新型降钙素的分子设计
作者：张玉彬 吴梧桐 王旻 吴滔
单位：中国药科大学生物制药学院，南京 210009
关键词：降钙素；新型降钙素；分子设计
中国药物化学杂志000212 摘要 以人和鲑鱼降钙素为先导物，根据多肽类药物设计原理，借助多肽蛋白质计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物，简称新型降钙素.计算机分析结果表明:该新型降钙素等电点提高(pI 8.7),C-末端亲水性增加，抗原表位分析图谱与人降钙素的相同.利用基因工程法制备新型降钙素，并经Western blotting分析表明它与人降钙素分子的抗原性相似.
The Molecular Design of a Novel Human Calcitonin Analogue
Zhang Yubin Wu Wutong Wang Min Wu Tao
, 百拇医药
(College of Biopharmaceutics,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract Based on current biological and structural data of calcitonins from different species,it was hypothesized that the pI value and hydrophilicity of C-termini might be important for the higher bioactivity of calcitonins.The human calcitonin analogues were produced by site-mutating hCT amino acid residuals with selected amino acids present in the sCT.Then these designed hCT analogues were analysed and predicted by the Computer Aid Design Technology(CAD).This approach allowed us to generate the novel hCT analogue (nCT) that displayed substantial increases in pI and the hydrophilicity of C-termini and had the same immunological character as hCT.
, 百拇医药
Key words calcitonin;human calcitonin analogue;molecular design
降钙素是临床治疗骨质疏松症的有效药物，它可抑制破骨细胞增殖，阻止骨溶解，促进骨形成，并有镇痛作用.此外，降钙素还能治疗高血钙症和变形性骨炎〔1〕.目前临床主要使用鲑鱼降钙素，它是迄今为止人类发现的活性最高的降钙素.鲑鱼降钙素是非人源性的多肽类药物，长期使用会产生抗体，降低疗效.而天然人降钙素活性低，仅为鲑鱼降钙素活性的2%，且半衰期短.多肽类药物是一类重要的生化药物，为增加天然多肽药物的疗效，国内外对其类似物设计、合成的研究报道很多，有些产品已成功开发上市〔2〕.多肽蛋白类药物设计时除考虑增加活性外，还必须十分重视新分子抗原性的研究.本研究以人和鲑鱼降钙素为先导物，根据多肽类药物设计原理，借助多肽蛋白计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物〔Val8，Arg24〕-hCT，简称新型降钙素，以期获得活性高、半衰期长、无抗原性的新型降钙素.利用基因工程法表达制备了该新型降钙素，Western blotting分析表明它的抗原性与人降钙素的抗原性非常相似〔3〕，大鼠体内降血钙试验表明其活性比天然人降钙素活性增加.实验结果表明该新型降钙素的分子设计合理，达到了设计要求.本文主要报道新型降钙素的分子设计原理和方法.
, 百拇医药
1 分子设计
1.1 新型降钙素的分子结构
根据多肽药物设计原理，结合前人的工作经验，作者提出了提高分子等电点pI和增加人降钙素C-末端亲水性可以提高新型降钙素活性的假设.以人和鲑鱼降钙素为先导物，设计了大量的人降钙素类似物，然后利用Goldkey蛋白质分析计算软件〔4〕(军事医学科学院基础医学研究所)，逐一分析它们的等电点pI、亲水性和抗原性，以最终确定符合设计要求的新型降钙素.
将设计的各种人降钙素类似物运用计算机分析软件进行分析计算，得到符合设计要求的人降钙素类似物〔Val8,Arg24〕-hCT，简称为新型降钙素，并用nCT(novel human calcitonin analogue)表示.它将人降钙素的8位Met置换为Val,24位Gln换成Arg，其它位置的氨基酸残基与人降钙素的相同.新型降钙素分子中置换的两个氨基酸残基Val,Arg正好是鲑鱼降钙素分子相应位置的氨基酸残基.新型降钙素(nCT)、人降钙素(hCT,human calcitonin)和鲑鱼降钙素(sCT,salmon calcitonin)分子结构见图1，分子中1，7半胱氨酸残基间形成二硫键.
, 百拇医药
nCT:CGNLSTCVLGTYTQDFNKFHTFPRTAIGVGAP-NH2
hCT:CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2
sCT:CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2
Fig.1 The amino acid sequence of nCT,hCT and sCT
1.2 等电点pI值分析
当降钙素净电荷为零时，溶液的pH值即为它的等电点pI值.Goldkey软件分析计算结果表明新型降钙素(nCT)的等电点pI值为8.7，比天然人降钙素(hCT)等电点pI 7.14有所提高，但仍不及鲑鱼降钙素(sCT)的等电点pI 9.47,等电点分析计算结果见图2.
, 百拇医药
Fig.2 pI of nCT,hCT and sCT
1.3 亲水性分析
Goldkey程序中共有5种蛋白质亲水性分析刻度，选用其中的HPLC刻度作为本研究的分析方法.新型降钙素(nCT)、人降钙素(hCT)和鲑鱼降钙素(sCT)的亲水性分析结果见图3,新型降钙素的C-末端亲水性比人降钙素的有所增加.
Fig.3 Hydrophilicity of nCT,hCT and sCT
1.4 抗原性表位预测
多肽及蛋白质抗原通过表位体现其免疫特异性〔5〕.形成多肽蛋白质抗原位点的氨基酸残基具有某些理化特性，Goldkey蛋白多肽分析程序利用Wellings的蛋白质氨基酸抗原性统计参数，分析多肽蛋白质的抗原表位.新型降钙素、人和鲑鱼降钙素的抗原表位预测结果见图4.新型降钙素(nCT)与人降钙素(hCT)的抗原表位分析图谱相同，而鲑鱼降钙素(sCT)的抗原表位图谱与之相差很大.用兔抗人降钙素抗体进行Western blotting实验，观察到抗原抗体反应非常迅速、灵敏，表明新型降钙素保留了人降钙素的抗原性特征〔3，6〕.
, 百拇医药
Fig.4 Epitope prediction of nCT,hCT and sCT
2 讨论
随着现代生物技术的发展和应用，多肽类药物已成为一类重要的临床用药.国内外对天然多肽药物类似物的研究开发非常重视.由于多肽蛋白类药物结构的复杂性，目前主要根据多肽蛋白质类药物作用的原理，结合前人的研究经验，作出合理的设计，然后借助计算机软件作出辅助性分析判断，计算机辅助设计在新药研究中发挥着越来越重要的作用.
降钙素作为药物在体内发挥作用，首先必须有一定的溶解度，才能有好的生物利用度.天然人降钙素的等电点pI值为7.14，接近人体液的生理pH值，在此条件下很容易形成沉淀和聚合体，必将降低它的生物利用度和生物活性.据报道人降钙素分子形成的聚合体为直径8 nm的纤维体，在体内这种聚合体很难解聚，在体外要在50%的乙酸溶液中加热方可溶解〔7〕.本研究设计的新型降钙素在24位引进Arg，计算机分析表明它的等电点pI值提高到8.7，这将有效地抑制降钙素多聚体的形成，增加生物利用度，延长半衰期.
, 百拇医药
降钙素通过与破骨细胞膜上的受体结合而发挥生理作用，因此降钙素必须从水相转移到膜相，这是一个非特异性过程，它需要降钙素具有一定的疏水性.降钙素分子8～22位间的氨基酸残基形成一个两性α-螺旋结构区域.这种一侧具有亲水性、一侧具有疏水性的螺旋结构是决定降钙素与细胞膜结合的关键结构.鲑鱼降钙素形成两性α-螺旋的能力最强.因此，早期研究试图通过增加中间区域形成两性α-螺旋的能力来提高降钙素类似物的活性.Kaiser等运用Chou-Fusman法则设计并合成多种降钙素类似物，其形成两性α-螺旋的能力大大增强，但活性并没有增加〔8〕.理论推测若分子中形成两性α-螺旋的能力增强，则分子的柔顺性减低，这将影响降钙素与受体的特异性结合，而降低活性.近年来，通过对降钙素受体基因的克隆与受体结构的研究，发现降钙素C-末端的亲水性影响着它与受体的结合〔9〕.因此，作者提出了增加降钙素的等电点pI值和提高分子C-末端的亲水性可增加降钙素活性的假设，并以此作为本研究中新型降钙素分子设计的指导思想.
本研究在分子设计时非常重视新型降钙素的抗原性问题，对所设计的各种降钙素类似物首先进行抗原表位预测，使设计分子的抗原性与人的降钙素抗原性相似，以期获得具有治疗价值的高活性新型降钙素.文献报道注射人降钙素给大鼠、豚鼠所获得的特异性抗体，能辨认出人降钙素第11～18位氨基酸序列，故推测降钙素分子中段的氨基酸结构与降钙素的免疫活性相关最大〔10〕.这与本文报道的抗原表位分析预测结果相一致.基因工程制备新型降钙素时，采用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达系统，该系统具有表达产量高、纯化快速简便以及融合的外源基因产物仍保留其原有免疫原性结构的特点〔11〕.因此，可以用融合蛋白直接对新型降钙素进行Western blotting快速分析，以实现对新型降钙素抗原性的早期实验分析.
, http://www.100md.com
国家科技部医药技术创新博士基金资助项目(95-B-11)
参考文献
1，张玉彬,吴梧桐,吴文俊.降钙素的研究进展.中国药学杂志，1996，31(8)：451～454
2，Kelley WS.Therapeautic peptides.Bio/Technology,1996,14(1):28～30
3，张玉彬，吴滔，王,等.新型降钙素的基因合成和克隆表达.药物生物技术，1999，6(3):129～134
4，宋建勋，朱锡华，陈克敏.人Fas抗原表位预测.免疫学杂志，1999，15(1)：14～16
5，刘茂昌，吴玉章，朱锡华，等.乙肝病毒新型免疫原性多肽的设计、合成.免疫学杂志，1998，14(2)：98～100
, 百拇医药
6，胡明，杨毅，李伯良，等.高效融合表达中载体蛋白对hIGF-Ⅰ免疫原性结构形成的影响.生物化学与生物物理学报，1994，26(5)：469～474
7，Arvinte T,Cudd A,Drake AF.The structure and mechanism of formation of human calcitonin fibrils.J Biol Chem,1993,268(9):6415～6422
8，Moe GR, Miller RJ, Kaiser ET.Design of a peptide hormone.J Am Chem Soc,1983,105∶4100～4102
9，Gorn AH, Lin HY, Yamin M, et al.Cloning,characterization,and expression of human calcitonin receptor.J Clin Invest,1992,90(5)∶1726～1730
10，刘忠厚.骨质疏松症.北京：化学工业出版社，1992.113
11，刘惠，李载平，俞贤明.乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报，1994，26(5):513～518
收稿日期:2000-02-12, http://www.100md.com
单位：中国药科大学生物制药学院，南京 210009
关键词：降钙素；新型降钙素；分子设计
中国药物化学杂志000212 摘要 以人和鲑鱼降钙素为先导物，根据多肽类药物设计原理，借助多肽蛋白质计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物，简称新型降钙素.计算机分析结果表明:该新型降钙素等电点提高(pI 8.7),C-末端亲水性增加，抗原表位分析图谱与人降钙素的相同.利用基因工程法制备新型降钙素，并经Western blotting分析表明它与人降钙素分子的抗原性相似.
The Molecular Design of a Novel Human Calcitonin Analogue
Zhang Yubin Wu Wutong Wang Min Wu Tao
, 百拇医药
(College of Biopharmaceutics,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract Based on current biological and structural data of calcitonins from different species,it was hypothesized that the pI value and hydrophilicity of C-termini might be important for the higher bioactivity of calcitonins.The human calcitonin analogues were produced by site-mutating hCT amino acid residuals with selected amino acids present in the sCT.Then these designed hCT analogues were analysed and predicted by the Computer Aid Design Technology(CAD).This approach allowed us to generate the novel hCT analogue (nCT) that displayed substantial increases in pI and the hydrophilicity of C-termini and had the same immunological character as hCT.
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Key words calcitonin;human calcitonin analogue;molecular design
降钙素是临床治疗骨质疏松症的有效药物，它可抑制破骨细胞增殖，阻止骨溶解，促进骨形成，并有镇痛作用.此外，降钙素还能治疗高血钙症和变形性骨炎〔1〕.目前临床主要使用鲑鱼降钙素，它是迄今为止人类发现的活性最高的降钙素.鲑鱼降钙素是非人源性的多肽类药物，长期使用会产生抗体，降低疗效.而天然人降钙素活性低，仅为鲑鱼降钙素活性的2%，且半衰期短.多肽类药物是一类重要的生化药物，为增加天然多肽药物的疗效，国内外对其类似物设计、合成的研究报道很多，有些产品已成功开发上市〔2〕.多肽蛋白类药物设计时除考虑增加活性外，还必须十分重视新分子抗原性的研究.本研究以人和鲑鱼降钙素为先导物，根据多肽类药物设计原理，借助多肽蛋白计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物〔Val8，Arg24〕-hCT，简称新型降钙素，以期获得活性高、半衰期长、无抗原性的新型降钙素.利用基因工程法表达制备了该新型降钙素，Western blotting分析表明它的抗原性与人降钙素的抗原性非常相似〔3〕，大鼠体内降血钙试验表明其活性比天然人降钙素活性增加.实验结果表明该新型降钙素的分子设计合理，达到了设计要求.本文主要报道新型降钙素的分子设计原理和方法.
, 百拇医药
1 分子设计
1.1 新型降钙素的分子结构
根据多肽药物设计原理，结合前人的工作经验，作者提出了提高分子等电点pI和增加人降钙素C-末端亲水性可以提高新型降钙素活性的假设.以人和鲑鱼降钙素为先导物，设计了大量的人降钙素类似物，然后利用Goldkey蛋白质分析计算软件〔4〕(军事医学科学院基础医学研究所)，逐一分析它们的等电点pI、亲水性和抗原性，以最终确定符合设计要求的新型降钙素.
将设计的各种人降钙素类似物运用计算机分析软件进行分析计算，得到符合设计要求的人降钙素类似物〔Val8,Arg24〕-hCT，简称为新型降钙素，并用nCT(novel human calcitonin analogue)表示.它将人降钙素的8位Met置换为Val,24位Gln换成Arg，其它位置的氨基酸残基与人降钙素的相同.新型降钙素分子中置换的两个氨基酸残基Val,Arg正好是鲑鱼降钙素分子相应位置的氨基酸残基.新型降钙素(nCT)、人降钙素(hCT,human calcitonin)和鲑鱼降钙素(sCT,salmon calcitonin)分子结构见图1，分子中1，7半胱氨酸残基间形成二硫键.
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nCT:CGNLSTCVLGTYTQDFNKFHTFPRTAIGVGAP-NH2
hCT:CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2
sCT:CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2
Fig.1 The amino acid sequence of nCT,hCT and sCT
1.2 等电点pI值分析
当降钙素净电荷为零时，溶液的pH值即为它的等电点pI值.Goldkey软件分析计算结果表明新型降钙素(nCT)的等电点pI值为8.7，比天然人降钙素(hCT)等电点pI 7.14有所提高，但仍不及鲑鱼降钙素(sCT)的等电点pI 9.47,等电点分析计算结果见图2.
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Fig.2 pI of nCT,hCT and sCT
1.3 亲水性分析
Goldkey程序中共有5种蛋白质亲水性分析刻度，选用其中的HPLC刻度作为本研究的分析方法.新型降钙素(nCT)、人降钙素(hCT)和鲑鱼降钙素(sCT)的亲水性分析结果见图3,新型降钙素的C-末端亲水性比人降钙素的有所增加.
Fig.3 Hydrophilicity of nCT,hCT and sCT
1.4 抗原性表位预测
多肽及蛋白质抗原通过表位体现其免疫特异性〔5〕.形成多肽蛋白质抗原位点的氨基酸残基具有某些理化特性，Goldkey蛋白多肽分析程序利用Wellings的蛋白质氨基酸抗原性统计参数，分析多肽蛋白质的抗原表位.新型降钙素、人和鲑鱼降钙素的抗原表位预测结果见图4.新型降钙素(nCT)与人降钙素(hCT)的抗原表位分析图谱相同，而鲑鱼降钙素(sCT)的抗原表位图谱与之相差很大.用兔抗人降钙素抗体进行Western blotting实验，观察到抗原抗体反应非常迅速、灵敏，表明新型降钙素保留了人降钙素的抗原性特征〔3，6〕.
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Fig.4 Epitope prediction of nCT,hCT and sCT
2 讨论
随着现代生物技术的发展和应用，多肽类药物已成为一类重要的临床用药.国内外对天然多肽药物类似物的研究开发非常重视.由于多肽蛋白类药物结构的复杂性，目前主要根据多肽蛋白质类药物作用的原理，结合前人的研究经验，作出合理的设计，然后借助计算机软件作出辅助性分析判断，计算机辅助设计在新药研究中发挥着越来越重要的作用.
降钙素作为药物在体内发挥作用，首先必须有一定的溶解度，才能有好的生物利用度.天然人降钙素的等电点pI值为7.14，接近人体液的生理pH值，在此条件下很容易形成沉淀和聚合体，必将降低它的生物利用度和生物活性.据报道人降钙素分子形成的聚合体为直径8 nm的纤维体，在体内这种聚合体很难解聚，在体外要在50%的乙酸溶液中加热方可溶解〔7〕.本研究设计的新型降钙素在24位引进Arg，计算机分析表明它的等电点pI值提高到8.7，这将有效地抑制降钙素多聚体的形成，增加生物利用度，延长半衰期.
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降钙素通过与破骨细胞膜上的受体结合而发挥生理作用，因此降钙素必须从水相转移到膜相，这是一个非特异性过程，它需要降钙素具有一定的疏水性.降钙素分子8～22位间的氨基酸残基形成一个两性α-螺旋结构区域.这种一侧具有亲水性、一侧具有疏水性的螺旋结构是决定降钙素与细胞膜结合的关键结构.鲑鱼降钙素形成两性α-螺旋的能力最强.因此，早期研究试图通过增加中间区域形成两性α-螺旋的能力来提高降钙素类似物的活性.Kaiser等运用Chou-Fusman法则设计并合成多种降钙素类似物，其形成两性α-螺旋的能力大大增强，但活性并没有增加〔8〕.理论推测若分子中形成两性α-螺旋的能力增强，则分子的柔顺性减低，这将影响降钙素与受体的特异性结合，而降低活性.近年来，通过对降钙素受体基因的克隆与受体结构的研究，发现降钙素C-末端的亲水性影响着它与受体的结合〔9〕.因此，作者提出了增加降钙素的等电点pI值和提高分子C-末端的亲水性可增加降钙素活性的假设，并以此作为本研究中新型降钙素分子设计的指导思想.
本研究在分子设计时非常重视新型降钙素的抗原性问题，对所设计的各种降钙素类似物首先进行抗原表位预测，使设计分子的抗原性与人的降钙素抗原性相似，以期获得具有治疗价值的高活性新型降钙素.文献报道注射人降钙素给大鼠、豚鼠所获得的特异性抗体，能辨认出人降钙素第11～18位氨基酸序列，故推测降钙素分子中段的氨基酸结构与降钙素的免疫活性相关最大〔10〕.这与本文报道的抗原表位分析预测结果相一致.基因工程制备新型降钙素时，采用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达系统，该系统具有表达产量高、纯化快速简便以及融合的外源基因产物仍保留其原有免疫原性结构的特点〔11〕.因此，可以用融合蛋白直接对新型降钙素进行Western blotting快速分析，以实现对新型降钙素抗原性的早期实验分析.
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国家科技部医药技术创新博士基金资助项目(95-B-11)
参考文献
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4，宋建勋，朱锡华，陈克敏.人Fas抗原表位预测.免疫学杂志，1999，15(1)：14～16
5，刘茂昌，吴玉章，朱锡华，等.乙肝病毒新型免疫原性多肽的设计、合成.免疫学杂志，1998，14(2)：98～100
, 百拇医药
6，胡明，杨毅，李伯良，等.高效融合表达中载体蛋白对hIGF-Ⅰ免疫原性结构形成的影响.生物化学与生物物理学报，1994，26(5)：469～474
7，Arvinte T,Cudd A,Drake AF.The structure and mechanism of formation of human calcitonin fibrils.J Biol Chem,1993,268(9):6415～6422
8，Moe GR, Miller RJ, Kaiser ET.Design of a peptide hormone.J Am Chem Soc,1983,105∶4100～4102
9，Gorn AH, Lin HY, Yamin M, et al.Cloning,characterization,and expression of human calcitonin receptor.J Clin Invest,1992,90(5)∶1726～1730
10，刘忠厚.骨质疏松症.北京：化学工业出版社，1992.113
11，刘惠，李载平，俞贤明.乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报，1994，26(5):513～518
收稿日期:2000-02-12, http://www.100md.com