促甲状腺激素测定的方法学进展——在新生儿甲状腺机能低下症筛查中的应用
作者：申红梅
单位：申红梅(中国地方病防治研究中心，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：
中国地方病学杂志000228 中图分类号 Q575+.14
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0153-03▲
1973年Dussalt[1]首次报道了用T4进行新生儿先天性甲低筛查，不久Klein及其同事[2]通过脐带血TSH浓度测定开展了此项研究工作。此后，在北美、欧洲、澳大利亚及日本等发达国家都广泛开展了新生儿先天性甲低筛查，现在一些发展中国家也进行了本病筛查，我国的一些城市也在一定范围内开展了这项工作[3，4]。本文将综合介绍TSH测定的方法学进展、评价指标及其在新生儿先天性甲低筛查中的应用。
, 百拇医药
1 放射免疫测定方法
Utiger等于1963年报道的TSH放射免疫测定方法(RIA)开创了TSH定量测定的先河。1974年Klein等[2]将TSH RIA应用于新生儿先天性甲低筛查中，并建立了干血滤纸片TSH放射免疫测定方法。RIA为竞争性测定方法，用放射性核素标记抗原，待测抗原与标记抗源竞争结合有限量的抗体。这种方法灵敏度不高，血清分析灵敏度为0.5mU/L左右，而纸片法大约为它的10倍，即5mU/L[5]。
2 免疫放射测定方法
传统的竞争性RIA方法逐渐被所谓的超灵敏免疫放射测定方法(IRMA)所取代[5～8]。IRMA方法属于非竞争性双位点技术，放射性核素标记的是抗体，由于单克隆抗体的应用，使测定TSH的IRMA方法得到进一步完善，应用针对抗原分子中的2个不同决定簇的2种单克隆抗体分别作为固相抗体和标记抗体，2次抗原抗体反应同时进行，形成抗原在中间两边是抗体的“三明治”式夹心结构。IRMA方法的灵敏度比第1代TSH RIA方法高大约10倍，可达0.1mU/L以下，纸片法可达1mU/L。1982年Sutherland等人建立了干血滤纸片TSH IRMA方法，并用于新生儿先天性甲低筛查[9]。以后将磁性颗粒应用到分析中，使测定方法更简便，逐步在世界各地的筛查实验室中应用于新生儿先天性甲低筛查。
, 百拇医药
John等[6]报道了用双位点IRMA方法进行干血滤纸片TSH测定，其中99.9%TSH水平<10mU/L，假阳性结果1例，有6例确诊为新生儿甲低，发生率为1/4200。
3 酶免疫测定方法
在RIA及IRMA方法中所使用的标记物为放射性同位素I25I。因此，这2种方法均存在放射性污染、放射损伤及货架期较短等缺点。随着TSH测定方法的不断发展，出现了其它应用标记物的测定方法。首先发展起来的酶免疫测定方法(EIA)[10]，采用酶做标记物，如辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶等。EIA方法一般可分为2类，在均相EIA和非均相EIA。均相EIA中，游离抗原和结合抗原不需要分离，而在非均相EIA(也称酶联免疫吸附测定，ELISA)中，免疫反应结束后，需要将游离抗原和结合抗原分离。因ELISA方法的灵敏度较高，可达0.1mU/L，被认为与IRMA方法等效。
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目前用于干血滤纸片TSH测定的ELISA方法，与IRMA方法的双抗体夹心法相似，将特异性抗体吸附或包被在固相载体表面上，然后加入抗原，温育后，抗原与抗体在固相载体表面结合形成免疫复合物，经洗涤除去多余抗原，再加入酶标记抗体，形成固相抗体—抗原—酶标记抗体复合物，最后加入酶底物，酶与底物反应产生有色物质，用分光光度法测出抗原即TSH含量。
4 荧光免疫测定方法
荧光免疫测定技术(FIA)是70年代发展起来的，与放射免疫测定及酶免疫测定不同的是标记物和检测方法。荧光免疫测定方法的标记物是荧光素，用荧光分光度计测定荧光强度。在FIA方法中，一些干扰因素如本底荧光、激发光源的杂散光等影响测定，使灵敏度受到很大限制。80年代以来发展起来的时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)[11]，克服了这些因素的干扰，灵敏度较高，可达0.025mU/L，纸片法为1mU/L。TR-FIA又被称为解离放大镧系荧光免疫分析(DELFIA)，其标记物不是荧光素，而是稀土金属镧系，如铕(Eu)最常用。Eu的衰变时间与样品或环境的荧光干扰物质的荧光衰变时间相差几个数量级，测定时可以延缓测定时间，在短寿命的本底荧光衰变完后，对长寿命的Eu螯合物的荧光进行测定，这样可以有效地消除本底荧光的干扰。TR-FIA TSH测定是固相双位点夹心型，采用2种单克隆抗体，一种是固相化了的单克隆抗体，直接与TSH分子β-亚基上的特异抗原位点结合，另一种是Eu标记的单克隆抗体，结合部位为TSH的另一个抗原位点，此抗原位点部分位于α-亚基，部分位于β-亚基。
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Toni等[11]报道以TR-FIA方法测定了11 531例新生儿干血滤纸片，其中99.7%<25mU/L，复查的37例(0.3%)中，有6例(16%)最后确诊为原发性甲低，12例(33%)为生理性增高，剩下的19例复查证实为正常。单次测定后的假阳性率仅为0.16%，此方法适用于大规模甲低筛查。
近年来，有人报道了将酶放大作用与TR-FIA结合，建立了高敏感的测定方法，称为酶放大时间分辨荧光免疫测定(EATR-FIA)[12]，其灵敏度可达0.003mU/L。
5 免疫化学发光测定
80年代后期发展起来的TSH免疫化学发光测定方法(ICMA)[13，14]，以化学发光分子做标记物，将一种单克隆抗体固定在聚苯乙烯试管或磁性颗粒上，另一种单克隆抗体直接用化学发光分子标记。测定时，同时加入血样和标记抗全，TSH与固相抗体及标记抗体反应形成夹心，游离抗体与结合抗体通过自动清洗或磁性分离分开。在自动照度计上，用过氧化氢将标记的化学发光分子激活，测定2秒内累积发射光子数。ICMA方法灵敏、准确、操作简便，灵敏度可达0.003mU/L。
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Euico等人[15]用ICMA方法进行新生儿甲低筛查，4 219例新生儿中，4 217例正常，2例TSH异常者，最后均确诊为先天性甲低，没有假阳性结果。
6 方法学评价指标
随着方法学的不断进步，人们也将评价指标重新规定并提出了新的指标[7，14]，以往通用的灵敏度(最低检出限)，即零标准点测定10次的平均值±2S所对应的TSH含量，被称为分析灵敏度(analytical sensitivity)。引入了新的指标功能灵敏度(functional sensitivity,或interassay sensitivity)定义为批间变异系数为20%时所对应的TSH含量。功能灵敏度这一新的方法学指标的引入，使分析方法的测定下限规定在较稳定的1点，比分析灵敏度更严格。
按功能灵敏度的差异,人们将TSH测定方法分为4代[16]。第1代测定方法：功能灵敏度为1～2mU/L，即RIA方法；第2代测定方法：功能灵敏度为0.1～0.2mU/L，以IRMA、ELISA方法为代表；第3代测定方法：功能灵敏度为0.01～0.02mU/L，以ICMA、TR-FIA方法为代表；第4代测定方法：功能灵敏度为0.001～0.002mU/L，是改进的ICMA方法。Spencer等[16]通过对TSH ICMA方法操作程序的改变，使其功能灵敏度达到了0.001～0.002mU/L，适用于TSH值极低时在临床上应用。
, 百拇医药
在发达国家一般采集出生后3～5天新生儿足跟血测定TSH，而发展中国家更愿意采用测定脐带血TSH水平进行甲低筛查。在欧洲及北美，TSH筛查甲低发生率为1/3 500[17]，而在严重缺碘地区，甲低筛出率比发达国家高出100～300倍，并且TSH水平处于亚临床状态的明显偏多，经人群补碘后，这部分新生儿的比率下降，逐渐接近非缺碘地区。因此，在缺碘地区，测定新生儿TSH水平即可用于新生儿先天性甲低筛查，同时又可以作为人群碘营养状况的评价指标。不论是以筛查还是以监测为主要目的，采用的TSH测定方法都应是灵敏的方法。
近年来还出现了一些新的TSH测定方法，如免疫电化学发光测定[18]、发光免疫酶测定[19]、扫描显微镜免疫测定[20]等。随着TSH测定方法的不断发展，新生儿先天性甲低筛查将会更加完善，使每一个甲低患儿均被筛出，并得到及时的治疗。■
作者简介：申红梅，女，1963年生，副教授，硕士
, 百拇医药
参考文献
[1] Dussalut JH,and Laberge C.Dosage de la thyroxine (T4) par methode de depistage de L'hypothyroidie neonatale[J]?Union Med Can,1973,102:2062.
[2] Klein AH,Agustin AV and Foley TP.Successful screening for congenital hypothyroidism[J].Lancet,1974,2:77.
[3] 庄 梅，时立新，马启玲，等.脐血TSH-IRMA测定在新生儿甲状腺功能低减筛查中的应用[J].贵州医药，1995，19(3)：141-142.
[4] 王振华，顾玉海，张建婷，等.青海省东部新生儿TSH水平观察[J].地方病通报，1991，6(1)：82-84.
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[5] Illig R,Torresani T,and Sobradillo B.Early detection of neonatal hypothyroidism by serial TSH determination in dried blood[J].Helv Paediatr Acta,1977,32:289.
[6] John Rhys,and Wodhead JS.An automated immunoradiometric assay of thyrotropin(TSH) in dried blood filter paper spots[J].Clin Chim Acta,1982,125(3):329-340.
[7] Pilo A,Zucchelli GC.Interassay variability of immunometric methods for thyrotropin in an external quality assessment survey:Evidence that functional sensitivity is not always adequate for clinical decisions[J].Clin Chem,1992,38:1345-1349.
, 百拇医药
[8] Jirkalova V,Cap J.Immunoradiometric and luminescence immunoenzymometric assay of human thyrotropin from dried blood spots for screening of neonatal hypothyroidism[J].Eur J Clin Chem Biochem,1996,34(10):823-827.
[9] Sutherland RM,Ratcliffe JG,and Chapman RS.Immunoassay of blood spot TSH:development of a rapid two-site immunoradiometric assay and comparison with radioimmunoassay as a screening method for neonatal hypothyroidism[J].Clin Chim Acta,1982,124:1-11.
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[10] Yuehchu T,Kenneth DB,et al.A rapid,sensitive enzyme-linked immunoassay for human thyrotropin[J].Clin Chem,1985,31:1131-1134.
[11] Toni ET,Rudolf S.Thyroid screening of neonates without use of radioactivity:evaluation of time-resolved fluoroimmunoassay of thyrotropin[J].Clin Chem,1986,32:1013-1016.
[12] Anastasia PD,Theodore KC,Eleftherios PD.Ultrasensitive thyrotropin immunoassay based on enzymatically amplified time-resolved fluorescence with a terbium chelate[J].Clin Chem,1992,38:545-548.
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[13] Bounaud MP,Bounaud JY,Bouin Pineau MH,et al.Chemiluminescence immunoassay of thyrotropin with acridiniumester-Labeled antibody evaluated and compared with two other immunoassays[J].Clin Chem,1987,33:2096-2100.
[14] Spencer CA,Lopresti JS,Patel A,et al.Applications of a new chemiluminometric thyrotropin assay to subnormal measurement[J].J Clin Endocrinol Metab.1990,70:453-459.
[15] Eurico CN.Neonatal hypothyroidism screening with immunochemilumino-
, http://www.100md.com
metric assay of thyrotropin[J].Clin Chem,1991,37:1796.
[16] Spencer CA,Schwarzbein D,Guttler RB,et al.Thyrotropin(TSH)-releasing hormone stimulation test responses employing third and fourth generation TSH assays[J].J Clin Endocrinol Metab,1993,76:494-498.
[17] Pierre PB,Hong VVT,Philippe AC,et al.Superiority of thyrotropin to thyroxine as a tool in the screening for congenital hypothyroidism by the filter paper spot technique[J].Clin Chem Acta,1990,195:97-106.
, 百拇医药
[18] Sotorrio P,Quiros A,Izquierdo JM.New immunoelectro chemiluminome-
tric assay to measure serum thyro-
tropin[J].Clin Chem,1997,43(12):2428-2430.
[19] Jirkalova V,Cap J,Strakova H,et al.Immunoradiometric and luminescence immunoenzymometric assay of human thyrotropin from dried blood spots for screening of neonatal hypothyroidism[J].Eur J Clin Chem Biochem,1996,34(10):823-827.
[20] Perrin A,Theretz A,Mandrand B.Thyroid stimulating hormone assays based on the detection of gold conjugates by scanning force microscopy[J].Anal Biochem,1998,256(2):200-206.
收稿日期：1999-04-30
修订日期：1999-07-20, http://www.100md.com
单位：申红梅(中国地方病防治研究中心，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：
中国地方病学杂志000228 中图分类号 Q575+.14
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0153-03▲
1973年Dussalt[1]首次报道了用T4进行新生儿先天性甲低筛查，不久Klein及其同事[2]通过脐带血TSH浓度测定开展了此项研究工作。此后，在北美、欧洲、澳大利亚及日本等发达国家都广泛开展了新生儿先天性甲低筛查，现在一些发展中国家也进行了本病筛查，我国的一些城市也在一定范围内开展了这项工作[3，4]。本文将综合介绍TSH测定的方法学进展、评价指标及其在新生儿先天性甲低筛查中的应用。
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1 放射免疫测定方法
Utiger等于1963年报道的TSH放射免疫测定方法(RIA)开创了TSH定量测定的先河。1974年Klein等[2]将TSH RIA应用于新生儿先天性甲低筛查中，并建立了干血滤纸片TSH放射免疫测定方法。RIA为竞争性测定方法，用放射性核素标记抗原，待测抗原与标记抗源竞争结合有限量的抗体。这种方法灵敏度不高，血清分析灵敏度为0.5mU/L左右，而纸片法大约为它的10倍，即5mU/L[5]。
2 免疫放射测定方法
传统的竞争性RIA方法逐渐被所谓的超灵敏免疫放射测定方法(IRMA)所取代[5～8]。IRMA方法属于非竞争性双位点技术，放射性核素标记的是抗体，由于单克隆抗体的应用，使测定TSH的IRMA方法得到进一步完善，应用针对抗原分子中的2个不同决定簇的2种单克隆抗体分别作为固相抗体和标记抗体，2次抗原抗体反应同时进行，形成抗原在中间两边是抗体的“三明治”式夹心结构。IRMA方法的灵敏度比第1代TSH RIA方法高大约10倍，可达0.1mU/L以下，纸片法可达1mU/L。1982年Sutherland等人建立了干血滤纸片TSH IRMA方法，并用于新生儿先天性甲低筛查[9]。以后将磁性颗粒应用到分析中，使测定方法更简便，逐步在世界各地的筛查实验室中应用于新生儿先天性甲低筛查。
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John等[6]报道了用双位点IRMA方法进行干血滤纸片TSH测定，其中99.9%TSH水平<10mU/L，假阳性结果1例，有6例确诊为新生儿甲低，发生率为1/4200。
3 酶免疫测定方法
在RIA及IRMA方法中所使用的标记物为放射性同位素I25I。因此，这2种方法均存在放射性污染、放射损伤及货架期较短等缺点。随着TSH测定方法的不断发展，出现了其它应用标记物的测定方法。首先发展起来的酶免疫测定方法(EIA)[10]，采用酶做标记物，如辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶等。EIA方法一般可分为2类，在均相EIA和非均相EIA。均相EIA中，游离抗原和结合抗原不需要分离，而在非均相EIA(也称酶联免疫吸附测定，ELISA)中，免疫反应结束后，需要将游离抗原和结合抗原分离。因ELISA方法的灵敏度较高，可达0.1mU/L，被认为与IRMA方法等效。
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目前用于干血滤纸片TSH测定的ELISA方法，与IRMA方法的双抗体夹心法相似，将特异性抗体吸附或包被在固相载体表面上，然后加入抗原，温育后，抗原与抗体在固相载体表面结合形成免疫复合物，经洗涤除去多余抗原，再加入酶标记抗体，形成固相抗体—抗原—酶标记抗体复合物，最后加入酶底物，酶与底物反应产生有色物质，用分光光度法测出抗原即TSH含量。
4 荧光免疫测定方法
荧光免疫测定技术(FIA)是70年代发展起来的，与放射免疫测定及酶免疫测定不同的是标记物和检测方法。荧光免疫测定方法的标记物是荧光素，用荧光分光度计测定荧光强度。在FIA方法中，一些干扰因素如本底荧光、激发光源的杂散光等影响测定，使灵敏度受到很大限制。80年代以来发展起来的时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)[11]，克服了这些因素的干扰，灵敏度较高，可达0.025mU/L，纸片法为1mU/L。TR-FIA又被称为解离放大镧系荧光免疫分析(DELFIA)，其标记物不是荧光素，而是稀土金属镧系，如铕(Eu)最常用。Eu的衰变时间与样品或环境的荧光干扰物质的荧光衰变时间相差几个数量级，测定时可以延缓测定时间，在短寿命的本底荧光衰变完后，对长寿命的Eu螯合物的荧光进行测定，这样可以有效地消除本底荧光的干扰。TR-FIA TSH测定是固相双位点夹心型，采用2种单克隆抗体，一种是固相化了的单克隆抗体，直接与TSH分子β-亚基上的特异抗原位点结合，另一种是Eu标记的单克隆抗体，结合部位为TSH的另一个抗原位点，此抗原位点部分位于α-亚基，部分位于β-亚基。
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Toni等[11]报道以TR-FIA方法测定了11 531例新生儿干血滤纸片，其中99.7%<25mU/L，复查的37例(0.3%)中，有6例(16%)最后确诊为原发性甲低，12例(33%)为生理性增高，剩下的19例复查证实为正常。单次测定后的假阳性率仅为0.16%，此方法适用于大规模甲低筛查。
近年来，有人报道了将酶放大作用与TR-FIA结合，建立了高敏感的测定方法，称为酶放大时间分辨荧光免疫测定(EATR-FIA)[12]，其灵敏度可达0.003mU/L。
5 免疫化学发光测定
80年代后期发展起来的TSH免疫化学发光测定方法(ICMA)[13，14]，以化学发光分子做标记物，将一种单克隆抗体固定在聚苯乙烯试管或磁性颗粒上，另一种单克隆抗体直接用化学发光分子标记。测定时，同时加入血样和标记抗全，TSH与固相抗体及标记抗体反应形成夹心，游离抗体与结合抗体通过自动清洗或磁性分离分开。在自动照度计上，用过氧化氢将标记的化学发光分子激活，测定2秒内累积发射光子数。ICMA方法灵敏、准确、操作简便，灵敏度可达0.003mU/L。
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Euico等人[15]用ICMA方法进行新生儿甲低筛查，4 219例新生儿中，4 217例正常，2例TSH异常者，最后均确诊为先天性甲低，没有假阳性结果。
6 方法学评价指标
随着方法学的不断进步，人们也将评价指标重新规定并提出了新的指标[7，14]，以往通用的灵敏度(最低检出限)，即零标准点测定10次的平均值±2S所对应的TSH含量，被称为分析灵敏度(analytical sensitivity)。引入了新的指标功能灵敏度(functional sensitivity,或interassay sensitivity)定义为批间变异系数为20%时所对应的TSH含量。功能灵敏度这一新的方法学指标的引入，使分析方法的测定下限规定在较稳定的1点，比分析灵敏度更严格。
按功能灵敏度的差异,人们将TSH测定方法分为4代[16]。第1代测定方法：功能灵敏度为1～2mU/L，即RIA方法；第2代测定方法：功能灵敏度为0.1～0.2mU/L，以IRMA、ELISA方法为代表；第3代测定方法：功能灵敏度为0.01～0.02mU/L，以ICMA、TR-FIA方法为代表；第4代测定方法：功能灵敏度为0.001～0.002mU/L，是改进的ICMA方法。Spencer等[16]通过对TSH ICMA方法操作程序的改变，使其功能灵敏度达到了0.001～0.002mU/L，适用于TSH值极低时在临床上应用。
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在发达国家一般采集出生后3～5天新生儿足跟血测定TSH，而发展中国家更愿意采用测定脐带血TSH水平进行甲低筛查。在欧洲及北美，TSH筛查甲低发生率为1/3 500[17]，而在严重缺碘地区，甲低筛出率比发达国家高出100～300倍，并且TSH水平处于亚临床状态的明显偏多，经人群补碘后，这部分新生儿的比率下降，逐渐接近非缺碘地区。因此，在缺碘地区，测定新生儿TSH水平即可用于新生儿先天性甲低筛查，同时又可以作为人群碘营养状况的评价指标。不论是以筛查还是以监测为主要目的，采用的TSH测定方法都应是灵敏的方法。
近年来还出现了一些新的TSH测定方法，如免疫电化学发光测定[18]、发光免疫酶测定[19]、扫描显微镜免疫测定[20]等。随着TSH测定方法的不断发展，新生儿先天性甲低筛查将会更加完善，使每一个甲低患儿均被筛出，并得到及时的治疗。■
作者简介：申红梅，女，1963年生，副教授，硕士
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[12] Anastasia PD,Theodore KC,Eleftherios PD.Ultrasensitive thyrotropin immunoassay based on enzymatically amplified time-resolved fluorescence with a terbium chelate[J].Clin Chem,1992,38:545-548.
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[13] Bounaud MP,Bounaud JY,Bouin Pineau MH,et al.Chemiluminescence immunoassay of thyrotropin with acridiniumester-Labeled antibody evaluated and compared with two other immunoassays[J].Clin Chem,1987,33:2096-2100.
[14] Spencer CA,Lopresti JS,Patel A,et al.Applications of a new chemiluminometric thyrotropin assay to subnormal measurement[J].J Clin Endocrinol Metab.1990,70:453-459.
[15] Eurico CN.Neonatal hypothyroidism screening with immunochemilumino-
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metric assay of thyrotropin[J].Clin Chem,1991,37:1796.
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[17] Pierre PB,Hong VVT,Philippe AC,et al.Superiority of thyrotropin to thyroxine as a tool in the screening for congenital hypothyroidism by the filter paper spot technique[J].Clin Chem Acta,1990,195:97-106.
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[20] Perrin A,Theretz A,Mandrand B.Thyroid stimulating hormone assays based on the detection of gold conjugates by scanning force microscopy[J].Anal Biochem,1998,256(2):200-206.
收稿日期：1999-04-30
修订日期：1999-07-20, http://www.100md.com