酮对外源性自由基发生系统加重离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
作者：何泉华 许实波 邓芹英
单位：何泉华(广州蛇毒研究所， 广州 510182)；许实波(中山大学药学系)；邓芹英(中山大学化学与化学工程学院，广州 510275)
关键词：酮；再灌注；心律失常；自由基
广州医学院学报000203 提要 目的：研究从穿心草中提取的三种
酮：1.8-dihydroxy-3，5-dimethoxyxanthone(Xan-I)；1-hydroxy-3，5-dimethoxy-xanthone(Xan-Ⅱ)；1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ)对外源性自由基发生系统加重缺血再灌注损伤的保护作用。方法：在Langendorff心脏模型上于缺血前10min给离体大鼠心脏灌流FeSO4(0.1μmo1/L)/抗坏血酸(1 μmol/L)自由基发生系统，测定室颤发生率和相关生化指标。结果：灌流自由基发生系统后加重大鼠离体心脏再灌注损伤；缺血前给予3种酮，能显著减少自由基发生系统所致再灌注室颤发生率，同时使心肌超氧化物歧化酶活力升高，丙二醛含量降低，灌脉流出液中乳酸脱氢酶含量减少。结论：3种Xan对外源性自由基发生系统加重缺血再灌注损伤有不同程度的保护作用。
, http://www.100md.com
中图分类号 R541 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0011-04
The Protective Effects of Xanthones on Isolated Rat Heart
against Ischemic Reperfusion Damage Exacerbated
by Extrinxic Radical Generating System
He Quanhua
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom,Guangzhou 510182)
, 百拇医药
Xu Shibo
(The Department of Pharmacy,Zhongshan University)
Deng Qinying
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
Objective: To study the protective effects of xanthones:1,8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ),1-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅱ) and 1-hydroxy-3,7,8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ) from Canscora lucidissima on ischemic reperfusion injury exacerbated by FeSO4/Ascorbic acid free radical generating system. Methods:FeSO4(0.1μmol/L)/Ascorbic acid(1μmol/L) were perfused 10 minutes before ischemia and xanthones were perfused prior to the ligation of coronary artery in the Langendorff model. The incidence of ventricular fibrillation,SOD and MDA in myocardium and LDH in coronary flow were measured. Results: It showed that 3 kinds of xanthones (0.2μmol/L) could significantly reduced the incidence of reperfusion ventricular fibrillation exacerbated by FeSO4/Ascorbic acid. At the same time,the level of SOD activity in myocardium was elevated,and the level of MDA was reduced. The content of LDH in coronary flow was also reduced. Conclusion: Xanthones had the protective effects against ischemic reperfusion injury exacerbated by extrinxic radical generating system.
, 百拇医药
Key words Xanthone;Reperfusion;Arrhythmias;Free radicals
据报道，心肌缺血再灌注损伤与缺血心肌再灌注早期大量产生自由基释放有关[1]。以FeSO4/抗坏血酸为自由基产生体系，可加重Langendorff大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用[2]。本实验以上述方法制备实验模型，观察3种Xan对外源性自由基发生体系加重离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用。1 材料与方法
1.1 实验材料
酮(xanthone)：1，8-dihydroxy-3，5-dimethoxyxanthone(Xan-I)；1-hydroxy-3，5-dimethoxy-xanthone(Xan-Ⅱ)；1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ)，呈黄色针状晶体，纯度为99.6%，由中山大学化学化工学院天然有机室提供，使用时以含0.1%的二甲亚砜和0.1%的吐温80双蒸水悬液。LDH试剂盒，SOD试剂盒，MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。还原型谷胱甘肽(GSH)，Serva公司。
, 百拇医药
SD系大鼠，由广东省医用实验动物中心提供。
1.2 实验方法
依照文献[2]，雄性SD大鼠56只，体重200±12g，腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，开胸后迅速取出心脏，浸入到预冷的氧饱和的 Krebs-Henseleit溶液中，分离主动脉，插动脉套管，制备Langendorff灌流心脏，灌流液用改良的Krebs-Henseleit溶液。由于在Langendorff大鼠心脏模型上，再灌注心律失常的发生与K+的浓度关系密切，因此本实验中灌注液K+的浓度被提高到6.5mmol/L，以降低再灌注心律失常的发生率，从而有利于研究外源性自由基发生体系FeSO4/VitC (FeSO4为0.1μmol/L，Vit C为1μmol/L)所产生的自由基对再灌注心律失常的作用。灌流系统的温度控制在37℃，灌流液持续通以95%CO2+5%O2混合气体，pH为7.4，冠脉压力用恒流泵控制在9.8kPa(100cmH2O)，灌流过程中，铂金电极的两极分别置于心脏表面的左上及右下角，记录Ⅱ导联心电图。心脏被灌流平衡10min后，在左心耳的下缘，肺动脉圆锥的左缘之间进针，用丝线结扎左冠状动脉前降支造成心肌缺血，缺血灌流10min后，剪断丝再灌流30min，记录再灌注30min内心律失常发生率和窦性节律时间。
, http://www.100md.com
动物分为7组，每组8只：正常对照组，不进行缺血再灌；缺血再灌对照组，用K-H液预灌15min后，停灌40min，再恢复灌流30min；FeSO4/VitC组，于缺血前10min灌注FeSO4/VitC自由基发生系统，余同对照组；谷胱甘肽组(终浓度0.2μmol/L)、Xan-I(0.2μmol/L)、Xan-Ⅱ(0.2μmol/L)Xan-Ⅲ(0.2μmol/L)，FeSO4(0.1μmol/L)/VitC(1 (1 μmol/L)经振荡温育37℃ 30min后，随同受试药物加入灌流液中，全程灌流至实验结束。收集从再灌流开始3min内冠脉流出液，用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的含量。灌流结束后，取左心室前壁全层心肌0.15g制备10%(W/V)匀浆，按照TBA比色法测定MDA含量。取上述制备的心肌组织匀浆液，按邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。以上三项指标，按试剂盒说明书上的操作方法测定。心肌组织蛋白质的含量以Comassie 法测定。3 结果
, http://www.100md.com
3.1 Xan 对外源性自由基发生系统对离体大鼠心脏缺血再灌注心律失常的影响
FeSO4(0.1μmol/L)/Vit C (1μmol/L)明显增加了再灌注室颤的发生率，缩短窦性节律时间。当在自由基发生体系中加入3种Xan(0.2μmol/L)和GSH(10μmol/L)后，均明显降低了再灌注室颤的发生率，显著延长了窦性节律时间。
表1 Xan 对外源性自由基发生系统对离体大鼠心肌缺血再灌注
心律失常的影响 (
±s，n＝8) 组别
剂量
μmol/L
发生率(%)
, 百拇医药
窦性节律时间(s)
室颤
室速
正常对照
0
0
183±54
缺血再灌对照
12.5##
12.5##
167±43
FeSO4/VitC
, http://www.100md.com
0.1±1
87.5。。
75。。
47±15.4。。
谷胱甘肽+FeSO4/VitC
10+0.1+1
25**
37.5**
138±57**
Xan-Ⅰ+FeSO4/VitC
, http://www.100md.com
0.2+0.1+1
25**
25**
147±69**
Xan-Ⅱ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
75
50*
97±86**
Xan-Ⅲ+FeSO4/VitC
, 百拇医药
0.2+0.1+1
38**
25**
136±73**
与正常对照组比：##P<0.01；与缺血再灌对照组比：。。P<0.01；
与FeSO4/VitC组比：*P<0.05，**P<0.01
3.2 Xan对外源性自由基发生系统对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤时心肌SOD活性、MDA含量和冠脉流出液中LDH含量的影响
FeSO4/VitC促使脂质过氧化的发生，增加MDA的含量，促使LDH的释放，明显降低心肌SOD的活力；在自由基体系中加入3种Xan(0.2μmol/L)后，均显著保护心肌SOD活力，降低心肌MDA含量，减少LDH的释放。表2 Xan对外源性FeSO4/VitC对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的
, 百拇医药
保护作用(±s，n＝5) 组别
剂量
μmol/L
SOD
103U/g protein
LDH
10U/L
MDA
μmol/g protein
正常对照
116±13
, 百拇医药
4.2±2.1
0.10±0.03
模型对照
103±9#
9.6±1.7##
0.16±0.04#
FeSO4/VitC
0.1±1
68±8。。
13.7±3.2。。
, http://www.100md.com 0.47±0.05。。
谷胱甘肽+FeSO4/VitC
10+0.1+1
91±12**
9.8±3.4**
0.26±0.07**
Xan-Ⅰ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
98±13**
9.9±3.6**
, 百拇医药
0.19±0.04**
Xan-Ⅱ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
75±8*
11.7±2.8*
0.33±0.06*
Xan-Ⅲ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
91±11**
10.2±4.2**
, 百拇医药
0.21±0.05**
与正常对照组比：#P<0.05，##P<0.01；与缺血再灌对照组比：。。P<0.01；
与FeSO4/VitC组比：*P<0.05，**P<0.014 讨论
当加入外源性自由基发生体系FeSO4/VitC后，明显加重大鼠心肌缺血再灌损伤作用，表现为室颤发生率显著增加，窦性节律时间缩短，心肌SOD活性降低，LDH释放增加，脂质过氧化产物增加。当自由基发生体系加入3种Xan后，Xan-I和Xan-Ⅲ对上述各项变化有不同程度的逆转作用，而Xan-Ⅱ对室颤的发生没有显著差异。说明0.2μmol/L的Xan-I和Xan-Ⅲ对外源性自由基发生体系FeSO4/VitC加重大鼠离体心脏缺血再灌损伤具有保护作用，而Xan-Ⅱ的作用较弱。
, 百拇医药
氧自由基对心肌的损伤主要是直接使膜产生脂质过氧化和引起钙负荷[2]。前期的工作表明[3]，3种Xan对氧自由基有不同程度的清除作用，从而可推测Xan对外源性自由基加重心肌损伤的保护作用，可能是与其清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应有关。
Xan-Ⅰ和Xan-Ⅲ对上述作用比较Xan-Ⅱ强，可能是与其清除氧自由基的强弱有关，与前期的工作吻合。
作者简介：何泉华，男(1966.2-)，博士。研究方向：天然产物的药学研究。
参考文献
[1] 陈尚恭，句海松.氧自由基与心肌缺血再灌注损伤[J].中国心血管药理通讯，1991；9：11～13
[2] 刘家兰，刘红，李德清等.山莨菪碱对外源性自由基发生系统加重离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报，1993；9(3)：190～193
[3] 何泉华，许实波.穿心草酮抗氧化作用初探[J].中国药理学通报，1998；14(2)：130～133
(收稿：2000-01-15), 百拇医药
单位：何泉华(广州蛇毒研究所， 广州 510182)；许实波(中山大学药学系)；邓芹英(中山大学化学与化学工程学院，广州 510275)
关键词：酮；再灌注；心律失常；自由基
广州医学院学报000203 提要 目的：研究从穿心草中提取的三种
酮：1.8-dihydroxy-3，5-dimethoxyxanthone(Xan-I)；1-hydroxy-3，5-dimethoxy-xanthone(Xan-Ⅱ)；1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ)对外源性自由基发生系统加重缺血再灌注损伤的保护作用。方法：在Langendorff心脏模型上于缺血前10min给离体大鼠心脏灌流FeSO4(0.1μmo1/L)/抗坏血酸(1 μmol/L)自由基发生系统，测定室颤发生率和相关生化指标。结果：灌流自由基发生系统后加重大鼠离体心脏再灌注损伤；缺血前给予3种酮，能显著减少自由基发生系统所致再灌注室颤发生率，同时使心肌超氧化物歧化酶活力升高，丙二醛含量降低，灌脉流出液中乳酸脱氢酶含量减少。结论：3种Xan对外源性自由基发生系统加重缺血再灌注损伤有不同程度的保护作用。, http://www.100md.com
中图分类号 R541 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0011-04
The Protective Effects of Xanthones on Isolated Rat Heart
against Ischemic Reperfusion Damage Exacerbated
by Extrinxic Radical Generating System
He Quanhua
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom,Guangzhou 510182)
, 百拇医药
Xu Shibo
(The Department of Pharmacy,Zhongshan University)
Deng Qinying
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
Objective: To study the protective effects of xanthones:1,8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ),1-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅱ) and 1-hydroxy-3,7,8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ) from Canscora lucidissima on ischemic reperfusion injury exacerbated by FeSO4/Ascorbic acid free radical generating system. Methods:FeSO4(0.1μmol/L)/Ascorbic acid(1μmol/L) were perfused 10 minutes before ischemia and xanthones were perfused prior to the ligation of coronary artery in the Langendorff model. The incidence of ventricular fibrillation,SOD and MDA in myocardium and LDH in coronary flow were measured. Results: It showed that 3 kinds of xanthones (0.2μmol/L) could significantly reduced the incidence of reperfusion ventricular fibrillation exacerbated by FeSO4/Ascorbic acid. At the same time,the level of SOD activity in myocardium was elevated,and the level of MDA was reduced. The content of LDH in coronary flow was also reduced. Conclusion: Xanthones had the protective effects against ischemic reperfusion injury exacerbated by extrinxic radical generating system.
, 百拇医药
Key words Xanthone;Reperfusion;Arrhythmias;Free radicals
据报道，心肌缺血再灌注损伤与缺血心肌再灌注早期大量产生自由基释放有关[1]。以FeSO4/抗坏血酸为自由基产生体系，可加重Langendorff大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用[2]。本实验以上述方法制备实验模型，观察3种Xan对外源性自由基发生体系加重离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用。1 材料与方法
1.1 实验材料
酮(xanthone)：1，8-dihydroxy-3，5-dimethoxyxanthone(Xan-I)；1-hydroxy-3，5-dimethoxy-xanthone(Xan-Ⅱ)；1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyxanthone(Xan-Ⅲ)，呈黄色针状晶体，纯度为99.6%，由中山大学化学化工学院天然有机室提供，使用时以含0.1%的二甲亚砜和0.1%的吐温80双蒸水悬液。LDH试剂盒，SOD试剂盒，MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。还原型谷胱甘肽(GSH)，Serva公司。, 百拇医药
SD系大鼠，由广东省医用实验动物中心提供。
1.2 实验方法
依照文献[2]，雄性SD大鼠56只，体重200±12g，腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，开胸后迅速取出心脏，浸入到预冷的氧饱和的 Krebs-Henseleit溶液中，分离主动脉，插动脉套管，制备Langendorff灌流心脏，灌流液用改良的Krebs-Henseleit溶液。由于在Langendorff大鼠心脏模型上，再灌注心律失常的发生与K+的浓度关系密切，因此本实验中灌注液K+的浓度被提高到6.5mmol/L，以降低再灌注心律失常的发生率，从而有利于研究外源性自由基发生体系FeSO4/VitC (FeSO4为0.1μmol/L，Vit C为1μmol/L)所产生的自由基对再灌注心律失常的作用。灌流系统的温度控制在37℃，灌流液持续通以95%CO2+5%O2混合气体，pH为7.4，冠脉压力用恒流泵控制在9.8kPa(100cmH2O)，灌流过程中，铂金电极的两极分别置于心脏表面的左上及右下角，记录Ⅱ导联心电图。心脏被灌流平衡10min后，在左心耳的下缘，肺动脉圆锥的左缘之间进针，用丝线结扎左冠状动脉前降支造成心肌缺血，缺血灌流10min后，剪断丝再灌流30min，记录再灌注30min内心律失常发生率和窦性节律时间。
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动物分为7组，每组8只：正常对照组，不进行缺血再灌；缺血再灌对照组，用K-H液预灌15min后，停灌40min，再恢复灌流30min；FeSO4/VitC组，于缺血前10min灌注FeSO4/VitC自由基发生系统，余同对照组；谷胱甘肽组(终浓度0.2μmol/L)、Xan-I(0.2μmol/L)、Xan-Ⅱ(0.2μmol/L)Xan-Ⅲ(0.2μmol/L)，FeSO4(0.1μmol/L)/VitC(1 (1 μmol/L)经振荡温育37℃ 30min后，随同受试药物加入灌流液中，全程灌流至实验结束。收集从再灌流开始3min内冠脉流出液，用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的含量。灌流结束后，取左心室前壁全层心肌0.15g制备10%(W/V)匀浆，按照TBA比色法测定MDA含量。取上述制备的心肌组织匀浆液，按邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。以上三项指标，按试剂盒说明书上的操作方法测定。心肌组织蛋白质的含量以Comassie 法测定。3 结果
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3.1 Xan 对外源性自由基发生系统对离体大鼠心脏缺血再灌注心律失常的影响
FeSO4(0.1μmol/L)/Vit C (1μmol/L)明显增加了再灌注室颤的发生率，缩短窦性节律时间。当在自由基发生体系中加入3种Xan(0.2μmol/L)和GSH(10μmol/L)后，均明显降低了再灌注室颤的发生率，显著延长了窦性节律时间。
表1 Xan 对外源性自由基发生系统对离体大鼠心肌缺血再灌注
心律失常的影响 (
±s，n＝8) 组别剂量
μmol/L
发生率(%)
, 百拇医药
窦性节律时间(s)
室颤
室速
正常对照
0
0
183±54
缺血再灌对照
12.5##
12.5##
167±43
FeSO4/VitC
, http://www.100md.com
0.1±1
87.5。。
75。。
47±15.4。。
谷胱甘肽+FeSO4/VitC
10+0.1+1
25**
37.5**
138±57**
Xan-Ⅰ+FeSO4/VitC
, http://www.100md.com
0.2+0.1+1
25**
25**
147±69**
Xan-Ⅱ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
75
50*
97±86**
Xan-Ⅲ+FeSO4/VitC
, 百拇医药
0.2+0.1+1
38**
25**
136±73**
与正常对照组比：##P<0.01；与缺血再灌对照组比：。。P<0.01；
与FeSO4/VitC组比：*P<0.05，**P<0.01
3.2 Xan对外源性自由基发生系统对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤时心肌SOD活性、MDA含量和冠脉流出液中LDH含量的影响
FeSO4/VitC促使脂质过氧化的发生，增加MDA的含量，促使LDH的释放，明显降低心肌SOD的活力；在自由基体系中加入3种Xan(0.2μmol/L)后，均显著保护心肌SOD活力，降低心肌MDA含量，减少LDH的释放。表2 Xan对外源性FeSO4/VitC对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的
, 百拇医药
保护作用(
±s，n＝5) 组别剂量
μmol/L
SOD
103U/g protein
LDH
10U/L
MDA
μmol/g protein
正常对照
116±13
, 百拇医药
4.2±2.1
0.10±0.03
模型对照
103±9#
9.6±1.7##
0.16±0.04#
FeSO4/VitC
0.1±1
68±8。。
13.7±3.2。。
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谷胱甘肽+FeSO4/VitC
10+0.1+1
91±12**
9.8±3.4**
0.26±0.07**
Xan-Ⅰ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
98±13**
9.9±3.6**
, 百拇医药
0.19±0.04**
Xan-Ⅱ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
75±8*
11.7±2.8*
0.33±0.06*
Xan-Ⅲ+FeSO4/VitC
0.2+0.1+1
91±11**
10.2±4.2**
, 百拇医药
0.21±0.05**
与正常对照组比：#P<0.05，##P<0.01；与缺血再灌对照组比：。。P<0.01；
与FeSO4/VitC组比：*P<0.05，**P<0.014 讨论
当加入外源性自由基发生体系FeSO4/VitC后，明显加重大鼠心肌缺血再灌损伤作用，表现为室颤发生率显著增加，窦性节律时间缩短，心肌SOD活性降低，LDH释放增加，脂质过氧化产物增加。当自由基发生体系加入3种Xan后，Xan-I和Xan-Ⅲ对上述各项变化有不同程度的逆转作用，而Xan-Ⅱ对室颤的发生没有显著差异。说明0.2μmol/L的Xan-I和Xan-Ⅲ对外源性自由基发生体系FeSO4/VitC加重大鼠离体心脏缺血再灌损伤具有保护作用，而Xan-Ⅱ的作用较弱。
, 百拇医药
氧自由基对心肌的损伤主要是直接使膜产生脂质过氧化和引起钙负荷[2]。前期的工作表明[3]，3种Xan对氧自由基有不同程度的清除作用，从而可推测Xan对外源性自由基加重心肌损伤的保护作用，可能是与其清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应有关。
Xan-Ⅰ和Xan-Ⅲ对上述作用比较Xan-Ⅱ强，可能是与其清除氧自由基的强弱有关，与前期的工作吻合。
作者简介：何泉华，男(1966.2-)，博士。研究方向：天然产物的药学研究。
参考文献
[1] 陈尚恭，句海松.氧自由基与心肌缺血再灌注损伤[J].中国心血管药理通讯，1991；9：11～13
[2] 刘家兰，刘红，李德清等.山莨菪碱对外源性自由基发生系统加重离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报，1993；9(3)：190～193
[3] 何泉华，许实波.穿心草
酮抗氧化作用初探[J].中国药理学通报，1998；14(2)：130～133(收稿：2000-01-15), 百拇医药