人血管抑素cDNA在酿酒酵母中的表达和分泌
作者：卢文菊 罗进贤 刘向辉 张朝琴 陈柏铭
单位：卢文菊(广州医学院检验系，广州 510182)；罗进贤(中山大学生命科学学院，广州 510275)；刘向辉(广州医学院检验系，广州 510182)；张朝琴(广州医学院检验系，广州 510182)；陈柏铭(广州医学院检验系，广州 510182)
关键词：血管抑素；基因表达与分泌；酿酒酵母
广州医学院学报000202 提要 目的：在酿酒酵母中表达和分泌人血管抑素。方法：应用DNA重组技术构建重组质粒；质粒DNA转化酵母用醋酸锂法；以纤溶酶原抗血清为第一抗体，采用ELISA方法检测表达产物。结果：将MFα1信号肽和人血管抑素融合基因序列插入酵母表达载体pMA91的Bg1Ⅱ位点，构建了重组表达质粒pMAA2，转化酿酒酵母GRF18后获得工程菌GRF18(pMAA2)，其培养上清液ELISA分析阳性。结论：人血管抑素在GRF18(pMAA2)中得到表达，产物分泌至细胞外，能够与纤溶酶原抗血清发生特异的免疫反应。
, 百拇医药
中图分类号 R394.8 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0007-04
Secretive Expression of Human Angiostatin
cDNA in S. cerevisiae
Lu Wenju，Liu Xianghui
(Department of Medical Laboratory,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182)
Luo Jinxian
(School of Life Science,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
, 百拇医药
Objective:To express and secrete human angiostatin in S. cerevisiae. Methods:DNA recombinant technique was used to construct recombinant plasmid,which was then transformed into yeast by lithium acetate method. The expression product was detected with ELISA. Results:The fused sequence of MFα1 signal peptide coding region and human angiostatin cDNA was inserted into the Bg1 Ⅱ site on the shuttle vector pMA91 to form the plasmid pMAA2,which was then transformed into S. cerevisiae GRF18. ELISA analysis showed that the culture supernatant of the engineering train S. cerevisiae GRF18 (pMAA2) reacted positively with human plasminogen antisera. Conclusion:Angiostatin was successfully expressed in S. cerevisiae and secreted out to the culture.
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Key words Angiostatin;Expression and secretion;Shacharomyses cerevisiae
血管抑素(Angiostatin，AGN)是1994年发现的一种新型血管生成抑制因子，对肿瘤生长和转移有很强的抑制作用[1，2]。除肿瘤外，糖尿病眼底病、消化道溃疡、关节炎等多种疾病的进展与血管生成密切相关，AGN将有广泛的应用前景。AGN化学本质为纤溶酶原Kringle 1～4内片段，由于天然来源有限，采用基因工程手段生产其重组蛋白十分必要。本课题组已成功克隆了人AGN cDNA，在大肠杆菌中得到高效表达，表达产物形成包涵体，复性后具有良好的抗血管生成和抗肿瘤活性[3，4]。天然AGN结构中含有12对二硫键，对包涵体复性的难度较大，回收率低。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cecrevisie)是单细胞真核生物，既具有大肠杆菌等原核生物繁殖快、易培养的优点，又可对蛋白质产物进行适当加工，如修饰、折叠和分泌等，是基因工程优良的宿主菌之一。本文报道将人AGN导入酿酒酵母中进行表达的研究。1 材料和方法
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1.1 菌株与质粒 E.coli C600 (F,thi-1,leuB6,lacY1,tonA21,SupE44)为本室保藏菌株。S.cerevisiae GRF18(leu2-2、his4-26、ura3-52)由Hollerburg惠赠。pUCMA30含MFα1信号肽编码序列和人AGN基因，本室构建。大肠杆菌/酿酒酵母穿梭质粒pMA91，由广东省微生物研究所提供。
1.2 主要试剂 限制酶Hind Ⅲ、Bgl Ⅱ、SalⅠ，T4 DNA连接酶、Klenow酶、DNA分子量标准等购自Promega公司或华美生物工程公司，人纤溶酶原抗血清、四甲基联苯胺为Sigma公司产品，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(HRP-Protein A)购自上海生物制品研究所，余为国产分析纯试剂。
1.3 培养基 大肠杆菌培养和转化用培养基LB配方见文献[5]；酵母完全培养基YPD、基本培养基YNB配方见文献[6]；酵母选择培养基SC：在YNB中补加组氨酸至终浓度30μg/ml，补加尿嘧啶至终浓度50μg/ml；SC固体培养基：液体SC中添加1.5%的琼脂。
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1.4 质粒的操作 大肠杆菌质粒DNA酶解、连接、转化、检测和制备按Sambrook的方法[5]；质粒DNA转化酵母采用改进的醋酸锂法[7]，酵母质粒检测方法参照文献[8]。
1.5 人AGN在酿酒酵母中的表达 选择培养：挑取重组酵母菌单菌落接种于15ml SC培养基中，30℃ 200rpm振荡培养48h；表达培养：无菌条件下离心收集经选择培养的酵母细胞，灭菌蒸馏水悬洗一次，接种于适当体积的YPD培养基中，使OD650≈0.3，添加尿嘧啶至终浓度为50μg/ml，30℃ 250rpm振荡培养32～48h。
1.6 重组人AGN的免疫学检测 按常规酶联免疫吸附(ELISA)方法。以200μL YPD(空白对照)或酵母细胞培养上清液包被空白酶标板，第一、第二抗体分别为纤溶酶原抗血清(稀释度1∶250)和HRP-Protein A(稀释度1∶50)，显色底物为TMB(工作浓度为0.1μg/ml)，450nm波长下比色，根据吸光度的变化作定性判断。
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1.7 酵母中质粒稳定性检测 参照文献[9]的方法：取重组酵母工程菌单菌落接种于YPD培养基中，30℃振荡培养5天后，取样适当稀释后涂YPD平板，分离单菌落分别点种于SC和YPD平板上，30℃培养2天，在YPD平板上生长而在SC平板上不能生长者为重组质粒丢失的菌落，计算丢失率(%)。
2 结果与讨论
2.1 重组表达质粒pMAA2的构建和酶切鉴定
在酵母中表达外源基因和分泌外源蛋白必须具备下列条件：酵母识别的强启动子，信号肽序列，转录终止信号，翻译终止密码子，合适的表达框架等。
我们克隆的人AGN cDNA本身不含信号肽编码区，为使其表达产物能够分泌到酵母细胞外，在其5′端需融合一段易于为酿酒酵母有效识别的信号肽序列。pUCMA30 是基于上述考虑而构建的重组质粒，含有酵母天然信号肽——MFα1信号肽编码序列和人AGN cDNA(MFα1+hAGN)，两者位于同一读码框架中。
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pMA91是带有酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase,PGK)基因启动子和转录终止信号的表达载体，两者之间仅有单一克隆位点Bgl Ⅱ。为了实现人AGN在酿酒酵母中的表达，首先将MFα1+hAGN插入到pMA91的BglⅡ位点，构建重组质粒。如图1所示，用Hind Ⅲ酶切pUCMA30，产生大小两个片段，分别为载体和MFα1+hAGN。电泳分离并回收约1.2kb的MFα1+hAGN片段，用Klenow酶补平后，与经BglⅡ酶切、Klenow酶补平的pMA91以适当比例混合，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli C600，用质粒快速检测方法筛选得到重组表达质粒pMAA2。
图1 重组质粒pMAA2的构建
P：PGK启动子：T：PGK终止子
在预期的重组表达质粒上，MFαl+hAGN 5′端和距表达载体pMA91原Bgl Ⅱ位点下游约0.8kb处各有一个Sal Ⅰ位点。为了证明MFα1+hAGN是否正向插入，用Sal Ⅰ酶切pMAA2，若为正向插入，应出现两条大小分别为2.0kb和8.7kb的带，若为反向插入，两条带的大小则应为0.8kb和9.9kb。图2的电泳结果显示的是两条2.0kb和8.7kb带，表明重组表达质粒pMAA2是由MFα1+hAGN正向插入pMA91中产生的。
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图2 重组质粒pMAA2的酶切电泳图
1.pMAA2/Sal Ⅰ 2.pMA91/Sal Ⅰ
3.pUCMA30/Hind Ⅲ 4.DNA Ladder
2.2 hAGN基因在酿酒酵母中的表达和分泌
S.cerevisiae GRF18为亮氨酸营养缺陷型菌株，pMAA2上具有亮氨酸选择标记。采用醋酸锂转化法将pMAA2转化S.cerevisiae GRF18，在不含亮氨酸的SC固体培养基上筛选转化子，接种于SC培养基中扩增，经质粒检测得到酵母工程菌菌S.cerevisiae GRF18(pMAA2)。
按1.5的方法进行S.cerevisiae GRF18(pMAA2)的选择和表达培养，细胞接种于YPD培养基中培养12h后每间隔3～4h取样离心，收集培养上清液，按1.6的方法检测hAGN的表达情况，图3的ELISA结果显示：对照菌——S.cerevisiae GRF18(pMA91)在相同条件下培养24h，样品孔无显色(OD450nm<0.1)，为阴性反应;S.cerevisiae GRF18(pMAA2)培养12h、16h呈阴性反应，当培养至20h、24h、27h和30h样品孔显黄色，为阳性反应。表明hAGN在S.cerevisiae GRF18(pMAA2)中得到了表达，产物分泌到细胞外，能够与纤溶酶原抗血清发生特异的抗原抗体反应。根据吸光度的改变判断，培养上清液中重组hAGN的含量与培养时间有关：培养20h，上清液中即可检出有hAGN的分泌表达，培养24～27h hAGN含量达最高，培养至30h含量下降。
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图3 S.cerevisiae GRF18(pMAA2)
发酵上清液的ELISA分析
1.S.cerevisiae GRF18(pMA91)；
余为S.cerevisiae GRF18(pMAA2)
2.3 重组质粒pMAA2在GRF18中的稳定性pMAA2上含有2μ复制起点，是游离于酵母染色体外可自主复制的质粒，在长时间培养的过程中有从酵母中丢失的可能。按1.7的方法检测其在重组酵母工程菌S.cerevisiae GRF18(pMAA2)中的稳定性，实验结果显示在532个测试菌落中仅有14个丢失质粒，丢失率为2.6%，说明重组质粒pMAA2可以在构建的工程酵母菌中稳定地存在。
本研究通过构建分泌型重组表达载体，利用PGK启动子和转录终止信号实现了人AGN在酿酒酵母中的表达，在MFα1信号肽引导下，表达产物分泌到细胞外，具有免疫反应性，为进一步开展生物活性和应用研究奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金(39670013)和广东省自然科学基金(960052)资助课题。
作者简介：卢文菊，女(69.9-)，讲师，博士。研究方向：基因工程。
参考文献
[1] O′Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J].Cell,1994;79:315～328
[2] O′Reilly MS,Holmgren L,Chen C,et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice[J].Nature Medicine,1996;2:689～692
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[3] 卢文菊，罗进贤，李文清等.人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达[J].中山大学学报,1998；37(5)：88～91
[4] Luo Jinxian,Lu Wenju,Li Wenqing,et al.Cloning,sequencing of human angiostatin gene and its expression in E.coli[J].Progress in Natural Sciene,1999;9(9):672～677
[5] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis TJ.Molecular Cloning,A Laboratory Mannual[M],2nd Ed.New York,Cold Spring Habor Lab,1994
[6] Burges PMJ,Percival KJ.Transformation of yeast spheroplasts without cell fusion[J].Anal Biochem,1987;163:391～397
[7] 秦玉静，刘世利，鲍晓明等.高效的酵母完整细胞转化法[J].生物技术，1997；7(3)：37～38
[8] 颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南[M].第一版.科学出版社，1998
[9] 李文清，罗进贤，叶若邻等.黑曲霉糖化酶cDNA的改造及其在酿酒酵母中的表达[J].微生物学通报，1998；25(4)：205～209
(收稿：2000-02-25), http://www.100md.com
单位：卢文菊(广州医学院检验系，广州 510182)；罗进贤(中山大学生命科学学院，广州 510275)；刘向辉(广州医学院检验系，广州 510182)；张朝琴(广州医学院检验系，广州 510182)；陈柏铭(广州医学院检验系，广州 510182)
关键词：血管抑素；基因表达与分泌；酿酒酵母
广州医学院学报000202 提要 目的：在酿酒酵母中表达和分泌人血管抑素。方法：应用DNA重组技术构建重组质粒；质粒DNA转化酵母用醋酸锂法；以纤溶酶原抗血清为第一抗体，采用ELISA方法检测表达产物。结果：将MFα1信号肽和人血管抑素融合基因序列插入酵母表达载体pMA91的Bg1Ⅱ位点，构建了重组表达质粒pMAA2，转化酿酒酵母GRF18后获得工程菌GRF18(pMAA2)，其培养上清液ELISA分析阳性。结论：人血管抑素在GRF18(pMAA2)中得到表达，产物分泌至细胞外，能够与纤溶酶原抗血清发生特异的免疫反应。
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中图分类号 R394.8 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0007-04
Secretive Expression of Human Angiostatin
cDNA in S. cerevisiae
Lu Wenju，Liu Xianghui
(Department of Medical Laboratory,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182)
Luo Jinxian
(School of Life Science,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
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Objective:To express and secrete human angiostatin in S. cerevisiae. Methods:DNA recombinant technique was used to construct recombinant plasmid,which was then transformed into yeast by lithium acetate method. The expression product was detected with ELISA. Results:The fused sequence of MFα1 signal peptide coding region and human angiostatin cDNA was inserted into the Bg1 Ⅱ site on the shuttle vector pMA91 to form the plasmid pMAA2,which was then transformed into S. cerevisiae GRF18. ELISA analysis showed that the culture supernatant of the engineering train S. cerevisiae GRF18 (pMAA2) reacted positively with human plasminogen antisera. Conclusion:Angiostatin was successfully expressed in S. cerevisiae and secreted out to the culture.
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Key words Angiostatin;Expression and secretion;Shacharomyses cerevisiae
血管抑素(Angiostatin，AGN)是1994年发现的一种新型血管生成抑制因子，对肿瘤生长和转移有很强的抑制作用[1，2]。除肿瘤外，糖尿病眼底病、消化道溃疡、关节炎等多种疾病的进展与血管生成密切相关，AGN将有广泛的应用前景。AGN化学本质为纤溶酶原Kringle 1～4内片段，由于天然来源有限，采用基因工程手段生产其重组蛋白十分必要。本课题组已成功克隆了人AGN cDNA，在大肠杆菌中得到高效表达，表达产物形成包涵体，复性后具有良好的抗血管生成和抗肿瘤活性[3，4]。天然AGN结构中含有12对二硫键，对包涵体复性的难度较大，回收率低。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cecrevisie)是单细胞真核生物，既具有大肠杆菌等原核生物繁殖快、易培养的优点，又可对蛋白质产物进行适当加工，如修饰、折叠和分泌等，是基因工程优良的宿主菌之一。本文报道将人AGN导入酿酒酵母中进行表达的研究。1 材料和方法
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1.1 菌株与质粒 E.coli C600 (F,thi-1,leuB6,lacY1,tonA21,SupE44)为本室保藏菌株。S.cerevisiae GRF18(leu2-2、his4-26、ura3-52)由Hollerburg惠赠。pUCMA30含MFα1信号肽编码序列和人AGN基因，本室构建。大肠杆菌/酿酒酵母穿梭质粒pMA91，由广东省微生物研究所提供。
1.2 主要试剂 限制酶Hind Ⅲ、Bgl Ⅱ、SalⅠ，T4 DNA连接酶、Klenow酶、DNA分子量标准等购自Promega公司或华美生物工程公司，人纤溶酶原抗血清、四甲基联苯胺为Sigma公司产品，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(HRP-Protein A)购自上海生物制品研究所，余为国产分析纯试剂。
1.3 培养基 大肠杆菌培养和转化用培养基LB配方见文献[5]；酵母完全培养基YPD、基本培养基YNB配方见文献[6]；酵母选择培养基SC：在YNB中补加组氨酸至终浓度30μg/ml，补加尿嘧啶至终浓度50μg/ml；SC固体培养基：液体SC中添加1.5%的琼脂。
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1.4 质粒的操作 大肠杆菌质粒DNA酶解、连接、转化、检测和制备按Sambrook的方法[5]；质粒DNA转化酵母采用改进的醋酸锂法[7]，酵母质粒检测方法参照文献[8]。
1.5 人AGN在酿酒酵母中的表达 选择培养：挑取重组酵母菌单菌落接种于15ml SC培养基中，30℃ 200rpm振荡培养48h；表达培养：无菌条件下离心收集经选择培养的酵母细胞，灭菌蒸馏水悬洗一次，接种于适当体积的YPD培养基中，使OD650≈0.3，添加尿嘧啶至终浓度为50μg/ml，30℃ 250rpm振荡培养32～48h。
1.6 重组人AGN的免疫学检测 按常规酶联免疫吸附(ELISA)方法。以200μL YPD(空白对照)或酵母细胞培养上清液包被空白酶标板，第一、第二抗体分别为纤溶酶原抗血清(稀释度1∶250)和HRP-Protein A(稀释度1∶50)，显色底物为TMB(工作浓度为0.1μg/ml)，450nm波长下比色，根据吸光度的变化作定性判断。
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1.7 酵母中质粒稳定性检测 参照文献[9]的方法：取重组酵母工程菌单菌落接种于YPD培养基中，30℃振荡培养5天后，取样适当稀释后涂YPD平板，分离单菌落分别点种于SC和YPD平板上，30℃培养2天，在YPD平板上生长而在SC平板上不能生长者为重组质粒丢失的菌落，计算丢失率(%)。
2 结果与讨论
2.1 重组表达质粒pMAA2的构建和酶切鉴定
在酵母中表达外源基因和分泌外源蛋白必须具备下列条件：酵母识别的强启动子，信号肽序列，转录终止信号，翻译终止密码子，合适的表达框架等。
我们克隆的人AGN cDNA本身不含信号肽编码区，为使其表达产物能够分泌到酵母细胞外，在其5′端需融合一段易于为酿酒酵母有效识别的信号肽序列。pUCMA30 是基于上述考虑而构建的重组质粒，含有酵母天然信号肽——MFα1信号肽编码序列和人AGN cDNA(MFα1+hAGN)，两者位于同一读码框架中。
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pMA91是带有酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase,PGK)基因启动子和转录终止信号的表达载体，两者之间仅有单一克隆位点Bgl Ⅱ。为了实现人AGN在酿酒酵母中的表达，首先将MFα1+hAGN插入到pMA91的BglⅡ位点，构建重组质粒。如图1所示，用Hind Ⅲ酶切pUCMA30，产生大小两个片段，分别为载体和MFα1+hAGN。电泳分离并回收约1.2kb的MFα1+hAGN片段，用Klenow酶补平后，与经BglⅡ酶切、Klenow酶补平的pMA91以适当比例混合，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli C600，用质粒快速检测方法筛选得到重组表达质粒pMAA2。
图1 重组质粒pMAA2的构建
P：PGK启动子：T：PGK终止子
在预期的重组表达质粒上，MFαl+hAGN 5′端和距表达载体pMA91原Bgl Ⅱ位点下游约0.8kb处各有一个Sal Ⅰ位点。为了证明MFα1+hAGN是否正向插入，用Sal Ⅰ酶切pMAA2，若为正向插入，应出现两条大小分别为2.0kb和8.7kb的带，若为反向插入，两条带的大小则应为0.8kb和9.9kb。图2的电泳结果显示的是两条2.0kb和8.7kb带，表明重组表达质粒pMAA2是由MFα1+hAGN正向插入pMA91中产生的。
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图2 重组质粒pMAA2的酶切电泳图
1.pMAA2/Sal Ⅰ 2.pMA91/Sal Ⅰ
3.pUCMA30/Hind Ⅲ 4.DNA Ladder
2.2 hAGN基因在酿酒酵母中的表达和分泌
S.cerevisiae GRF18为亮氨酸营养缺陷型菌株，pMAA2上具有亮氨酸选择标记。采用醋酸锂转化法将pMAA2转化S.cerevisiae GRF18，在不含亮氨酸的SC固体培养基上筛选转化子，接种于SC培养基中扩增，经质粒检测得到酵母工程菌菌S.cerevisiae GRF18(pMAA2)。
按1.5的方法进行S.cerevisiae GRF18(pMAA2)的选择和表达培养，细胞接种于YPD培养基中培养12h后每间隔3～4h取样离心，收集培养上清液，按1.6的方法检测hAGN的表达情况，图3的ELISA结果显示：对照菌——S.cerevisiae GRF18(pMA91)在相同条件下培养24h，样品孔无显色(OD450nm<0.1)，为阴性反应;S.cerevisiae GRF18(pMAA2)培养12h、16h呈阴性反应，当培养至20h、24h、27h和30h样品孔显黄色，为阳性反应。表明hAGN在S.cerevisiae GRF18(pMAA2)中得到了表达，产物分泌到细胞外，能够与纤溶酶原抗血清发生特异的抗原抗体反应。根据吸光度的改变判断，培养上清液中重组hAGN的含量与培养时间有关：培养20h，上清液中即可检出有hAGN的分泌表达，培养24～27h hAGN含量达最高，培养至30h含量下降。
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图3 S.cerevisiae GRF18(pMAA2)
发酵上清液的ELISA分析
1.S.cerevisiae GRF18(pMA91)；
余为S.cerevisiae GRF18(pMAA2)
2.3 重组质粒pMAA2在GRF18中的稳定性pMAA2上含有2μ复制起点，是游离于酵母染色体外可自主复制的质粒，在长时间培养的过程中有从酵母中丢失的可能。按1.7的方法检测其在重组酵母工程菌S.cerevisiae GRF18(pMAA2)中的稳定性，实验结果显示在532个测试菌落中仅有14个丢失质粒，丢失率为2.6%，说明重组质粒pMAA2可以在构建的工程酵母菌中稳定地存在。
本研究通过构建分泌型重组表达载体，利用PGK启动子和转录终止信号实现了人AGN在酿酒酵母中的表达，在MFα1信号肽引导下，表达产物分泌到细胞外，具有免疫反应性，为进一步开展生物活性和应用研究奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金(39670013)和广东省自然科学基金(960052)资助课题。
作者简介：卢文菊，女(69.9-)，讲师，博士。研究方向：基因工程。
参考文献
[1] O′Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J].Cell,1994;79:315～328
[2] O′Reilly MS,Holmgren L,Chen C,et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice[J].Nature Medicine,1996;2:689～692
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[3] 卢文菊，罗进贤，李文清等.人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达[J].中山大学学报,1998；37(5)：88～91
[4] Luo Jinxian,Lu Wenju,Li Wenqing,et al.Cloning,sequencing of human angiostatin gene and its expression in E.coli[J].Progress in Natural Sciene,1999;9(9):672～677
[5] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis TJ.Molecular Cloning,A Laboratory Mannual[M],2nd Ed.New York,Cold Spring Habor Lab,1994
[6] Burges PMJ,Percival KJ.Transformation of yeast spheroplasts without cell fusion[J].Anal Biochem,1987;163:391～397
[7] 秦玉静，刘世利，鲍晓明等.高效的酵母完整细胞转化法[J].生物技术，1997；7(3)：37～38
[8] 颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南[M].第一版.科学出版社，1998
[9] 李文清，罗进贤，叶若邻等.黑曲霉糖化酶cDNA的改造及其在酿酒酵母中的表达[J].微生物学通报，1998；25(4)：205～209
(收稿：2000-02-25), http://www.100md.com