养支架有利于软骨细胞的粘附、生长、增殖和分化[8]。组织工程技术中比较理想的软骨细胞培养支架，除应具备上述特点，还应具备下列效应：①高增长率 ，扩大供体细胞的使用；②高动力学速率，缩短增殖细胞固定的时间和切应力敏感细胞的悬浮时间；③粘附细胞均一的空间分布，有利于快速均一的组织产生[9]。
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3 人工合成的生物相容性和可降解性支架的研究
人工合成的可降解性支架有下列4种特殊的形状：三角形、矩形、十字形和圆柱形[10]。可降解性生物材料被制成多分支网状或多孔海绵状，其内部形成大量三维空间，使得细胞能有效进行气体交换，营养吸收，代谢物排出，因而有利于细胞成活和基质分泌。
3.1 1990年，Vacanti等首先利用具有生物相容性的乙交酯(Glycolide)和丙交酯(Lactide)按90∶10的比例聚合而成的共聚物910(Polyglactin 910)制备支架，这种支架能运载分离的软骨细胞，提供一个较大的表面结构，软骨细胞能够粘附在支架表面，通过扩散获取营养，这种聚合物复合体能在皮下产生新的软骨组织[2]。
3.2 为进一步寻找生长效果更佳的细胞支架，1994年Vacanti等人利用生物可降解性聚羟基乙酸(Polyglycolicacid, 简称PGA)支架移植软骨细胞。在20世纪70年代早期，人们就认识到这种支架是一种生物相容性的三维支架，在体内降解后，生成羟基乙酸，易于参加体内的代谢。1994年Kim等将软骨细胞接种于PGA上， 再生出新的组织，经证实是新生软骨[10]。至今为止，PGA这种支架取得最佳生长效果的是直径15μm，间隔150～200μm，厚度为100μm左右的无纺网[11]，但这种支架具有棉球样特性，浸湿后不易保持一定的形状。
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聚乳酸(Polylacticacid, 简称PLA)也是一种可降解性生物材料，它可以把相邻的PGA纤维连接起来，使支架结构更为稳定，能保持一定形状，解决了细胞生物支架(PGA)的塑形问题。PGA+PLA是目前组织工程领域应用最为广泛的细胞培养支架[10]，但其亲水性差，对细胞吸附力弱，生物降解缓慢，存在纤维变性和免疫反应，而且价格昂贵[12]。
3.3 利用注射途径运载大量的软骨细胞进入组织缺损处，具有明显的优势。首先，操作简单，使用方便；其次，不会遗留明显的瘢痕。1995年，Paige等人利用钙藻酸盐凝胶(Calcium alginate gel)包埋分离的软骨细胞，提供三维的软骨细胞培养支架，软骨细胞钙藻酸盐聚合物复合体被注射到裸鼠的肌膜下，体内孵化6周后，产生了新软骨[13]。这种支架有可能应用于临床，但它存在免疫原性和缺乏生物降解能力，还不是一种很理想的软骨细胞培养支架[14～15]。
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1996年，Vacanti等人又研究了一种聚乙烯氧化凝胶(Polyethylene oxide gel)，它是一种具备生物相容性和可降解性支架，这种软骨细胞聚合物复合体可被注射到裸鼠的皮下，体内孵化6周后，产生了新软骨[7]。这种聚合物的优点有三个方面：①它能形成一种可塑形粘性物质；②与周围组织的蛋白质和大多数的生物大分子不发生相互作用；③当这种聚合物粘附了丙烯酸盐配体，并在紫外光照射下，能从液态转变为一种所需形状的固态结构。这种聚合物在6～8周后被周围组织吸收 ，并通过肾脏排出体外[7]。
1998年Aigner等人研究了透明质酸苄基酯(Hyaluronic acid benzylester)，它是一种新近发展的半合成的生物材料，是一种可降解的软骨细胞培养支架，软骨细胞在这种支架内能表现出好的生存能力、粘附性、再分化和增殖，在体外培养很长的一段时间后，软骨细胞仍能保持一定的表型，软骨细胞聚合物复合体能种植在裸鼠的皮下，1个月后，能产生透明软骨样组织[16]。
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3.4 国内学者在组织工程技术的研究工作中，曹谊林作了大量开创性的工作。1997年，曹谊林等采用卵磷脂和多聚赖氨酸对PGA+PLA进行包埋，实验表明：卵磷脂增加了PGA+PLA的亲水性，多聚赖氨酸增加了它的亲水性和细胞吸附性，两者共同包埋后，使一部分细胞分布于支架纤维之间，一部分细胞吸附于纤维支架表面，使支架的空间得到了最大程度的利用[17]。
1998年，曹谊林等采用卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA对几丁质进行包埋与软骨细胞体外培养的实验研究。实验证明几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架，具有良好的生物相容性和生物可降解性，另外还无毒性、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、不溶血、无致突变及致死性突变效应[18]。这些特性说明它作为组织工程技术中细胞培养支架是可行的。这个实验表明卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋几丁质后，增加了它的亲水性和对细胞的吸附力，且可以促进软骨细胞发挥正常的功能[19]。
, 百拇医药 1998年，曹谊林等人对氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物(Pluronic, F-127凝胶)进行了研究，它是一种生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架，能运载分离的软骨细胞，并促进软骨细胞的增殖。作为一种新型可注射性生物材料，由于该材料在4℃以下时保持液态，体温37℃时聚合成一种厚凝胶，可注射性修复软骨缺损。曹谊林等人利用这种Pluronic，F-127凝胶运载猪软骨细胞，种植在猪的皮下，3周后，产生了人乳头样软骨组织[20]。
尽管聚羟基乙酸、钙藻酸盐凝胶和Pluronic，F-127凝胶都能运载软骨细胞，种植在皮下，产生软骨组织，但不同的支架能形成不同的软骨组织，PGA和钙藻酸盐凝胶软骨细胞复合体能产生纤维软骨，而Pluronic，F-127软骨细胞复合体，当弹性蛋白存在时，能产生弹性软骨[21]。
4 天然的细胞外基质替代物(细胞支架)的研究
细胞外基质(Extracellular matrix, 简称ECM)主要成分为基质和纤维，前者的主要成分是氨基多糖，起到调节细胞外液的化学成分，促进创伤愈合和润滑作用，后者的主要成分是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维组成，这三种纤维的主要成分是一种胶原蛋白质。由于胶原来源广泛，特别是其抗原性低和可吸收性而被广泛应用于医学，用胶原进行细胞培养，还有促进细胞生长的作用。因此，胶原可以作为组织工程中细胞外基质的替代物。
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1997年，曹谊林等人进行了血浆来源的纤维蛋白聚合物的研究。纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体聚合成的可塑形的、可粘附的和可降解的凝胶，这种生物来源的支架可以维持三维的空间构架，允许在皮下产生一个新组织。纤维蛋白单体聚合成凝胶时，通过释放血小板来源的生长因子和β转化生长因子，促进细胞增殖和基质的分泌[22]。这种聚合物包埋分离的软骨细胞，可为软骨细胞提供三维的空间支持，这种聚合物复合体移植到裸鼠的皮下，体内孵化6周后，产生新软骨。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，为组织工程新软骨形成提供一种可选择的聚合物支架[23]。
纤维蛋白凝胶是易适应的、可粘附的和生物相容性的。它可通过减慢凝血酶的聚集，因而减慢它从液态转变为凝胶的过程，允许更长时间的塑形。这种自体纤维蛋白凝胶已应用于临床其它外科学问题[23]。
人工合成的聚合物支架是一种异物，植入体内可引起不同程度的炎性反应[20]，以及免疫原性问题和致癌性问题[24]。与人工合成的支架相比，天然的软骨细胞培养支架具有以下优点：①可释放生长因子，促进软骨细胞增殖和基质的分泌；②天然基质接近软骨细胞生长的自然环境，有利于细胞的生长；③利用自体血浆来源的纤维蛋白凝胶，可以避免排斥反应。
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总之，目前的实验中组织工程修复技术所用的软骨细胞培养支架，不论是天然的，还是人工合成的，都存在一定的缺陷：如体内吸收过快或过慢，生物相容性问题，支架表面的结构也影响细胞的生长[25]。众多因素的影响使组织工程软骨移植未能达到满意的结果，至今为止，尚未找到一种理想的软骨细胞培养支架。因此，需要进一步研究具有良好生物相容性及体内降解速率、力学强度及可塑性更好的软骨细胞培养支架。今后，组织工程研究的焦点将是ECM的开发，天然的ECM支架的开发有可能成为软骨细胞培养支架进一步发展的关键。随着研究的深入，相关学科的发展和技术的进步，人们一定会找到理想的软骨细胞培养支架。选择良好的软骨细胞培养支架将为修复重建外科带来一场革命性的变化。
5 小结
软骨细胞培养支架与软骨细胞的粘附、生长、分化和增殖关系密切。近几年的研究主要集中在人工合成的生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架，如：钙藻酸盐凝胶、聚乙烯氧化凝胶、透明质酸苄基酯和Pluronic，F-127凝胶。天然的生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架的开发有可能成为软骨细胞培养支架进一步发展的方向，选择良好的软骨细胞培养支架将为修复重建外科带来一场革命性的变化。
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参考文献
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(收稿：1999-08-17), http://www.100md.com
单位：李宇(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)；王传家(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)；吴利标(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)
关键词：
实用美容整形外科杂志000222 随着材料学、生命科学及相关学科的发展，一门新的学科正在兴起，即组织工程技术。它是应用生物学和工程学的原理，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门学科，其基本方法是：将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的具备良好生物相容性和可降解性的聚合物支架，形成细胞支架复合物，然后，将这种复合物移植到动物体内组织缺损部位，最终形成一个与机体本身在组织学及生化组成上完全相同的组织，从而完成组织缺损的修复与再造[1]。这正是现代医学区别于以往生物科学的显著特点，可望成为现代医学发展的第三个里程碑。
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组织工程自1988年提出以来，引起世界范围的广泛关注，十余年来得到了迅猛的发展。1990年Vacanti等人利用组织工程技术，再生新的软骨，标志着组织工程技术已进入一个新的阶段[2]。1997年曹谊林等利用该方法成功地再生了具有人耳廓形态的软骨组织[3]，在医学界引起了轰动，并纷纷运用该方法进行其它组织的预制和再生。
1 软骨细胞培养支架的提出
因外伤或疾病可引起软骨缺损，由于软骨缺乏再生能力，需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，由于可引起免疫排斥反应，导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。
体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chestreman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节[4]。1977年，Green等人以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是他第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复[5]。
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2 软骨细胞培养支架的研究
细胞培养支架的选择是组织工程研究的焦点之一[6]。良好的细胞培养支架，除具有良好的生物相容性和可降解性[2]，还具有亲水性和良好的细胞吸附性，可预测吸收时间，便于塑形，尽可能少出现感染[7]。作为一种良好的可降解性聚合物支架应有利于营养物质均一扩散到细胞之间，有利于细胞与细胞之间的联系，促进新组织的形成[1]。
软骨细胞培养支架对于运用组织工程技术修复软骨缺损是非常重要的，软骨细胞培养支架有利于软骨细胞的粘附、生长、增殖和分化[8]。组织工程技术中比较理想的软骨细胞培养支架，除应具备上述特点，还应具备下列效应：①高增长率 ，扩大供体细胞的使用；②高动力学速率，缩短增殖细胞固定的时间和切应力敏感细胞的悬浮时间；③粘附细胞均一的空间分布，有利于快速均一的组织产生[9]。
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3 人工合成的生物相容性和可降解性支架的研究
人工合成的可降解性支架有下列4种特殊的形状：三角形、矩形、十字形和圆柱形[10]。可降解性生物材料被制成多分支网状或多孔海绵状，其内部形成大量三维空间，使得细胞能有效进行气体交换，营养吸收，代谢物排出，因而有利于细胞成活和基质分泌。
3.1 1990年，Vacanti等首先利用具有生物相容性的乙交酯(Glycolide)和丙交酯(Lactide)按90∶10的比例聚合而成的共聚物910(Polyglactin 910)制备支架，这种支架能运载分离的软骨细胞，提供一个较大的表面结构，软骨细胞能够粘附在支架表面，通过扩散获取营养，这种聚合物复合体能在皮下产生新的软骨组织[2]。
3.2 为进一步寻找生长效果更佳的细胞支架，1994年Vacanti等人利用生物可降解性聚羟基乙酸(Polyglycolicacid, 简称PGA)支架移植软骨细胞。在20世纪70年代早期，人们就认识到这种支架是一种生物相容性的三维支架，在体内降解后，生成羟基乙酸，易于参加体内的代谢。1994年Kim等将软骨细胞接种于PGA上， 再生出新的组织，经证实是新生软骨[10]。至今为止，PGA这种支架取得最佳生长效果的是直径15μm，间隔150～200μm，厚度为100μm左右的无纺网[11]，但这种支架具有棉球样特性，浸湿后不易保持一定的形状。
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聚乳酸(Polylacticacid, 简称PLA)也是一种可降解性生物材料，它可以把相邻的PGA纤维连接起来，使支架结构更为稳定，能保持一定形状，解决了细胞生物支架(PGA)的塑形问题。PGA+PLA是目前组织工程领域应用最为广泛的细胞培养支架[10]，但其亲水性差，对细胞吸附力弱，生物降解缓慢，存在纤维变性和免疫反应，而且价格昂贵[12]。
3.3 利用注射途径运载大量的软骨细胞进入组织缺损处，具有明显的优势。首先，操作简单，使用方便；其次，不会遗留明显的瘢痕。1995年，Paige等人利用钙藻酸盐凝胶(Calcium alginate gel)包埋分离的软骨细胞，提供三维的软骨细胞培养支架，软骨细胞钙藻酸盐聚合物复合体被注射到裸鼠的肌膜下，体内孵化6周后，产生了新软骨[13]。这种支架有可能应用于临床，但它存在免疫原性和缺乏生物降解能力，还不是一种很理想的软骨细胞培养支架[14～15]。
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1996年，Vacanti等人又研究了一种聚乙烯氧化凝胶(Polyethylene oxide gel)，它是一种具备生物相容性和可降解性支架，这种软骨细胞聚合物复合体可被注射到裸鼠的皮下，体内孵化6周后，产生了新软骨[7]。这种聚合物的优点有三个方面：①它能形成一种可塑形粘性物质；②与周围组织的蛋白质和大多数的生物大分子不发生相互作用；③当这种聚合物粘附了丙烯酸盐配体，并在紫外光照射下，能从液态转变为一种所需形状的固态结构。这种聚合物在6～8周后被周围组织吸收 ，并通过肾脏排出体外[7]。
1998年Aigner等人研究了透明质酸苄基酯(Hyaluronic acid benzylester)，它是一种新近发展的半合成的生物材料，是一种可降解的软骨细胞培养支架，软骨细胞在这种支架内能表现出好的生存能力、粘附性、再分化和增殖，在体外培养很长的一段时间后，软骨细胞仍能保持一定的表型，软骨细胞聚合物复合体能种植在裸鼠的皮下，1个月后，能产生透明软骨样组织[16]。
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3.4 国内学者在组织工程技术的研究工作中，曹谊林作了大量开创性的工作。1997年，曹谊林等采用卵磷脂和多聚赖氨酸对PGA+PLA进行包埋，实验表明：卵磷脂增加了PGA+PLA的亲水性，多聚赖氨酸增加了它的亲水性和细胞吸附性，两者共同包埋后，使一部分细胞分布于支架纤维之间，一部分细胞吸附于纤维支架表面，使支架的空间得到了最大程度的利用[17]。
1998年，曹谊林等采用卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA对几丁质进行包埋与软骨细胞体外培养的实验研究。实验证明几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架，具有良好的生物相容性和生物可降解性，另外还无毒性、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、不溶血、无致突变及致死性突变效应[18]。这些特性说明它作为组织工程技术中细胞培养支架是可行的。这个实验表明卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋几丁质后，增加了它的亲水性和对细胞的吸附力，且可以促进软骨细胞发挥正常的功能[19]。
, 百拇医药 1998年，曹谊林等人对氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物(Pluronic, F-127凝胶)进行了研究，它是一种生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架，能运载分离的软骨细胞，并促进软骨细胞的增殖。作为一种新型可注射性生物材料，由于该材料在4℃以下时保持液态，体温37℃时聚合成一种厚凝胶，可注射性修复软骨缺损。曹谊林等人利用这种Pluronic，F-127凝胶运载猪软骨细胞，种植在猪的皮下，3周后，产生了人乳头样软骨组织[20]。
尽管聚羟基乙酸、钙藻酸盐凝胶和Pluronic，F-127凝胶都能运载软骨细胞，种植在皮下，产生软骨组织，但不同的支架能形成不同的软骨组织，PGA和钙藻酸盐凝胶软骨细胞复合体能产生纤维软骨，而Pluronic，F-127软骨细胞复合体，当弹性蛋白存在时，能产生弹性软骨[21]。
4 天然的细胞外基质替代物(细胞支架)的研究
细胞外基质(Extracellular matrix, 简称ECM)主要成分为基质和纤维，前者的主要成分是氨基多糖，起到调节细胞外液的化学成分，促进创伤愈合和润滑作用，后者的主要成分是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维组成，这三种纤维的主要成分是一种胶原蛋白质。由于胶原来源广泛，特别是其抗原性低和可吸收性而被广泛应用于医学，用胶原进行细胞培养，还有促进细胞生长的作用。因此，胶原可以作为组织工程中细胞外基质的替代物。
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1997年，曹谊林等人进行了血浆来源的纤维蛋白聚合物的研究。纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体聚合成的可塑形的、可粘附的和可降解的凝胶，这种生物来源的支架可以维持三维的空间构架，允许在皮下产生一个新组织。纤维蛋白单体聚合成凝胶时，通过释放血小板来源的生长因子和β转化生长因子，促进细胞增殖和基质的分泌[22]。这种聚合物包埋分离的软骨细胞，可为软骨细胞提供三维的空间支持，这种聚合物复合体移植到裸鼠的皮下，体内孵化6周后，产生新软骨。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，为组织工程新软骨形成提供一种可选择的聚合物支架[23]。
纤维蛋白凝胶是易适应的、可粘附的和生物相容性的。它可通过减慢凝血酶的聚集，因而减慢它从液态转变为凝胶的过程，允许更长时间的塑形。这种自体纤维蛋白凝胶已应用于临床其它外科学问题[23]。
人工合成的聚合物支架是一种异物，植入体内可引起不同程度的炎性反应[20]，以及免疫原性问题和致癌性问题[24]。与人工合成的支架相比，天然的软骨细胞培养支架具有以下优点：①可释放生长因子，促进软骨细胞增殖和基质的分泌；②天然基质接近软骨细胞生长的自然环境，有利于细胞的生长；③利用自体血浆来源的纤维蛋白凝胶，可以避免排斥反应。
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总之，目前的实验中组织工程修复技术所用的软骨细胞培养支架，不论是天然的，还是人工合成的，都存在一定的缺陷：如体内吸收过快或过慢，生物相容性问题，支架表面的结构也影响细胞的生长[25]。众多因素的影响使组织工程软骨移植未能达到满意的结果，至今为止，尚未找到一种理想的软骨细胞培养支架。因此，需要进一步研究具有良好生物相容性及体内降解速率、力学强度及可塑性更好的软骨细胞培养支架。今后，组织工程研究的焦点将是ECM的开发，天然的ECM支架的开发有可能成为软骨细胞培养支架进一步发展的关键。随着研究的深入，相关学科的发展和技术的进步，人们一定会找到理想的软骨细胞培养支架。选择良好的软骨细胞培养支架将为修复重建外科带来一场革命性的变化。
5 小结
软骨细胞培养支架与软骨细胞的粘附、生长、分化和增殖关系密切。近几年的研究主要集中在人工合成的生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架，如：钙藻酸盐凝胶、聚乙烯氧化凝胶、透明质酸苄基酯和Pluronic，F-127凝胶。天然的生物相容性和可降解性的软骨细胞培养支架的开发有可能成为软骨细胞培养支架进一步发展的方向，选择良好的软骨细胞培养支架将为修复重建外科带来一场革命性的变化。
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(收稿：1999-08-17), http://www.100md.com