中华眼镜蛇毒组分C与传统TACE化疗药体外抑制人肝癌细胞株作用的差异
作者：刘慰 王敏 管锦霞 余清声 林振桃 曾耀英 胡以则
单位：刘慰(广州医学院第二附属医院外科, 广州 510260)；王敏(广州医学院预防医学97级研究生)；管锦霞(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；余清声(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；林振桃(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；曾耀英(暨南大学组织移植与免疫国家专业实验室，广州 510380)
关键词：眼镜蛇毒；肝肿瘤；组份C；细胞毒；化学疗法
广州医学院学报000201 提要 目的：研究中华眼镜蛇毒组分C(Fraction C from Naja Naja Actra Venom, FC)体外对人肝癌细胞株的细胞毒作用和机理，并与传统肝动脉插管栓塞/灌注化疗(Transcatheter Arterial Chemoembolization, TACE)药进行比较。方法：应用MTT法、流式细胞仪等方法，观察FC对人肝癌细胞株(Bel-7402)、人支气管上皮细胞株(HBE16)及人羊膜细胞株(HAM)的细胞毒作用、量效关系、凋亡率等，并与5-氟尿嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)等对上述细胞的细胞毒作用进行比较。结果：FC对人肝癌细胞有明显的抑制作用，其24及48h的IC50分别为4.34和3.96μg/ml, 且呈良好的量效关系，而正常人支气管上皮细胞(HBE16)的IC50则分别高达10.46和11.82μg/ml，两细胞株间存在差异显著性(P<0.01)。FC还能诱导肝癌细胞凋亡，凋亡率随浓度升高而增加。结论：在本实验中，FC能有效抑制肝癌细胞株的生长，抑制作用与浓度呈正相关，且能诱导肝癌细胞凋亡，与传统TACE化疗药相比较，FC是有效的、能选择性抑制肝癌细胞生长的新型抗癌药物。
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中图分类号 R735.705 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0001-06
The Difference of the in vitro Inhibition Effect on
Human Hepatocarcinoma Cell Line between Fraction
C from Naja Naja Actra Venom and Traditional
TACE Chemotherapeutical Drugs
Liu Wei
(Department of Surgery, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou
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Medical College, Guangzhou 510260)
Wang Min
(Department of Preventive Medicine,Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182)
Guan Jinxia
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182)
Objective: To investigate the cytotoxic effect of Fraction C from Naja Naja Actra Venom (FC) on Human Hepatocarcinoma cell line (Bel-7402) and its possible mechanisms and to compare its effect with those of traditional Transcatheter Arterial Chemoembolization (TACE) drugs. Methods: MTT and Flow Cytometry (FCM) were involved in detecting the cytotoxic effects,dose-effect related rates and apoptosis rates of FC on Human Hepatocarcinoma cell line(Bel-7402) ,Human Bronchial cell line(HBE-16) and Human Amniotic Membrane cell line(HAM). These effects were compared with those of 5-Fluorouracilum(5-Fu),Mitomycine C(MMC) and Adriamycin(ADM) on the above mentioned cell lines. Result: The inhibitive effect of FC on Bel-7402 was obvious, with the IC50 of 4.34 and 3.96μg/ml at 24 and 48h respectively, compared to the IC50 of 10.46 and 11.82 μg/ml respectively for HBE-16. The difference was significant (P<0.01). FC could also induce the apoptosis of Bel-7402,with a good dose-effect correlation. Conclusion:FC can effectively inhibit the growth and induce the apoptosis of the Human Hepatocarcinoma cell line (Bel-7402). It suggests that FC is more effective and selective in inhibiting the growth of hepatocarcinoma cells than the traditional TACE chemotherapeutical drugs.
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Key words Cobra venoms; Liver neoplasms; Fraction C; Cytotoxicity; Chemoembolization
眼镜蛇毒是成分复杂的蛋白质，含有多种酶类和多种不同生理、药理活性蛋白。运用蛇毒治疗肿瘤，1967年已有报道，Braganca等报道CV的细胞毒对吉田肉瘤的生长有抑制作用。[1]1975年Iwaguchi等证实印度CV的Ⅱ型细胞毒素对实验肿瘤如L2110吉田肉瘤，大鼠腹水型肝癌AH-13及骨髓样白血病DBLA-6均具有杀伤作用。[2]
本研究试图通过体外实验探讨中华眼镜蛇毒FC抗人肝癌的作用，并与经典肝动脉插管栓塞/灌注化疗(TACE)药进行比较。以探索新的TACE化疗组合，进一步提高中晚期肝癌的疗效。1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 FC：由广州医学院广州蛇毒研究所提供，批号：981221。眼镜蛇毒组份C是眼镜蛇粗毒经CM-SephadexC-25离子交换层析柱层析和SephadexG-75分子筛柱层析分离后，所获得的一具有抗癌活性的组份。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带,电位滴定法不能检出磷脂酶A2活性.它的血清廓清时间为15h，LD50为2.88±0.41mg/kg[3]。分子量约6000Da。
1.1.2 细胞株:人肝癌细胞株Bel-7402(上海细胞生物所建株)，人羊膜细胞株HAM由广州医学院化学致癌研究所吴中亮、陈家教授惠赠。人支气管上皮细胞(HBE16)由广州医学院呼吸病研究所钟南山院士惠赠。
1.1.3 主要试剂:细胞培养液MEM购自Gibco公司。 5-FU购自南通制药总厂，批号：990419，0.25g/支。MMC购自Kyowa Hakko Koyyo CO. Ltd. Japan, 2mg/支，批号：258B1B。ADM购自Haimen Pharmaceutical factory ，10mg/支，批号：980306。MTT购自Sigma公司。其它试剂均为国产分析纯。
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1.1.4 主要仪器:CO2培养箱Sanyo MCO-175，超净工作台Sanyo MDF-290-AT。6孔、24孔、96孔板购自Sigma。MB-Ⅲ型酶标检测仪，流式细胞仪EPICS-CL，(Coulter公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Bel-7402、HBE16、HAM以10%小牛血清的MEM培养液于37℃5%CO2培养箱中湿化孵育。
1.2.2 细胞毒试验(MTT法)[4]
取对数生长期细胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA等量混合消化后用含10%小牛血清的MEM培养基配成20×104/ml，用MEM将药物稀释成不同浓度药物工作液，其中FC工作液配对好2天内使用。接种96孔培养板中，每孔细胞悬液100μl，加MEM至总体积200μl，37℃5% CO2培养48h，更换新的培养液，每孔加入等体积各浓度之药物工作液及培养液使总体积为200μl，每剂量每种肿瘤设4平行孔。阴性对照组加等体积MEM，培养24及48h，弃去上清液，每孔加入200μl新鲜配制的含0.2mg/mlMTT的无血清培养基，37℃继续培养4h，小心弃上清，并加入200μl DMSO溶解MTT甲替沉淀，混匀，在酶标仪上以570nm波长测定样品。细胞毒作用由细胞生长抑制率评价。
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1.2.3 凋亡试验(PI法，流式细胞仪)
消化对数生长期细胞，接种于6孔板中，50×104/孔， 37℃5% CO2培养48h后换培养液，加等体积不同浓度的工作液，空白对照组加入等体积MEM，一定时间后消化，制备单细胞悬液，离心1500rpm，5min，70%预冷乙醇固定于-20℃，上机前,加PBS清洗一次，离心1500rpm，5min，加入含Rnase的PI染液，室温遮光孵育30min上机测定(激发波长488nm)。
1.2.4 统计学方法：t' 检验，直线回归与相关，Q检验(Newman-Keuls法)。
2 结果
2.1 24h FC对人肝癌及人正常上皮组织细胞的抑制作用比较
FC对Bel-7402和同为上皮细胞的正常细胞HBE16和HAM均有抑制作用，并呈明显的量效关系，其中以对肝癌细胞的抑制作用突出，IC50为4.34μg/ml，而HBE16和HAM分别为10.455及4.7μg/ml。相关系数依次为0.99、0.89和0.98。HBE16在各水平段对FC的敏感性低于肝癌细胞(P<0.01)。HAM比HBE16敏感(P<0.01)，但与Bel-7402则差异无显著性(P>0.05)。
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表1 24h FC对三种细胞的抑制作用比较 (生长抑制率%) (n=5,
±s, %) 细胞株
1μg/ml
2μg/ml
4μg/ml
8μg/ml
16μg/ml
Bel-7402
6.10±4.06
19.34±6.26
47.62±3.82
, 百拇医药
76.4±2.7
92.4±1.40
HBE16
2.40±1.15a,b
0.5±2.5a,b
2.9±1.3a,b
27.13±6.80a,b
79.2±2.80a,b
HAM
3.41±1.69
, 百拇医药
17.64±12.89
35.0±19.89
79.0±2.00
91.7±3.50
a与Bel-7402比较，P<0.01；b与HAM比较，P<0.052.2 48h FC对肝癌细胞及正常人上皮细胞抑制作用的比较
FC对肝癌细胞及正常人上皮细胞抑制作用呈良好的量效关系。FC对三种细胞分别为3.96、11.82及4.03μg/ml。相关系数分别为：0.9611、0.8903及0.8883。其中HBE16仍较Bel-7402及HAM耐受(P<0.01)。而后两者之间对FC的敏感性无明显差异(P<0.05)。
表2 48h FC对三种细胞的抑制作用比较(生长抑制率%) (n=5,±s, %) 细胞株
, 百拇医药
1μg/ml
2μg/ml
4μg/ml
8μg/ml
16μg/ml
Bel-7402
2.34±7.93
18.3±6.23
60.56±18.3
85.79±6.27
88.18±4.54
HBE16
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0.60±3.51
5.50±1.94a,b
-0.006±2.03a,b
37.44±26.58a,b
73.39±4.25a,b
HAM
7.22±3.01
28.14±16.02
34.88±10.23a
82.84±10.33
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95.96±2.40
a与Bel-7402比较，P<0.01；b与HAM比较，P<0.01。2.3 24h和48h5-FU对三种细胞抑制作用的比较
在低浓度时(1μg/ml)时5-FU对肝癌或正常上皮细胞作用均无差异；当浓度升高时(10、100μg/ml)，正常上皮细胞的敏感性超过了对肝癌细胞的敏感性(P<0.05)。从而表明5-FU在达到有效治疗浓度同时也对正常组织细胞构成不良损害.。另外，5-FU 100μg/ml时对Bel-7402的作用弱于FC≥8μg/ml时 (P<0.05)，而对HBE16的作用则强于FC8μg/ml时 (P<0.05)。
2.4 24、48hMMC、ADM对人肝癌细胞株Bel-7402的抑制作用(生长抑制率)
表3 24h和48h 5-FU对三种细胞的抑制作用的比较(生长抑制率%) (n=5,±s, %) 时间
, 百拇医药
细胞株
100μg/ml
10μg/ml
1μg/ml
Bel-7402
57.49±4.61
26.31±9.76
1.1±4.23
24h
HBE16
76.16±3.13a
44.06±11.04a
, 百拇医药
7.54±3.82
HAM
69.66±3.08
57.58±9.93a
8.11±4.89
Bel-7402
63.26±0.084
25.84±5.06
3.3±0.84
48h
HBE16
95.91±2.82a
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87.82±6.84
3.14±1.47
HAM
86.24±2.69a
68.48±4.49a
4.82±3.08
a同时期与Bel-7402比较，P<0.05；b同时期与HAM比较，P<0.05。表4 24、48h MMC、ADM对人肝癌细胞株Bel-7402的抑制作用(生长抑制率) (n=5,±s,%) 时间
MMC
, 百拇医药
ADM
10μg/ml
1μg/ml
0.1μg/ml
4μg/ml
0.4μg/ml
0.04μg/ml
24h
75.39±2.47
23.02±7.01
1.1±4.23
82.84±1.74
, 百拇医药
33.16±10.34
10.46±3.30
48h
64.28±3.36
22.44±3.49
3.3±0.84
93.65±2.68
35.47±7.92
12.33±9.42
2.5 FC与5-FU协同加强作用的初步研究
本研究提示FC2μg/ml+5-FU10μg/ml及单用其中一种药对人肿瘤细胞具有更好的抑制作用(P<0.05)
, 百拇医药
表5 24、48h FC(2μg/ml)与5-FU(10μg/ml)
对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用 药物(浓度)
生长抑制率(%)
24h
48h
FC(2μg/ml)
19.34±6.26a
18.04±6.24a
5-FU(10μg/ml)
25.68±9.12a
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25.84±5.06a
FC(2μg/ml)+5
-FU(10μg/ml)
37.24±4.06
45.75±0.06
a.与FC+5-FU比较，P<0.01。
2.6 凋亡实验
随着浓度的增加，Bel-7402的凋亡率也有升高，至32μg/ml处理5h凋亡率可达23.1%(如表6)表6 5h不同浓度FC处理Bel-7402
的凋亡率% FC(μg/ml)
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凋亡率(%)
0
5.0
8
11.5
16
19.6
32
23.1
图1 5h不同浓度FC处理Bel-7402的凋亡流式细胞图
A. 阴性对照(0μg/ml) B. FC(8μg/ml) C. FC(16μg/ml) D. FC(32μg/ml)
, 百拇医药
3 讨论
3.1 本实验结果显示人肝癌细胞对FC的细胞毒性作用是敏感的。24h及48h的IC50分别为4.34和3.96μg/ml.由于FC的血清廓清时间为15h，故本实验着重考察短时间(24及48h)时FC对各细胞系的细胞毒性作用.目前对蛇毒抗肿瘤的机理的研究集中于以下几点：①破坏肿瘤细胞的细胞膜，本实验中的FC已证实在提纯中除去了磷脂酶A2，因此其主要的机理似乎在于能与细胞膜上的磷脂结合形成稳定的复合物，或选择性地与膜受体蛋白结合产生跨膜通道，干扰钙与细胞膜的结合，从而影响膜稳定性，致不可逆的细胞膜去极化，最终导致肿瘤细胞死亡[5]，晚近研究还发现FC可激活细胞膜上的组织磷脂酶而影响细胞膜上的Ca2+-Mg2+-ATP酶等的活性，从而引发一系列病理过程，最终导致细胞损伤[6]，也有本地学者认为FC能诱导肝癌细胞Bel-7402内产生一氧化氮(NO)和脂质过氧化酶(LPO)，从而导致肿瘤细胞死亡[7];②降低肿瘤细胞的恶性程度[8]；③抑制肿瘤细胞DNA合成.本流式细胞仪实验中我们观察到随着FC浓度的升高,肿瘤细胞的四倍体与二倍体比例明显下降。
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3.2 从各细胞系对各药物的敏感性比较来看,对Bel-7402的IC50而言,FC低于5-Fu；对HBE16而言,FC的IC50则高于5-Fu;因为肝癌细胞属于腺上皮细胞,而正常肝细胞难于分离传代,所以我们将同属腺上皮的人支气管上皮细胞HBE16作为正常对照,,应仍具有可比性[4]。
上述实验说明:①FC能具有较高选择性。它能选择性作用于肝癌细胞,在有效浓度下对正常组织保持低毒性。例如24,48h FC对Bel-7402的IC50分别为4.34和3.96μg/ml,但同浓度时,FC对HBE16的生长抑制率仅为2.9%及接近0%。本实验提示此选择性与细胞的增殖快慢似无直接联系.据我们观察,同样培养条件下,Bel-7402、HBE16及HAM的增殖速率基本相同,甚至前者的增殖速率稍慢于后两者；②FC对肝癌细胞毒性作用的选择性强于5-Fu(P<0.05)。5-Fu对BeL-7402的两时段(24,48h)IC50在10～100μg/ml之间,在此浓度下对HBE16的抑制率高达44%～88%，而FC 8μg/ml时对Bel-7402的抑制率分别已达76.4%和85.79%，对HBE16仅为27.13%和37.44%。两药对两细胞系的作用存在差异显著性(P<0.05).说明FC可能在在有效，有选择性的同时,也是初步具备低毒性和安全性的抗癌药。
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3.3 FC可能对胚胎性细胞具有较高的抑制作用。HAM为正常人的胚胎性上皮细胞。两时段内FC对HAM的抑制作用均与Bel-7402无差异(P<0.05)，但与正常成熟上皮细胞HBE16存在差异显著性(P<0.01)。故我们推测FC可能对胎儿及婴幼儿的正常细胞具有一定的毒性。再者，FC与5-FU可产生协同互补作用,也提示了两药作用机制的差异。凑巧的是癌细胞因其分化较正常细胞差，在某种程度上也属于胚胎性幼稚上皮细胞。所以在此方面Bel-7402与HAM具有一定的相似之处，因此FC对Bel-7402与HAM作用就凸显不出差别(P>0.05)，这提示FC抑制肿瘤作用的机理也许在于其特异作用于分化较差(低)的细胞，从而使Bel-7402、HAM对FC的敏感性高于分化成熟的HBE-16。
3.4 FC诱导细胞凋亡的机理
可能机理有：①下调抑制细胞凋亡的相关基因，如Bcl-2，并上调促进细胞凋亡的相关基因，如Bax族基因[9]。谭获等提出FC可通过下调Bcl-2/Bax基因比例而诱导白血病细胞株凋亡；②诱导癌细胞内产生NO和LPO从而诱导凋亡[7]。龚海云等研究显示了FC能诱导人肝癌细胞株Bel-7402细胞内产生大量的NO和LPO，两者可能通过有关途径诱导凋亡；③影响肿瘤细胞内游离钙的浓度[10]。龚海云指出FC能刺激人肝癌细胞株Bel-7402胞浆游离钙升高。Ca2+不仅与几种Ca2+-依赖性凋亡相关核酸内切酶的活性密切相关，还能促使Ca2+-依赖性谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase)与钙蛋白酶(Calpain)等活化，从而引起胞质蛋白的交联与细胞质的破坏，最终导致细胞碎裂。因此，Ca2+被认为是活化死亡程序和最终引起核小体间(Internucleosomal)DNA切割的关键阳离子[11]；④诱导肿瘤细胞生成H2O2，从而诱导凋亡[12]。南韩的Suhr等指出南韩种蛇毒中含有L-氨基酸氧化酶(LAO)，可催化L-氨基酸生成H2O2，从而诱导凋亡。
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本实验中，我们利用流式细胞仪及PI法，初步证实8、16及32μg/ml的FC能在5h内有效诱导人肝癌细胞的凋亡，且呈良好量效关系。
综上所述，相对于传统TACE化疗药如5-Fu等而言，FC可能是有效的、选择性较高的抗肝癌新药。但其作用有待进一步体内及临床实验证明。
(致谢;吴中亮、陈家教授无偿提供实验室和大部分实验设备、试剂， 刘云岗副教授在本课题技术路线、细胞学实验操作中给予帮助)
基金项目：广东省卫生厅(A1998262)。
作者简介：刘慰(1970-)，男，硕士，住院医师。研究方向：肝癌外科治疗。
作者单位：胡以则(广州医学院第二附属医院外科, 广州 510260)
, 百拇医药 参考文献
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(收稿：1999-04-30), http://www.100md.com
单位：刘慰(广州医学院第二附属医院外科, 广州 510260)；王敏(广州医学院预防医学97级研究生)；管锦霞(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；余清声(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；林振桃(广州医学院广州蛇毒研究所, 广州 510182)；曾耀英(暨南大学组织移植与免疫国家专业实验室，广州 510380)
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Liu Wei
(Department of Surgery, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou
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Guan Jinxia
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182)
Objective: To investigate the cytotoxic effect of Fraction C from Naja Naja Actra Venom (FC) on Human Hepatocarcinoma cell line (Bel-7402) and its possible mechanisms and to compare its effect with those of traditional Transcatheter Arterial Chemoembolization (TACE) drugs. Methods: MTT and Flow Cytometry (FCM) were involved in detecting the cytotoxic effects,dose-effect related rates and apoptosis rates of FC on Human Hepatocarcinoma cell line(Bel-7402) ,Human Bronchial cell line(HBE-16) and Human Amniotic Membrane cell line(HAM). These effects were compared with those of 5-Fluorouracilum(5-Fu),Mitomycine C(MMC) and Adriamycin(ADM) on the above mentioned cell lines. Result: The inhibitive effect of FC on Bel-7402 was obvious, with the IC50 of 4.34 and 3.96μg/ml at 24 and 48h respectively, compared to the IC50 of 10.46 and 11.82 μg/ml respectively for HBE-16. The difference was significant (P<0.01). FC could also induce the apoptosis of Bel-7402,with a good dose-effect correlation. Conclusion:FC can effectively inhibit the growth and induce the apoptosis of the Human Hepatocarcinoma cell line (Bel-7402). It suggests that FC is more effective and selective in inhibiting the growth of hepatocarcinoma cells than the traditional TACE chemotherapeutical drugs.
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Key words Cobra venoms; Liver neoplasms; Fraction C; Cytotoxicity; Chemoembolization
眼镜蛇毒是成分复杂的蛋白质，含有多种酶类和多种不同生理、药理活性蛋白。运用蛇毒治疗肿瘤，1967年已有报道，Braganca等报道CV的细胞毒对吉田肉瘤的生长有抑制作用。[1]1975年Iwaguchi等证实印度CV的Ⅱ型细胞毒素对实验肿瘤如L2110吉田肉瘤，大鼠腹水型肝癌AH-13及骨髓样白血病DBLA-6均具有杀伤作用。[2]
本研究试图通过体外实验探讨中华眼镜蛇毒FC抗人肝癌的作用，并与经典肝动脉插管栓塞/灌注化疗(TACE)药进行比较。以探索新的TACE化疗组合，进一步提高中晚期肝癌的疗效。1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 FC：由广州医学院广州蛇毒研究所提供，批号：981221。眼镜蛇毒组份C是眼镜蛇粗毒经CM-SephadexC-25离子交换层析柱层析和SephadexG-75分子筛柱层析分离后，所获得的一具有抗癌活性的组份。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带,电位滴定法不能检出磷脂酶A2活性.它的血清廓清时间为15h，LD50为2.88±0.41mg/kg[3]。分子量约6000Da。
1.1.2 细胞株:人肝癌细胞株Bel-7402(上海细胞生物所建株)，人羊膜细胞株HAM由广州医学院化学致癌研究所吴中亮、陈家教授惠赠。人支气管上皮细胞(HBE16)由广州医学院呼吸病研究所钟南山院士惠赠。
1.1.3 主要试剂:细胞培养液MEM购自Gibco公司。 5-FU购自南通制药总厂，批号：990419，0.25g/支。MMC购自Kyowa Hakko Koyyo CO. Ltd. Japan, 2mg/支，批号：258B1B。ADM购自Haimen Pharmaceutical factory ，10mg/支，批号：980306。MTT购自Sigma公司。其它试剂均为国产分析纯。
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1.1.4 主要仪器:CO2培养箱Sanyo MCO-175，超净工作台Sanyo MDF-290-AT。6孔、24孔、96孔板购自Sigma。MB-Ⅲ型酶标检测仪，流式细胞仪EPICS-CL，(Coulter公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Bel-7402、HBE16、HAM以10%小牛血清的MEM培养液于37℃5%CO2培养箱中湿化孵育。
1.2.2 细胞毒试验(MTT法)[4]
取对数生长期细胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA等量混合消化后用含10%小牛血清的MEM培养基配成20×104/ml，用MEM将药物稀释成不同浓度药物工作液，其中FC工作液配对好2天内使用。接种96孔培养板中，每孔细胞悬液100μl，加MEM至总体积200μl，37℃5% CO2培养48h，更换新的培养液，每孔加入等体积各浓度之药物工作液及培养液使总体积为200μl，每剂量每种肿瘤设4平行孔。阴性对照组加等体积MEM，培养24及48h，弃去上清液，每孔加入200μl新鲜配制的含0.2mg/mlMTT的无血清培养基，37℃继续培养4h，小心弃上清，并加入200μl DMSO溶解MTT甲替沉淀，混匀，在酶标仪上以570nm波长测定样品。细胞毒作用由细胞生长抑制率评价。
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1.2.3 凋亡试验(PI法，流式细胞仪)
消化对数生长期细胞，接种于6孔板中，50×104/孔， 37℃5% CO2培养48h后换培养液，加等体积不同浓度的工作液，空白对照组加入等体积MEM，一定时间后消化，制备单细胞悬液，离心1500rpm，5min，70%预冷乙醇固定于-20℃，上机前,加PBS清洗一次，离心1500rpm，5min，加入含Rnase的PI染液，室温遮光孵育30min上机测定(激发波长488nm)。
1.2.4 统计学方法：t' 检验，直线回归与相关，Q检验(Newman-Keuls法)。
2 结果
2.1 24h FC对人肝癌及人正常上皮组织细胞的抑制作用比较
FC对Bel-7402和同为上皮细胞的正常细胞HBE16和HAM均有抑制作用，并呈明显的量效关系，其中以对肝癌细胞的抑制作用突出，IC50为4.34μg/ml，而HBE16和HAM分别为10.455及4.7μg/ml。相关系数依次为0.99、0.89和0.98。HBE16在各水平段对FC的敏感性低于肝癌细胞(P<0.01)。HAM比HBE16敏感(P<0.01)，但与Bel-7402则差异无显著性(P>0.05)。
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表1 24h FC对三种细胞的抑制作用比较 (生长抑制率%) (n=5,
±s, %) 细胞株1μg/ml
2μg/ml
4μg/ml
8μg/ml
16μg/ml
Bel-7402
6.10±4.06
19.34±6.26
47.62±3.82
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76.4±2.7
92.4±1.40
HBE16
2.40±1.15a,b
0.5±2.5a,b
2.9±1.3a,b
27.13±6.80a,b
79.2±2.80a,b
HAM
3.41±1.69
, 百拇医药
17.64±12.89
35.0±19.89
79.0±2.00
91.7±3.50
a与Bel-7402比较，P<0.01；b与HAM比较，P<0.052.2 48h FC对肝癌细胞及正常人上皮细胞抑制作用的比较
FC对肝癌细胞及正常人上皮细胞抑制作用呈良好的量效关系。FC对三种细胞分别为3.96、11.82及4.03μg/ml。相关系数分别为：0.9611、0.8903及0.8883。其中HBE16仍较Bel-7402及HAM耐受(P<0.01)。而后两者之间对FC的敏感性无明显差异(P<0.05)。
表2 48h FC对三种细胞的抑制作用比较(生长抑制率%) (n=5,
±s, %) 细胞株, 百拇医药
1μg/ml
2μg/ml
4μg/ml
8μg/ml
16μg/ml
Bel-7402
2.34±7.93
18.3±6.23
60.56±18.3
85.79±6.27
88.18±4.54
HBE16
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0.60±3.51
5.50±1.94a,b
-0.006±2.03a,b
37.44±26.58a,b
73.39±4.25a,b
HAM
7.22±3.01
28.14±16.02
34.88±10.23a
82.84±10.33
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95.96±2.40
a与Bel-7402比较，P<0.01；b与HAM比较，P<0.01。2.3 24h和48h5-FU对三种细胞抑制作用的比较
在低浓度时(1μg/ml)时5-FU对肝癌或正常上皮细胞作用均无差异；当浓度升高时(10、100μg/ml)，正常上皮细胞的敏感性超过了对肝癌细胞的敏感性(P<0.05)。从而表明5-FU在达到有效治疗浓度同时也对正常组织细胞构成不良损害.。另外，5-FU 100μg/ml时对Bel-7402的作用弱于FC≥8μg/ml时 (P<0.05)，而对HBE16的作用则强于FC8μg/ml时 (P<0.05)。
2.4 24、48hMMC、ADM对人肝癌细胞株Bel-7402的抑制作用(生长抑制率)
表3 24h和48h 5-FU对三种细胞的抑制作用的比较(生长抑制率%) (n=5,
±s, %) 时间, 百拇医药
细胞株
100μg/ml
10μg/ml
1μg/ml
Bel-7402
57.49±4.61
26.31±9.76
1.1±4.23
24h
HBE16
76.16±3.13a
44.06±11.04a
, 百拇医药
7.54±3.82
HAM
69.66±3.08
57.58±9.93a
8.11±4.89
Bel-7402
63.26±0.084
25.84±5.06
3.3±0.84
48h
HBE16
95.91±2.82a
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87.82±6.84
3.14±1.47
HAM
86.24±2.69a
68.48±4.49a
4.82±3.08
a同时期与Bel-7402比较，P<0.05；b同时期与HAM比较，P<0.05。表4 24、48h MMC、ADM对人肝癌细胞株Bel-7402的抑制作用(生长抑制率) (n=5,
±s,%) 时间MMC
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ADM
10μg/ml
1μg/ml
0.1μg/ml
4μg/ml
0.4μg/ml
0.04μg/ml
24h
75.39±2.47
23.02±7.01
1.1±4.23
82.84±1.74
, 百拇医药
33.16±10.34
10.46±3.30
48h
64.28±3.36
22.44±3.49
3.3±0.84
93.65±2.68
35.47±7.92
12.33±9.42
2.5 FC与5-FU协同加强作用的初步研究
本研究提示FC2μg/ml+5-FU10μg/ml及单用其中一种药对人肿瘤细胞具有更好的抑制作用(P<0.05)
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表5 24、48h FC(2μg/ml)与5-FU(10μg/ml)
对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用 药物(浓度)
生长抑制率(%)
24h
48h
FC(2μg/ml)
19.34±6.26a
18.04±6.24a
5-FU(10μg/ml)
25.68±9.12a
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25.84±5.06a
FC(2μg/ml)+5
-FU(10μg/ml)
37.24±4.06
45.75±0.06
a.与FC+5-FU比较，P<0.01。
2.6 凋亡实验
随着浓度的增加，Bel-7402的凋亡率也有升高，至32μg/ml处理5h凋亡率可达23.1%(如表6)表6 5h不同浓度FC处理Bel-7402
的凋亡率% FC(μg/ml)
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凋亡率(%)
0
5.0
8
11.5
16
19.6
32
23.1
图1 5h不同浓度FC处理Bel-7402的凋亡流式细胞图
A. 阴性对照(0μg/ml) B. FC(8μg/ml) C. FC(16μg/ml) D. FC(32μg/ml)
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3 讨论
3.1 本实验结果显示人肝癌细胞对FC的细胞毒性作用是敏感的。24h及48h的IC50分别为4.34和3.96μg/ml.由于FC的血清廓清时间为15h，故本实验着重考察短时间(24及48h)时FC对各细胞系的细胞毒性作用.目前对蛇毒抗肿瘤的机理的研究集中于以下几点：①破坏肿瘤细胞的细胞膜，本实验中的FC已证实在提纯中除去了磷脂酶A2，因此其主要的机理似乎在于能与细胞膜上的磷脂结合形成稳定的复合物，或选择性地与膜受体蛋白结合产生跨膜通道，干扰钙与细胞膜的结合，从而影响膜稳定性，致不可逆的细胞膜去极化，最终导致肿瘤细胞死亡[5]，晚近研究还发现FC可激活细胞膜上的组织磷脂酶而影响细胞膜上的Ca2+-Mg2+-ATP酶等的活性，从而引发一系列病理过程，最终导致细胞损伤[6]，也有本地学者认为FC能诱导肝癌细胞Bel-7402内产生一氧化氮(NO)和脂质过氧化酶(LPO)，从而导致肿瘤细胞死亡[7];②降低肿瘤细胞的恶性程度[8]；③抑制肿瘤细胞DNA合成.本流式细胞仪实验中我们观察到随着FC浓度的升高,肿瘤细胞的四倍体与二倍体比例明显下降。
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3.2 从各细胞系对各药物的敏感性比较来看,对Bel-7402的IC50而言,FC低于5-Fu；对HBE16而言,FC的IC50则高于5-Fu;因为肝癌细胞属于腺上皮细胞,而正常肝细胞难于分离传代,所以我们将同属腺上皮的人支气管上皮细胞HBE16作为正常对照,,应仍具有可比性[4]。
上述实验说明:①FC能具有较高选择性。它能选择性作用于肝癌细胞,在有效浓度下对正常组织保持低毒性。例如24,48h FC对Bel-7402的IC50分别为4.34和3.96μg/ml,但同浓度时,FC对HBE16的生长抑制率仅为2.9%及接近0%。本实验提示此选择性与细胞的增殖快慢似无直接联系.据我们观察,同样培养条件下,Bel-7402、HBE16及HAM的增殖速率基本相同,甚至前者的增殖速率稍慢于后两者；②FC对肝癌细胞毒性作用的选择性强于5-Fu(P<0.05)。5-Fu对BeL-7402的两时段(24,48h)IC50在10～100μg/ml之间,在此浓度下对HBE16的抑制率高达44%～88%，而FC 8μg/ml时对Bel-7402的抑制率分别已达76.4%和85.79%，对HBE16仅为27.13%和37.44%。两药对两细胞系的作用存在差异显著性(P<0.05).说明FC可能在在有效，有选择性的同时,也是初步具备低毒性和安全性的抗癌药。
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3.3 FC可能对胚胎性细胞具有较高的抑制作用。HAM为正常人的胚胎性上皮细胞。两时段内FC对HAM的抑制作用均与Bel-7402无差异(P<0.05)，但与正常成熟上皮细胞HBE16存在差异显著性(P<0.01)。故我们推测FC可能对胎儿及婴幼儿的正常细胞具有一定的毒性。再者，FC与5-FU可产生协同互补作用,也提示了两药作用机制的差异。凑巧的是癌细胞因其分化较正常细胞差，在某种程度上也属于胚胎性幼稚上皮细胞。所以在此方面Bel-7402与HAM具有一定的相似之处，因此FC对Bel-7402与HAM作用就凸显不出差别(P>0.05)，这提示FC抑制肿瘤作用的机理也许在于其特异作用于分化较差(低)的细胞，从而使Bel-7402、HAM对FC的敏感性高于分化成熟的HBE-16。
3.4 FC诱导细胞凋亡的机理
可能机理有：①下调抑制细胞凋亡的相关基因，如Bcl-2，并上调促进细胞凋亡的相关基因，如Bax族基因[9]。谭获等提出FC可通过下调Bcl-2/Bax基因比例而诱导白血病细胞株凋亡；②诱导癌细胞内产生NO和LPO从而诱导凋亡[7]。龚海云等研究显示了FC能诱导人肝癌细胞株Bel-7402细胞内产生大量的NO和LPO，两者可能通过有关途径诱导凋亡；③影响肿瘤细胞内游离钙的浓度[10]。龚海云指出FC能刺激人肝癌细胞株Bel-7402胞浆游离钙升高。Ca2+不仅与几种Ca2+-依赖性凋亡相关核酸内切酶的活性密切相关，还能促使Ca2+-依赖性谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase)与钙蛋白酶(Calpain)等活化，从而引起胞质蛋白的交联与细胞质的破坏，最终导致细胞碎裂。因此，Ca2+被认为是活化死亡程序和最终引起核小体间(Internucleosomal)DNA切割的关键阳离子[11]；④诱导肿瘤细胞生成H2O2，从而诱导凋亡[12]。南韩的Suhr等指出南韩种蛇毒中含有L-氨基酸氧化酶(LAO)，可催化L-氨基酸生成H2O2，从而诱导凋亡。
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本实验中，我们利用流式细胞仪及PI法，初步证实8、16及32μg/ml的FC能在5h内有效诱导人肝癌细胞的凋亡，且呈良好量效关系。
综上所述，相对于传统TACE化疗药如5-Fu等而言，FC可能是有效的、选择性较高的抗肝癌新药。但其作用有待进一步体内及临床实验证明。
(致谢;吴中亮、陈家教授无偿提供实验室和大部分实验设备、试剂， 刘云岗副教授在本课题技术路线、细胞学实验操作中给予帮助)
基金项目：广东省卫生厅(A1998262)。
作者简介：刘慰(1970-)，男，硕士，住院医师。研究方向：肝癌外科治疗。
作者单位：胡以则(广州医学院第二附属医院外科, 广州 510260)
, 百拇医药 参考文献
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(收稿：1999-04-30), http://www.100md.com