血管紧张素转化酶基因多态性与内皮功能的研究
作者：徐秀英 叶珏 杜凤和 张剑峰 惠汝太
单位：徐秀英(天坛医院心内科，北京 100050)；杜凤和(天坛医院心内科，北京 100050)； 张剑峰(天坛医院心内科，北京 100050)； 叶珏(阜外医院中德实验室)； 惠汝太(阜外医院中德实验室)
关键词：血管紧张素转化酶；基因多态性；冠状动脉疾病；内皮功能
心脏杂志0000202
摘 要：目的：探讨血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与冠心病血管内皮功能的关系。方法：采用多聚酶链反应(PCR)技术对24例心肌梗死、56例心绞痛患者、65例正常人的ACE基因型及血浆内皮素(ET)、内皮源性舒张因子(EDRF)进行了检测，以ET/NO作为内皮功能指标。结果：心肌梗死组D等位基因频率显著高于正常对照组，DD型患者中的ET/NO比值较Ⅱ型明显升高(P<0.05)。结论：DD型心肌梗死患者内皮功能受损较重。
, 百拇医药
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)02-0084-03
The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and endothelial function
XU Xiu-ying DU Feng-he ZHANG Jian-feng
(Tiantan hospital,Beijing 100050)
YE Jue HUI Ru-tai
(Fuwai hospital，China)
, 百拇医药
Abstract Aim:to investigate the association between the deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) gene and endothelial function in coronary heart disease. Methods:ACE genotype was determined by PCR,and plasma endothelin (ET-1),endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide (EDRF/NO) were meassured in 24 cases of myocardial infarction (MI),56 cases of angina and 65 normal subjects. Results:D allele frequency was increased,compared with normal control (52.1% vs 34.6%,P<0.05), and ET-1/NO ratio was higher in DD homozygotes than in II genotype (0.98±0.32 vs 0.63±0.22,P<0.05) in patients with MI. Conclusion:endothelial dysfunction may related to ACE-DD genotype in patients of MI.
, http://www.100md.com
Key words:angiotensin converting enzyme;polymorphism of gene;endotheila function;coronary disease
近年来基础与临床研究表明，血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与多种心血管疾病相关[1]，但与内皮功能的关系国内外报道尚少，本研究采用多聚酶链反应(PCR)技术对80例冠心病患者、65例正常人的ACE基因型及血浆内皮素(ET)、内皮源性舒张因子(EDRF)进行了检测，以探讨ACE基因多态性与冠心病的相关性。
1 对象和方法
1.1 对象 分为3组：心肌梗死组：24例，均为我院心内科住院患者，心梗后1～24个月，男13例，女11例，年龄39～72岁，平均61±9岁，其中12例并发高血压，6例并发糖尿病，4例并发高脂血症，心功能均为Ⅰ-Ⅱ级。心绞痛组：56例，来源同上，男24例，女22例，年龄38～75岁，平均58±11岁，9例进行了冠脉造影，并发高血压32例，糖尿病15例，高脂血症10例，心功能均为Ⅰ-Ⅱ级。正常对照组：65例，男35例，女30例，年龄25～60岁，平均43±10岁，均来自健康体检者，无心脑血管疾病，肝肾功能正常。
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1.2 方法
1.2.1 DNA提取 取外周静脉血5 ml,EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，饱和盐析法提取DNA，DNA纯度A260/A280>1.8。
1.2.2 ACE基因多态性检测 采用PCR方法，扩增ACE基因第16内含子，引物设计：
Sense 5′-CTGCAGACCACTCCCATCCTTTCT-
3′；Antisense 5′-GATGTGGCCATCACAT
TCGTCAGAT-3′。反应总体积25 μl，其中包括基因组DNA 50 ng,Primer 10 pmol/L,10×Buffer 2.5 μl,1 u Taq酶，50 ml/L二甲基亚砜1 μl。应用PE公司System9700PCR仪扩增，95℃变性60 s，58℃复性90 s，72℃延伸90 s，循环45次。PCR产物在20 ml/L琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察。
, 百拇医药
1.2.3 ET测定 采用放射免疫的方法，药盒购于东亚免疫技术研究所。
1.2.4 EDRF测定 用一氧化氮间接测定方法，药盒购于解放军总医院，批内CV<6.21%,批间CV<8.75%。
1.3 统计学处理 实验数据以
±s表示，显著性检验计数资料用χ2检验，计量资料用t检验。
2 结果
2.1 ACE基因型分布 根据PCR扩增结果，ACE基因型分为DD型(缺失纯合子)、II型(插入纯合子)、ID型(杂合子)。各组基因型的分布未见显著差异(P>0.05)，但心肌梗死组D等位基因频率显著高于正常对照组(表1)。
表 1 血管紧张素转化酶基因型分布
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基因型[例数(%)]
等位基因频率(%)
组别
n
DD
ID
II
D
I
心肌梗死组
24
8(33.3)
9(37.5)
, http://www.100md.com
7(29.2)
52.1
47.9
心绞痛组
56
15(26.8)
16(28.6)
25(44.6)
41.1
58.9
正常对照组
65
12(18.5)
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21(32.3)
32(49.2)
34.6
64.4
与正常对照组比较，P<0.052.2 内皮功能检测 心肌梗死组ACE基因为DD型时，其内皮功能ET/NO值明显升高(表2).
表 2 内皮功能检测结果
DD型
II型
ID型
组别
ET(pg/ml)
, 百拇医药
NO(μmol/L)
ET/NO
ET(pg/ml)
NO(μmol/L)
ET/NO
ET(pg/ml)
NO(μmol/L)
ET/NO
心肌梗死组
77±28
85±33
0.98±0.32a
, http://www.100md.com
68±26
127±75
0.63±0.22
44±16a
85±47
0.47±0.19
心绞痛组
75±35
88±41
0.90±0.26a
58±25
112±57
, 百拇医药
0.56±0.21
45±19
106±52
0.50±0.27
正常对照组
35±14
68±17
0.56±0.34
37±17
72±33
0.57±0.26
37±16
, 百拇医药
60±26
0.61±0.39
与同组II型比较，aP<0.053 讨论
人ACE基因位于染色体17q23上，通过检测其16内含子287 bp DNA片段的插入/缺失(I/D)分为DD型、II型、ID型。文献报道，ACE基因DD型与冠心病尤其是心肌梗死密切相关，在冠心病患者中D等位基因频率明显增加[2,3]，本研究三种基因型分布组间比较无差异(P>0.05)，虽然心肌梗死组DD型较正常对照组高，但无统计学意义(P>0.05)，然而D等位基因频率在心肌梗死组明显增加(52.1%对34.6%,P<0.05)，与国内外学者报道一致。而心绞痛组D等位基因频率虽然较正常对照组高，但统计学上无显著性差异，可能与病例人选标准不同有关，文献报道的心绞痛患者经冠脉造影证实[4]，本研究中只有9例做了冠脉造影，其余均为临床诊断。
, http://www.100md.com
ACE基因DD型与冠心病心肌梗死密切相关，但其分子水平机制仍不清楚。本文用血浆ET与NO比值作为内皮功能指标，对二者之间的关系进行了探讨。ET与NO均由血管内皮分泌，是一对具有拮抗效应的血管活性物质，前者是强烈的血管收缩剂，有类似生长因子的作用，可激活原癌基因的表达，促进平滑肌细胞增殖，参与动脉粥样硬化形成；后者可舒张血管平滑肌细胞，抑制血小板聚集，生理情况下二者保持动态平衡[5]。
本研究结果心肌梗死组DD型ET较II型升高，而NO下降，统计学上虽无显著性差异，但ET/NO比值DD型较II型明显升高(P<0.05)，说明DD型心肌梗死患者内皮功能受损较重。文献报道，ACE基因I/D多态性与血中及淋巴细胞内的ACE浓度有关，随着D等位基因频率的增加，ACE浓度增高[6,7]。ACE是肾素血管紧张素系统重要的组成成分，一方面促使AgI向AgII转化，另一方面作用于激肽缓激肽系统，使缓激肽灭活，前者作用于内皮的ET-1受体，促进ET的释放，后者作用于内皮的β2激肽受体，使NO合成分泌增加。故认为，DD型患者ET/NO比值升高可能与DD型血中ACE活性升高有关，也是DD型易患心肌梗死的可能机理之一。
, 百拇医药
本研究还发现心绞痛组DD型ET/NO比值也较II型明显升高(P<0.05)，而D等位基因频率与正常对照组比较无显著性差异，冠心病患者ID型ET/NO比值并非介于DD型、II型之间，正常对照组DD型、II型、ID型间ET，NO，ET/NO无显著性差异，因此DD型易患心肌梗死与其内皮功能受损较重有关的结论尚不能肯定。因为影响ET，NO水平的因素很多，除遗传、年龄、心功能外，还与血压水平、其他血管活性物质等因素有关，ACE基因多态性受种族地区的影响，因此ACE基因多态性与内皮功能的关系还需要一个样本更大的人群，入选标准尽可能统一，以便进一步做前瞻性研究。
参考文献：
[1] Staessen JA,Wang JG,Gincchio G,et al. The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and cardiovascular-renal risk[J]. J Hypertens,1997,15(12Pt2):1579.
, 百拇医药
[2] Mattu RK,Edward WA,Galton DJ,et al. A DNA variant at the ACE gene locus associated with coronary artery disease in the Gaerphilly Heart Study[J]. Circulation,1995,91(2):270.
[3] 郑豪义，戴玉华，邱长春. 血管紧张素转化酶基因的插入/缺失多态性与其血清水平及心肌梗死的关系[J]. 中华心血管杂志，1997，25(1)：34.
[4] Nakai K,Itoh C,Miura Y,et al. Deletion polymorphism of the angiotensin I-converting enzyme gene is associated with serum ACE concentration and increased risk for coronary artery disease in the Japanese[J]. Circulation,1994,90(5):2199
, 百拇医药
[5] 韩启德，文允镒. 血管生物学[M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：33～36.
[6] Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al. Evidence from combined segregation and linkage analysis,that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels[J]. Am J Hum Genet,1992,51(1):197.
[7] Costerousse O,Allegrini J,Lopez M,et al. Angiotensin I-converting enzyme in human circulating mononuclear cells:genetic polymorphism of expression in T-lymphocytes[J]. Biochem J,1993,290(Pt1):33.
收稿 1999-03-17
修回 1999-12-28, http://www.100md.com
单位：徐秀英(天坛医院心内科，北京 100050)；杜凤和(天坛医院心内科，北京 100050)； 张剑峰(天坛医院心内科，北京 100050)； 叶珏(阜外医院中德实验室)； 惠汝太(阜外医院中德实验室)
关键词：血管紧张素转化酶；基因多态性；冠状动脉疾病；内皮功能
心脏杂志0000202
摘 要：目的：探讨血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与冠心病血管内皮功能的关系。方法：采用多聚酶链反应(PCR)技术对24例心肌梗死、56例心绞痛患者、65例正常人的ACE基因型及血浆内皮素(ET)、内皮源性舒张因子(EDRF)进行了检测，以ET/NO作为内皮功能指标。结果：心肌梗死组D等位基因频率显著高于正常对照组，DD型患者中的ET/NO比值较Ⅱ型明显升高(P<0.05)。结论：DD型心肌梗死患者内皮功能受损较重。
, 百拇医药
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)02-0084-03
The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and endothelial function
XU Xiu-ying DU Feng-he ZHANG Jian-feng
(Tiantan hospital,Beijing 100050)
YE Jue HUI Ru-tai
(Fuwai hospital，China)
, 百拇医药
Abstract Aim:to investigate the association between the deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) gene and endothelial function in coronary heart disease. Methods:ACE genotype was determined by PCR,and plasma endothelin (ET-1),endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide (EDRF/NO) were meassured in 24 cases of myocardial infarction (MI),56 cases of angina and 65 normal subjects. Results:D allele frequency was increased,compared with normal control (52.1% vs 34.6%,P<0.05), and ET-1/NO ratio was higher in DD homozygotes than in II genotype (0.98±0.32 vs 0.63±0.22,P<0.05) in patients with MI. Conclusion:endothelial dysfunction may related to ACE-DD genotype in patients of MI.
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Key words:angiotensin converting enzyme;polymorphism of gene;endotheila function;coronary disease
近年来基础与临床研究表明，血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与多种心血管疾病相关[1]，但与内皮功能的关系国内外报道尚少，本研究采用多聚酶链反应(PCR)技术对80例冠心病患者、65例正常人的ACE基因型及血浆内皮素(ET)、内皮源性舒张因子(EDRF)进行了检测，以探讨ACE基因多态性与冠心病的相关性。
1 对象和方法
1.1 对象 分为3组：心肌梗死组：24例，均为我院心内科住院患者，心梗后1～24个月，男13例，女11例，年龄39～72岁，平均61±9岁，其中12例并发高血压，6例并发糖尿病，4例并发高脂血症，心功能均为Ⅰ-Ⅱ级。心绞痛组：56例，来源同上，男24例，女22例，年龄38～75岁，平均58±11岁，9例进行了冠脉造影，并发高血压32例，糖尿病15例，高脂血症10例，心功能均为Ⅰ-Ⅱ级。正常对照组：65例，男35例，女30例，年龄25～60岁，平均43±10岁，均来自健康体检者，无心脑血管疾病，肝肾功能正常。
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1.2 方法
1.2.1 DNA提取 取外周静脉血5 ml,EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，饱和盐析法提取DNA，DNA纯度A260/A280>1.8。
1.2.2 ACE基因多态性检测 采用PCR方法，扩增ACE基因第16内含子，引物设计：
Sense 5′-CTGCAGACCACTCCCATCCTTTCT-
3′；Antisense 5′-GATGTGGCCATCACAT
TCGTCAGAT-3′。反应总体积25 μl，其中包括基因组DNA 50 ng,Primer 10 pmol/L,10×Buffer 2.5 μl,1 u Taq酶，50 ml/L二甲基亚砜1 μl。应用PE公司System9700PCR仪扩增，95℃变性60 s，58℃复性90 s，72℃延伸90 s，循环45次。PCR产物在20 ml/L琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察。
, 百拇医药
1.2.3 ET测定 采用放射免疫的方法，药盒购于东亚免疫技术研究所。
1.2.4 EDRF测定 用一氧化氮间接测定方法，药盒购于解放军总医院，批内CV<6.21%,批间CV<8.75%。
1.3 统计学处理 实验数据以
±s表示，显著性检验计数资料用χ2检验，计量资料用t检验。2 结果
2.1 ACE基因型分布 根据PCR扩增结果，ACE基因型分为DD型(缺失纯合子)、II型(插入纯合子)、ID型(杂合子)。各组基因型的分布未见显著差异(P>0.05)，但心肌梗死组D等位基因频率显著高于正常对照组(表1)。
表 1 血管紧张素转化酶基因型分布
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基因型[例数(%)]
等位基因频率(%)
组别
n
DD
ID
II
D
I
心肌梗死组
24
8(33.3)
9(37.5)
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7(29.2)
52.1
47.9
心绞痛组
56
15(26.8)
16(28.6)
25(44.6)
41.1
58.9
正常对照组
65
12(18.5)
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21(32.3)
32(49.2)
34.6
64.4
与正常对照组比较，P<0.052.2 内皮功能检测 心肌梗死组ACE基因为DD型时，其内皮功能ET/NO值明显升高(表2).
表 2 内皮功能检测结果
DD型
II型
ID型
组别
ET(pg/ml)
, 百拇医药
NO(μmol/L)
ET/NO
ET(pg/ml)
NO(μmol/L)
ET/NO
ET(pg/ml)
NO(μmol/L)
ET/NO
心肌梗死组
77±28
85±33
0.98±0.32a
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68±26
127±75
0.63±0.22
44±16a
85±47
0.47±0.19
心绞痛组
75±35
88±41
0.90±0.26a
58±25
112±57
, 百拇医药
0.56±0.21
45±19
106±52
0.50±0.27
正常对照组
35±14
68±17
0.56±0.34
37±17
72±33
0.57±0.26
37±16
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60±26
0.61±0.39
与同组II型比较，aP<0.053 讨论
人ACE基因位于染色体17q23上，通过检测其16内含子287 bp DNA片段的插入/缺失(I/D)分为DD型、II型、ID型。文献报道，ACE基因DD型与冠心病尤其是心肌梗死密切相关，在冠心病患者中D等位基因频率明显增加[2,3]，本研究三种基因型分布组间比较无差异(P>0.05)，虽然心肌梗死组DD型较正常对照组高，但无统计学意义(P>0.05)，然而D等位基因频率在心肌梗死组明显增加(52.1%对34.6%,P<0.05)，与国内外学者报道一致。而心绞痛组D等位基因频率虽然较正常对照组高，但统计学上无显著性差异，可能与病例人选标准不同有关，文献报道的心绞痛患者经冠脉造影证实[4]，本研究中只有9例做了冠脉造影，其余均为临床诊断。
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ACE基因DD型与冠心病心肌梗死密切相关，但其分子水平机制仍不清楚。本文用血浆ET与NO比值作为内皮功能指标，对二者之间的关系进行了探讨。ET与NO均由血管内皮分泌，是一对具有拮抗效应的血管活性物质，前者是强烈的血管收缩剂，有类似生长因子的作用，可激活原癌基因的表达，促进平滑肌细胞增殖，参与动脉粥样硬化形成；后者可舒张血管平滑肌细胞，抑制血小板聚集，生理情况下二者保持动态平衡[5]。
本研究结果心肌梗死组DD型ET较II型升高，而NO下降，统计学上虽无显著性差异，但ET/NO比值DD型较II型明显升高(P<0.05)，说明DD型心肌梗死患者内皮功能受损较重。文献报道，ACE基因I/D多态性与血中及淋巴细胞内的ACE浓度有关，随着D等位基因频率的增加，ACE浓度增高[6,7]。ACE是肾素血管紧张素系统重要的组成成分，一方面促使AgI向AgII转化，另一方面作用于激肽缓激肽系统，使缓激肽灭活，前者作用于内皮的ET-1受体，促进ET的释放，后者作用于内皮的β2激肽受体，使NO合成分泌增加。故认为，DD型患者ET/NO比值升高可能与DD型血中ACE活性升高有关，也是DD型易患心肌梗死的可能机理之一。
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本研究还发现心绞痛组DD型ET/NO比值也较II型明显升高(P<0.05)，而D等位基因频率与正常对照组比较无显著性差异，冠心病患者ID型ET/NO比值并非介于DD型、II型之间，正常对照组DD型、II型、ID型间ET，NO，ET/NO无显著性差异，因此DD型易患心肌梗死与其内皮功能受损较重有关的结论尚不能肯定。因为影响ET，NO水平的因素很多，除遗传、年龄、心功能外，还与血压水平、其他血管活性物质等因素有关，ACE基因多态性受种族地区的影响，因此ACE基因多态性与内皮功能的关系还需要一个样本更大的人群，入选标准尽可能统一，以便进一步做前瞻性研究。
参考文献：
[1] Staessen JA,Wang JG,Gincchio G,et al. The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and cardiovascular-renal risk[J]. J Hypertens,1997,15(12Pt2):1579.
, 百拇医药
[2] Mattu RK,Edward WA,Galton DJ,et al. A DNA variant at the ACE gene locus associated with coronary artery disease in the Gaerphilly Heart Study[J]. Circulation,1995,91(2):270.
[3] 郑豪义，戴玉华，邱长春. 血管紧张素转化酶基因的插入/缺失多态性与其血清水平及心肌梗死的关系[J]. 中华心血管杂志，1997，25(1)：34.
[4] Nakai K,Itoh C,Miura Y,et al. Deletion polymorphism of the angiotensin I-converting enzyme gene is associated with serum ACE concentration and increased risk for coronary artery disease in the Japanese[J]. Circulation,1994,90(5):2199
, 百拇医药
[5] 韩启德，文允镒. 血管生物学[M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：33～36.
[6] Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al. Evidence from combined segregation and linkage analysis,that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels[J]. Am J Hum Genet,1992,51(1):197.
[7] Costerousse O,Allegrini J,Lopez M,et al. Angiotensin I-converting enzyme in human circulating mononuclear cells:genetic polymorphism of expression in T-lymphocytes[J]. Biochem J,1993,290(Pt1):33.
收稿 1999-03-17
修回 1999-12-28, http://www.100md.com