水溶性O-羧甲基壳聚糖的制备
作者：邵健 杨宇民
单位：邵健(南通医学院化学教研室，南通226001)；杨宇民(卫生化学教研室，南通226001)
关键词：O-羧甲基壳聚糖；壳聚糖；氯乙酸
南通医学院学报000217 [摘 要] 目的：合成一种完全水溶的壳聚糖衍生物—O-羧甲基壳聚糖。方法：在碱性条件下，用氯乙酸修饰粉末状的壳聚糖，得到产物。结果：产物经元素分析、FT-IR分析，证实其结构与预期相吻合。结论：该法所得O-羧甲基壳聚糖具有优越的水溶性能。
[中图分类号] O621.15 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0155-02
STUDY ON THE PREPARATION OF WATER-SOLUBLE O-(CARBOXYMETHYL)CHITOSAN
, 百拇医药
SHAO Jian
(Department of Chemistry,Nantong Medical College,Nantong226001)
YANG Yumin
(Derpartment of Hygienic Analytical Chemistry,Nantong Medical College,Nantong226001)
[Abstract] Objective：Warter-soluble O-(carboxymethyl)chitosan was prepared.Method: Powdery chitosan was modified by monochloroacetate under alkaline condition.Result：The structure of the product was confirmed by elemental analysis and IR.spectra analysis. Conclution:The product has superior water-soluble property.
, 百拇医药
[Key words] O-(Carboxymethyl) chitosan;chitosan;monochloroacetate
为了增加壳聚糖的水溶性，本文在常温及碱性条件下，用氯乙酸对壳聚糖进行化学修饰，并对其产物—O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl chitosan，O-CM chitosan)的结构进行了表征。所得产物的水溶性较壳聚糖有极大改善，并可在任何pH值条件下溶解于水。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器 甲壳素购自南通市水产品研究所，其余试剂均为分析纯。元素分析仪为Carlo Erba 1106型，红外光谱仪为Nicolet Tmimpact 410型。
1.2 方法
1.2.1 高脱乙酰度壳聚糖的制备 将蟹壳状甲壳素用粉碎机粉碎成20目左右的小碎片。取一定量此碎片加入到50%(W/V)氢氧化钠水溶液中(溶液能完全浸泡甲壳素即可)。放置7天，每天加热至沸半小时。最后，滤出不溶物，水洗至中性后晾干。
, http://www.100md.com
1.2.2 粉末状碱性壳聚糖的制备 取10g上述壳聚糖溶于1%乙酸水溶液200ml中，抽滤除去不溶物。搅拌下往滤液中滴加1mol/L的氢氧化钠溶液至体系pH=8～9，可得大量的呈短纤维状壳聚糖沉淀。抽滤，并将沉淀移入高速组织捣碎机中，加入100ml 40%(W/V)氢氧化钠溶液，以12000r/min的速度匀浆6分钟，得悬浊液。移入塑料烧杯中，于-18℃下冷冻过夜。解冻后得碱性壳聚糖。
1.2.3 O-羧甲基壳聚糖的制备 将上述解冻了的悬浊液移入1000ml三颈瓶中，加入300ml无水乙醇。于室温下边搅拌、边滴加含11g氯乙酸的乙醇溶液，反应5小时后停止。抽滤出白色沉淀，用90%乙醇多次洗涤至洗出液中无氯离子(取少许洗出液加入0.1mol/L的硝酸银溶液，如有白色沉淀，则氯离子未除尽)。用少量丙酮淋洗3次后于室温下真空干燥备用。
1.3 测定及产物结构的表征 1.3.1 壳聚糖及产物的分子量测定 本文采用粘度法[1]分别测定了壳聚糖及O-羧甲基壳聚糖的粘均分子量。对于壳聚糖：用0.2mol/L NaCl-0.1mol/L CH3COOH水溶液作为溶剂，配制成一系列的、一定浓度的壳聚糖溶液，移入乌氏粘度计中，在25℃的水浴中测定溶液在乌氏粘度计的毛细管中下落的时间，换算成特性粘度[η]。根据Ghobad的粘度公式[2]：[η]=1.81×10-3Mη0.93,可计算出壳聚糖的粘均分子量 Mη。对于产物，将溶剂改为0.1mol/L的NaCl水溶液，并在30℃的水浴中测定，粘度方程式改为Nishimura的公式[3]：[η]=7.92×10-5Mη1.0。
, http://www.100md.com
1.3.2 壳聚糖脱乙酰度测定 采用碘作吸附指示剂，酸碱滴定法测定了壳聚糖的脱乙酰度[4]。
1.3.3 产物取代度的测定 采用Muzzarelli报道的元素分析法[5]计算取代度。
1.3.4 产物结构的表征 红外光谱采用溴化钾压片法，在4000～400cm-1范围内扫描。
2 结 果
2.1 壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖的红外光谱 见图1、图2。
2.2 O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖的元素分析
测试结果见表1。壳聚糖每个单体结构上被羧甲基化的基团的平均数称为取代度。O-羧甲基壳聚糖的取代度可用元素分析、光谱分析和电位滴定等方法来测定。我们采用元素分析法计算产物的取代度，结果为0.7左右。
, 百拇医药
表1 O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖的元素分析测试结果
理论值(%)
测定值(%)
N
H
C
N
H
C
壳聚糖
O-羧甲基壳聚糖
8.7
5.8
, http://www.100md.com
6.8
4.9
44.7
39.8
8.7
6.8
7.0
5.4
44.2
40.9
2.3 本法所得的O-羧甲基壳聚糖为白色粉末，在空气中易吸湿。溶于纯水后为中性溶液，并可溶解于碱性水溶液中。
, http://www.100md.com
图1 壳聚糖的红外光谱图
图2 O-羧甲基壳聚糖的红外光谱图
3 讨 论
目前，在药用佐剂、化妆品素材、金属离子螯合剂及果蔬保鲜剂等方面所用到的大分子物质通常都是人工合成的高分子材料，而采用天然大分子物质替代或补充这些合成高分子物质已势在必行。在已知的天然物质中，生物多糖甲壳素(chitin)的表现较为突出。由于它具有无毒、无味、生物相容性好及可降解等特性，在上述各领域中正逐渐受到重视[6]。但是，由于甲壳素分子内具有强烈的氢键作用及晶型结构，使得它完全不溶于水及其它常见溶剂，即使是它的脱乙酰产物——壳聚糖(Chitosan)，也只能溶于一些酸性溶液中。这在很大程度上限制了它们的应用。所以，水溶性甲壳素衍生物的研制正成为一个新的研究方向。
, http://www.100md.com
壳聚糖的化学命名为聚[2-氨基-2-脱氧-β-1,4-D-葡萄糖]。其单体2-C上的氨基及3-C、6-C上的羟基均具有较强的反应活性，在适当的条件下可进行多种化学修饰。但在一般条件下，羟基的反应活性(尤其是6-C上的羟基)比氨基的大[7]，故在低温下进行反应，可得O-羧甲基壳聚糖，反应方程式见下式：
O-羧甲基壳聚糖在1408cm-1处和1300cm-1处存在着两个吸收峰，它们是羧基的C-O伸缩振动和羟基的面内变形偶合振动吸收峰。而壳聚糖的红外光谱中未见这两个吸收峰，这充分说明壳聚糖改性后在其单体上引入了羧基。另外，从两个物质的红外光谱图也可看出：在1650cm-1～1560cm-1处的-NH2变形振动峰以及在1240cm-1～1030cm-1处的C-N伸缩振动峰变化不明显。这也说明了反应未在氨基上进行，产物为O-位取代的羧甲基化产物。
, 百拇医药
本反应类似于Willamson法制备醚的反应[8]，即壳聚糖分子中羟基首先要和氢氧化钠键合，形成活性中心(Chitosan-O-Na+)后才可和氯乙酸反应。故碱化是整个反应的关键。碱化程度越高，越有利于反应的进行。我们采用高速搅拌和冷冻处理使壳聚糖的碱化程度大大提高[8]。高速搅拌是利用高速组织捣碎机所提供的高剪切力，使壳聚糖的一级结构和高级结构受到破坏。从而以微颗粒形式分散于水中形成悬浊液。这样，壳聚糖的表面积大大增加，使得颗粒表面所含羟基数也剧增。冷冻处理是让渗入壳聚糖分子内部的水凝固成冰，由于此过程中水的体积要增大，部分地破坏了壳聚糖分子内部的氢键，并进一步破坏它的高级结构，从而使壳聚糖的颗粒无论是表面还是分子内部均呈多孔结构，使得羟基被进一步裸露。我们曾试验过在室温下进行碱化，所得产品的水溶性较差。
氢氧化钠溶液的浓度对产品的品质，尤其是对分子量影响较大。浓度过低，则碱化难以完全，产品的水溶性较差。而氢氧化钠的浓度过大，则在碱化及反应过程中都会使壳聚糖严重降解，造成分子量的急剧下降。本文碱化时采用40%(W/V)的氢氧化钠溶液，所得O-羧甲基壳聚糖的分子量变化不大，粘均分子量由原来壳聚糖的1.2×104降为产物的1.0×104。对于大分子化合物来说，可以认为分子量未变化。
, http://www.100md.com
由于采用低温碱化以及高速搅拌等步骤，优化了壳聚糖的碱化条件，我们得到了取代度较高的O-羧甲基壳聚糖。另外，基于在大分子链中引入了大量的-CH2COOH基团除取代基团体积的大小对分子溶解性等性质影响外，酸性基团-COOH的引入，还增加了产物在碱性溶液中的溶解度。产品不仅水溶速度大大提高，而且可在任何pH值下溶于水，溶解度也满足了其使用时的需要，从而扩展了甲壳素的应用范围。
[参考文献]
[1] 陈鲁生,周 武,姜云生.壳聚糖粘均分子量的测定[J].化学通报,1996,4∶57.
[2] Maghami GG,Reberts GAF.Evalution of the viscometric constants for chitosan[J]. Makromol Chem,1988,189∶195.
, http://www.100md.com [3] Nishimura NS,Nishi N,Tokure S.Bioactive chitin derivatives[J]. Carbohydr Res,1986,146∶251.
[4] 杨宇民,邵 健.用碘作吸附指示剂测定壳聚糖的脱乙酰度[J].南通医学院学报,1995,15(2)∶335.
[5] Muzzarelli R A A,Tanfani F,Emanuelli M,et al.N-(carboxymethylidene) chitosans and N-(carboxymethyl)-chitosan:Novel chelating polyampholytes obtained from chitosan glyoxylate[J]. Carbohydr Res,1982,107∶199.
[6] 邵 健,杨宇民,徐秉洳.甲壳素和壳聚糖在生物医学方面的应用[J].南通医学院学报,1997,17(1)∶145.
[7] 陈西广,刘万顺,刘晨光.几丁质的研究进展[J].生物工程进展,1997,17(3)∶5.
[8] 邢其毅主编.基础有机化学(上册)[M].北京:高等教育出版社,1993.351.
[9] 屈步华,李德平,朱 役.一种球状甲壳素的制造方法[J].中国生化药物杂志,1995,16(2)∶68.
(1999-03-25收稿), http://www.100md.com
单位：邵健(南通医学院化学教研室，南通226001)；杨宇民(卫生化学教研室，南通226001)
关键词：O-羧甲基壳聚糖；壳聚糖；氯乙酸
南通医学院学报000217 [摘 要] 目的：合成一种完全水溶的壳聚糖衍生物—O-羧甲基壳聚糖。方法：在碱性条件下，用氯乙酸修饰粉末状的壳聚糖，得到产物。结果：产物经元素分析、FT-IR分析，证实其结构与预期相吻合。结论：该法所得O-羧甲基壳聚糖具有优越的水溶性能。
[中图分类号] O621.15 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0155-02
STUDY ON THE PREPARATION OF WATER-SOLUBLE O-(CARBOXYMETHYL)CHITOSAN
, 百拇医药
SHAO Jian
(Department of Chemistry,Nantong Medical College,Nantong226001)
YANG Yumin
(Derpartment of Hygienic Analytical Chemistry,Nantong Medical College,Nantong226001)
[Abstract] Objective：Warter-soluble O-(carboxymethyl)chitosan was prepared.Method: Powdery chitosan was modified by monochloroacetate under alkaline condition.Result：The structure of the product was confirmed by elemental analysis and IR.spectra analysis. Conclution:The product has superior water-soluble property.
, 百拇医药
[Key words] O-(Carboxymethyl) chitosan;chitosan;monochloroacetate
为了增加壳聚糖的水溶性，本文在常温及碱性条件下，用氯乙酸对壳聚糖进行化学修饰，并对其产物—O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl chitosan，O-CM chitosan)的结构进行了表征。所得产物的水溶性较壳聚糖有极大改善，并可在任何pH值条件下溶解于水。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器 甲壳素购自南通市水产品研究所，其余试剂均为分析纯。元素分析仪为Carlo Erba 1106型，红外光谱仪为Nicolet Tmimpact 410型。
1.2 方法
1.2.1 高脱乙酰度壳聚糖的制备 将蟹壳状甲壳素用粉碎机粉碎成20目左右的小碎片。取一定量此碎片加入到50%(W/V)氢氧化钠水溶液中(溶液能完全浸泡甲壳素即可)。放置7天，每天加热至沸半小时。最后，滤出不溶物，水洗至中性后晾干。
, http://www.100md.com
1.2.2 粉末状碱性壳聚糖的制备 取10g上述壳聚糖溶于1%乙酸水溶液200ml中，抽滤除去不溶物。搅拌下往滤液中滴加1mol/L的氢氧化钠溶液至体系pH=8～9，可得大量的呈短纤维状壳聚糖沉淀。抽滤，并将沉淀移入高速组织捣碎机中，加入100ml 40%(W/V)氢氧化钠溶液，以12000r/min的速度匀浆6分钟，得悬浊液。移入塑料烧杯中，于-18℃下冷冻过夜。解冻后得碱性壳聚糖。
1.2.3 O-羧甲基壳聚糖的制备 将上述解冻了的悬浊液移入1000ml三颈瓶中，加入300ml无水乙醇。于室温下边搅拌、边滴加含11g氯乙酸的乙醇溶液，反应5小时后停止。抽滤出白色沉淀，用90%乙醇多次洗涤至洗出液中无氯离子(取少许洗出液加入0.1mol/L的硝酸银溶液，如有白色沉淀，则氯离子未除尽)。用少量丙酮淋洗3次后于室温下真空干燥备用。
1.3 测定及产物结构的表征 1.3.1 壳聚糖及产物的分子量测定 本文采用粘度法[1]分别测定了壳聚糖及O-羧甲基壳聚糖的粘均分子量。对于壳聚糖：用0.2mol/L NaCl-0.1mol/L CH3COOH水溶液作为溶剂，配制成一系列的、一定浓度的壳聚糖溶液，移入乌氏粘度计中，在25℃的水浴中测定溶液在乌氏粘度计的毛细管中下落的时间，换算成特性粘度[η]。根据Ghobad的粘度公式[2]：[η]=1.81×10-3Mη0.93,可计算出壳聚糖的粘均分子量 Mη。对于产物，将溶剂改为0.1mol/L的NaCl水溶液，并在30℃的水浴中测定，粘度方程式改为Nishimura的公式[3]：[η]=7.92×10-5Mη1.0。
, http://www.100md.com
1.3.2 壳聚糖脱乙酰度测定 采用碘作吸附指示剂，酸碱滴定法测定了壳聚糖的脱乙酰度[4]。
1.3.3 产物取代度的测定 采用Muzzarelli报道的元素分析法[5]计算取代度。
1.3.4 产物结构的表征 红外光谱采用溴化钾压片法，在4000～400cm-1范围内扫描。
2 结 果
2.1 壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖的红外光谱 见图1、图2。
2.2 O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖的元素分析
测试结果见表1。壳聚糖每个单体结构上被羧甲基化的基团的平均数称为取代度。O-羧甲基壳聚糖的取代度可用元素分析、光谱分析和电位滴定等方法来测定。我们采用元素分析法计算产物的取代度，结果为0.7左右。
, 百拇医药
表1 O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖的元素分析测试结果
理论值(%)
测定值(%)
N
H
C
N
H
C
壳聚糖
O-羧甲基壳聚糖
8.7
5.8
, http://www.100md.com
6.8
4.9
44.7
39.8
8.7
6.8
7.0
5.4
44.2
40.9
2.3 本法所得的O-羧甲基壳聚糖为白色粉末，在空气中易吸湿。溶于纯水后为中性溶液，并可溶解于碱性水溶液中。
, http://www.100md.com
图1 壳聚糖的红外光谱图
图2 O-羧甲基壳聚糖的红外光谱图
3 讨 论
目前，在药用佐剂、化妆品素材、金属离子螯合剂及果蔬保鲜剂等方面所用到的大分子物质通常都是人工合成的高分子材料，而采用天然大分子物质替代或补充这些合成高分子物质已势在必行。在已知的天然物质中，生物多糖甲壳素(chitin)的表现较为突出。由于它具有无毒、无味、生物相容性好及可降解等特性，在上述各领域中正逐渐受到重视[6]。但是，由于甲壳素分子内具有强烈的氢键作用及晶型结构，使得它完全不溶于水及其它常见溶剂，即使是它的脱乙酰产物——壳聚糖(Chitosan)，也只能溶于一些酸性溶液中。这在很大程度上限制了它们的应用。所以，水溶性甲壳素衍生物的研制正成为一个新的研究方向。
, http://www.100md.com
壳聚糖的化学命名为聚[2-氨基-2-脱氧-β-1,4-D-葡萄糖]。其单体2-C上的氨基及3-C、6-C上的羟基均具有较强的反应活性，在适当的条件下可进行多种化学修饰。但在一般条件下，羟基的反应活性(尤其是6-C上的羟基)比氨基的大[7]，故在低温下进行反应，可得O-羧甲基壳聚糖，反应方程式见下式：
O-羧甲基壳聚糖在1408cm-1处和1300cm-1处存在着两个吸收峰，它们是羧基的C-O伸缩振动和羟基的面内变形偶合振动吸收峰。而壳聚糖的红外光谱中未见这两个吸收峰，这充分说明壳聚糖改性后在其单体上引入了羧基。另外，从两个物质的红外光谱图也可看出：在1650cm-1～1560cm-1处的-NH2变形振动峰以及在1240cm-1～1030cm-1处的C-N伸缩振动峰变化不明显。这也说明了反应未在氨基上进行，产物为O-位取代的羧甲基化产物。
, 百拇医药
本反应类似于Willamson法制备醚的反应[8]，即壳聚糖分子中羟基首先要和氢氧化钠键合，形成活性中心(Chitosan-O-Na+)后才可和氯乙酸反应。故碱化是整个反应的关键。碱化程度越高，越有利于反应的进行。我们采用高速搅拌和冷冻处理使壳聚糖的碱化程度大大提高[8]。高速搅拌是利用高速组织捣碎机所提供的高剪切力，使壳聚糖的一级结构和高级结构受到破坏。从而以微颗粒形式分散于水中形成悬浊液。这样，壳聚糖的表面积大大增加，使得颗粒表面所含羟基数也剧增。冷冻处理是让渗入壳聚糖分子内部的水凝固成冰，由于此过程中水的体积要增大，部分地破坏了壳聚糖分子内部的氢键，并进一步破坏它的高级结构，从而使壳聚糖的颗粒无论是表面还是分子内部均呈多孔结构，使得羟基被进一步裸露。我们曾试验过在室温下进行碱化，所得产品的水溶性较差。
氢氧化钠溶液的浓度对产品的品质，尤其是对分子量影响较大。浓度过低，则碱化难以完全，产品的水溶性较差。而氢氧化钠的浓度过大，则在碱化及反应过程中都会使壳聚糖严重降解，造成分子量的急剧下降。本文碱化时采用40%(W/V)的氢氧化钠溶液，所得O-羧甲基壳聚糖的分子量变化不大，粘均分子量由原来壳聚糖的1.2×104降为产物的1.0×104。对于大分子化合物来说，可以认为分子量未变化。
, http://www.100md.com
由于采用低温碱化以及高速搅拌等步骤，优化了壳聚糖的碱化条件，我们得到了取代度较高的O-羧甲基壳聚糖。另外，基于在大分子链中引入了大量的-CH2COOH基团除取代基团体积的大小对分子溶解性等性质影响外，酸性基团-COOH的引入，还增加了产物在碱性溶液中的溶解度。产品不仅水溶速度大大提高，而且可在任何pH值下溶于水，溶解度也满足了其使用时的需要，从而扩展了甲壳素的应用范围。
[参考文献]
[1] 陈鲁生,周 武,姜云生.壳聚糖粘均分子量的测定[J].化学通报,1996,4∶57.
[2] Maghami GG,Reberts GAF.Evalution of the viscometric constants for chitosan[J]. Makromol Chem,1988,189∶195.
, http://www.100md.com [3] Nishimura NS,Nishi N,Tokure S.Bioactive chitin derivatives[J]. Carbohydr Res,1986,146∶251.
[4] 杨宇民,邵 健.用碘作吸附指示剂测定壳聚糖的脱乙酰度[J].南通医学院学报,1995,15(2)∶335.
[5] Muzzarelli R A A,Tanfani F,Emanuelli M,et al.N-(carboxymethylidene) chitosans and N-(carboxymethyl)-chitosan:Novel chelating polyampholytes obtained from chitosan glyoxylate[J]. Carbohydr Res,1982,107∶199.
[6] 邵 健,杨宇民,徐秉洳.甲壳素和壳聚糖在生物医学方面的应用[J].南通医学院学报,1997,17(1)∶145.
[7] 陈西广,刘万顺,刘晨光.几丁质的研究进展[J].生物工程进展,1997,17(3)∶5.
[8] 邢其毅主编.基础有机化学(上册)[M].北京:高等教育出版社,1993.351.
[9] 屈步华,李德平,朱 役.一种球状甲壳素的制造方法[J].中国生化药物杂志,1995,16(2)∶68.
(1999-03-25收稿), http://www.100md.com