人肺癌细胞转染野生型P53基因对生长的影响
作者：赖祥进 吴克 全家妩
单位：赖祥进(广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021)；吴克 全家妩(卫生部武汉生物制品研究所 武汉 430060)
关键词：基因；肺癌；凋亡
广西医科大学学报000212
摘要 目的：研究转染野生型P53基因对人肺癌细胞的生长影 响作用。方法：将带有野生型P53基因的pCEP4质粒，通过Lipofectin 转染肺癌细胞，用四甲基偶氮唑(MTT)法观察细胞的生长情况。结果：转染野生型P53基因，可使肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺 癌细胞的生长明显受到抑制。结论：野生型P53基因有效抑制肺癌细胞的生长，可作为肺癌 基因治疗的一种手段。
, http://www.100md.com 中国图书资料分类法分类号 R37
STUDY ON EFFECT OF TRANSFECTION WITH WILD-TYPE P53 GENE ON GROWT H OF LUNG CARCINOMA CELLS
Lai Xiangjin,Wu Ke,Quan Jiawu
(Department of Biochemistry,Guangxi Medical University, Nanning 530021)
(Wuhan Institute of Biological Products,Mi nstry of Public Health, Wuhan 430060)
Abstract Objective:To observe the effecti on the growth of lu ng carcinoma cells by transfection with wild-type P53(wt-P53)gene o n growth.Methods:The lung carcinoma cells were transfected by the Plasm ids pCEP4 recombined with wild-type P53 gene at lipofectin-mediated.The growing tests of the lung carcinoma cells were studied by monotetrazolium(MTT) analysis.Results:The growth of the lung adenocarcinoma cells,lung squam ous cell carcinoma cells as well as small-cell lung carcinoma cells were observ ably suppressed after transfection with the wt-P53 gene.Conclusion:The wt-P53 gene effectively suppressed the g rowth of lung carcinoma cells,and this is a way for the gene therapy of lung car cinoma
, 百拇医药
Key words gene；lung carcinoma;apoptosis
许多资料表明，野生型P53基因(wt-P53基因)不但抑制肿瘤细胞增殖，而 且诱导肿瘤细胞凋亡[1，2]。我们以前的实验观察了wt-P53基因对人小细 胞肺癌的凋亡作用[3]。在病理学上，肺癌有多种分型，为了更全面地评价wt-P 53基因对肺癌的作用，本实验分别观察肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌在转染wt-P5 3基因后的生长情况，以探讨各种肺癌的基因治疗应用前景。
1 材料与方法
1.1 细胞株及培养条件：人未分化小细胞肺癌LTEP-P株由中国医学科学院肿瘤研究所提供。人肺腺癌细胞A54 9 株和肺鳞癌细胞株LTEP-78由第三军医大学提供。用含抗生素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液(Gibco)在37℃、5%CO2培养箱培养，至对数生长期用于实验。
, 百拇医药
1.2 P53基因及质粒：含野生型P53基因(wt-P53基因)cDNA质粒pCEP4 -P53，由日本国立癌中心口野辜辛教授惠赠。将质粒pCEP4-P53转染感受态 细胞E.coli JM109菌株，用含筛选抗生素的LB肉汤培养基进行扩增。经碱裂解法提取该质 粒，保存在含RNase A的Tris-EDTA缓冲液(TE-RNase)中备用。用限制性内切酶BamHⅠ酶切 后在琼脂糖凝胶中电泳，得到一1.8kb区带。经转膜后用P53基因探针进行分子杂交 证实该区带为P53基因。收取另一区带的质粒DNA，再转染感受态细胞E.coli JM109 菌株，进行扩增、提取收集质粒pCEP4，保存在含RNase A的Tris-EDTA缓冲液(TE-RNase) 中备用。
1.3 Lipofectin介导的基因转染：脂质转染试剂Lipofectin(购自GibcoBRL)、转铁蛋白(T ransferrin，购自Sigma)与质粒pCEP4-P53或质粒pCEP4按一定比例混合，经在1%琼 脂糖凝胶电泳加以鉴定后组成基因转染制剂。取对数生长期肺癌细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS )洗细胞一次，离心后用无血清培养基调细胞数为1×105个/ml，接种于24孔细胞培养板上 ，置37℃、5%CO2培养2 h。加入配制好的基因转染制剂后轻柔混合使分布均匀，再置37 ℃、5%CO2培养6 h。弃含转染制剂的培养液，加入含10%胎牛血清的1640培养液培养待 测。
, 百拇医药
1.4 四甲基偶氮唑(MTT)试验：在细胞培养板设定孔中分别加入含质粒pCEP4-P53 和质粒pCEP4的基因转染制剂，以不加基因转染制剂的细胞孔作对照组，置37℃、5%CO2 培养6 h。弃含转染制剂的培养液，加入含10%胎牛血清的1640培养液继续培养。分别在 转染前及第1、2、3、5、7天以异丙醇为溶剂，参照我们以前的实验方法[4] ，测定各组的OD570nm值。以时间为横坐标，以OD570nm值为纵坐标画出各组细 胞的生长曲线。
2 结 果
肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌细胞在RPMI 1640培养基中生长良好，第1～3天迅速增长， 约第5天达到高峰。小细胞肺癌细胞经转染克隆wt-P53基因的质粒pCEP4-P53 后，细胞生长在第2天起明显抑制，第5天、第7天抑制作用更加显著。第7天有68.8% 的细胞受到抑制而转染单纯质粒pCEP4的细胞生长情况接近于对照组(见图1)。
, 百拇医药
转染含wt-P53基因的质粒pCEP4-P53对人肺腺癌细胞株A549生长的影响 在从第3天后开始显示出来，直到第7天明显抑制细胞的生长，与对照组相比抑制73.2% 细胞。而转染不带wt-P53基因的质粒pCEP4的细胞组则与对照组的生长曲线相近(见 图2)。
图1 肺腺癌细胞A549生长曲线
图2 小细胞肺癌LTEP的生长曲线
肺鳞癌细胞株LTEP-78的生长情况有所不同，转染质粒pCEP4-P53后，出现一定 的抑制作用。但是，第5天开始出现细胞增殖现象，到第7天只能抑制53.2%细胞生长(见 图3)。
, 百拇医药
本实验利用转染wt-P53基因对肺癌的三种细胞进行观察，发现三种肺癌细胞均 受wt-P53基因不同程度的抑制作用。如将每种细胞的实验组与对照组OD570nm 值相比，按(对照组OD570nm-实验组OD570nm)/对照组OD570nm，求出第 1、2、3、5和7天的相对抑瘤率，将抑瘤率与时间作坐标(见图4)。从图上可发现 wt-P53基因对小细胞肺癌和肺腺癌细胞的抑瘤作用较好，而肺鳞癌细胞相对较差。 另一方面，转染单纯质粒DNA的pCEP4后，三种肺癌细胞的生长情况与对照组相近，说明基因 转染制剂无明显毒性，经进一步研究完善可作为基因治疗手段。
图3 肺鳞癌LTEP-78生长曲线
, http://www.100md.com
图4 P53基因对三种肺癌细胞抑制率的比较
3 讨 论
野生型P53基因抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。虽然机理不详，但是许多研 究表明调节细胞的生长及启动细胞的凋亡与野生型P53基因正确表达的P53蛋白 所含有丰富的脯氨酸有关[4]。大多数肿瘤细胞的P53基因是缺失、变异或者 核苷酸的点突变，以至表达异常的P53蛋白，不能正常调节细胞生长。因此，我们设 计将正常的野生型P53基因导入肿瘤细胞中进行基因治疗，有望调节肿瘤细胞的生长 。实验结果显示，转染wt-P53基因的肺癌细胞在第3天后就出现明显的生长抑制作用 ，到第5天至第7天更为明显。这与转染wt-P53基因到肺癌细胞后第3天就有正常P 53蛋白的表达峰相关[5]。另一方面，使用MTT法检测时发现，转染wt- P53基因的肿瘤细胞在第三天就出现明显的抑制作用，而有些实验采用G418经过长时 间的培养进行抗性克隆筛选[6]，可能会忽略wt-P53基因在短时间内就抑制 肿瘤细胞生长及细胞的凋亡。因此认为本实验方法与之相比较为客观与可靠。
, http://www.100md.com
据报道转染wt-P53基因不但抑制肿瘤的生长和诱导肺癌细胞凋亡，而且增加肺 癌细胞对化疗的敏感性[7]。为了寻找对肺癌治疗的最佳方法，本实验通过观察细 胞的生长曲线来探讨转染P53基因对各种肺癌细胞的抑制程度。研究发现，转染wt-P 53基因的三种肺癌细胞中，肺腺癌细胞的生长抑制作用较明显，小细胞肺癌次之，而 肺鳞癌在第5、7天逐渐出现一定生长恢复情况。可能与三种细胞的恶性程度有关。这些实验 结果为今后进行肺癌的基因治疗提供理论依据。
参 考 文 献
1，Nguyen DM,Wiehle SA,Koch PE,et al.Delivery of the P53 tumor su ppressor gene into lung cancer cells byanadenovirus/DNAcomplex.Cancer Gene Ther apy,1997,4(3):191-198.
, 百拇医药
2，Coll JL,Negoescu A,Louis N,et al.Antitumor activity of bax and P5 3 naked gene transfer in lung cancer:in vitro and in vivo analysis.Human Gene Therapy,1998,9(14):2 063-2 074.
3，吴 克，全家妩.人类小细胞肺癌细胞转染野生型P53基因发生的凋亡. 中国生物制品学杂志，1999,12(2):65-68.
4，Walker KK,Levine AJ.Identification of a novel P53 functional do main that is necessary for efficient growth suppression.Proc Natl Acad Sci USA ，1996,93(26):15 335-15 340.
, http://www.100md.com
5，Zhang WW,Fang X,Mazur W,et al.High-efficiency gene transfer and hi gh-level expression of wild-type P53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus.Cancer Gene Therapy，1994，1(1):5-13.
6，李竹红，诸亚君，曹禄森，等.野生型P53基因促进长春新碱诱导的细胞 凋亡.药学学报,1997,32(8):565-568.
7，Fujiwara T,Grimm EA,Mukhopadhyay T,et al.Induction of chemosensitivit y in human lung cancer cells in vivo by adenovirus -mediated transfer of the wi ld-type P53 gene.Cancer Research,1994,54(9):2 287-2 291.
收稿日期：1999-12-30, 百拇医药
单位：赖祥进(广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021)；吴克 全家妩(卫生部武汉生物制品研究所 武汉 430060)
关键词：基因；肺癌；凋亡
广西医科大学学报000212
摘要 目的：研究转染野生型P53基因对人肺癌细胞的生长影 响作用。方法：将带有野生型P53基因的pCEP4质粒，通过Lipofectin 转染肺癌细胞，用四甲基偶氮唑(MTT)法观察细胞的生长情况。结果：转染野生型P53基因，可使肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺 癌细胞的生长明显受到抑制。结论：野生型P53基因有效抑制肺癌细胞的生长，可作为肺癌 基因治疗的一种手段。
, http://www.100md.com 中国图书资料分类法分类号 R37
STUDY ON EFFECT OF TRANSFECTION WITH WILD-TYPE P53 GENE ON GROWT H OF LUNG CARCINOMA CELLS
Lai Xiangjin,Wu Ke,Quan Jiawu
(Department of Biochemistry,Guangxi Medical University, Nanning 530021)
(Wuhan Institute of Biological Products,Mi nstry of Public Health, Wuhan 430060)
Abstract Objective:To observe the effecti on the growth of lu ng carcinoma cells by transfection with wild-type P53(wt-P53)gene o n growth.Methods:The lung carcinoma cells were transfected by the Plasm ids pCEP4 recombined with wild-type P53 gene at lipofectin-mediated.The growing tests of the lung carcinoma cells were studied by monotetrazolium(MTT) analysis.Results:The growth of the lung adenocarcinoma cells,lung squam ous cell carcinoma cells as well as small-cell lung carcinoma cells were observ ably suppressed after transfection with the wt-P53 gene.Conclusion:The wt-P53 gene effectively suppressed the g rowth of lung carcinoma cells,and this is a way for the gene therapy of lung car cinoma
, 百拇医药
Key words gene；lung carcinoma;apoptosis
许多资料表明，野生型P53基因(wt-P53基因)不但抑制肿瘤细胞增殖，而 且诱导肿瘤细胞凋亡[1，2]。我们以前的实验观察了wt-P53基因对人小细 胞肺癌的凋亡作用[3]。在病理学上，肺癌有多种分型，为了更全面地评价wt-P 53基因对肺癌的作用，本实验分别观察肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌在转染wt-P5 3基因后的生长情况，以探讨各种肺癌的基因治疗应用前景。
1 材料与方法
1.1 细胞株及培养条件：人未分化小细胞肺癌LTEP-P株由中国医学科学院肿瘤研究所提供。人肺腺癌细胞A54 9 株和肺鳞癌细胞株LTEP-78由第三军医大学提供。用含抗生素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液(Gibco)在37℃、5%CO2培养箱培养，至对数生长期用于实验。
, 百拇医药
1.2 P53基因及质粒：含野生型P53基因(wt-P53基因)cDNA质粒pCEP4 -P53，由日本国立癌中心口野辜辛教授惠赠。将质粒pCEP4-P53转染感受态 细胞E.coli JM109菌株，用含筛选抗生素的LB肉汤培养基进行扩增。经碱裂解法提取该质 粒，保存在含RNase A的Tris-EDTA缓冲液(TE-RNase)中备用。用限制性内切酶BamHⅠ酶切 后在琼脂糖凝胶中电泳，得到一1.8kb区带。经转膜后用P53基因探针进行分子杂交 证实该区带为P53基因。收取另一区带的质粒DNA，再转染感受态细胞E.coli JM109 菌株，进行扩增、提取收集质粒pCEP4，保存在含RNase A的Tris-EDTA缓冲液(TE-RNase) 中备用。
1.3 Lipofectin介导的基因转染：脂质转染试剂Lipofectin(购自GibcoBRL)、转铁蛋白(T ransferrin，购自Sigma)与质粒pCEP4-P53或质粒pCEP4按一定比例混合，经在1%琼 脂糖凝胶电泳加以鉴定后组成基因转染制剂。取对数生长期肺癌细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS )洗细胞一次，离心后用无血清培养基调细胞数为1×105个/ml，接种于24孔细胞培养板上 ，置37℃、5%CO2培养2 h。加入配制好的基因转染制剂后轻柔混合使分布均匀，再置37 ℃、5%CO2培养6 h。弃含转染制剂的培养液，加入含10%胎牛血清的1640培养液培养待 测。
, 百拇医药
1.4 四甲基偶氮唑(MTT)试验：在细胞培养板设定孔中分别加入含质粒pCEP4-P53 和质粒pCEP4的基因转染制剂，以不加基因转染制剂的细胞孔作对照组，置37℃、5%CO2 培养6 h。弃含转染制剂的培养液，加入含10%胎牛血清的1640培养液继续培养。分别在 转染前及第1、2、3、5、7天以异丙醇为溶剂，参照我们以前的实验方法[4] ，测定各组的OD570nm值。以时间为横坐标，以OD570nm值为纵坐标画出各组细 胞的生长曲线。
2 结 果
肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌细胞在RPMI 1640培养基中生长良好，第1～3天迅速增长， 约第5天达到高峰。小细胞肺癌细胞经转染克隆wt-P53基因的质粒pCEP4-P53 后，细胞生长在第2天起明显抑制，第5天、第7天抑制作用更加显著。第7天有68.8% 的细胞受到抑制而转染单纯质粒pCEP4的细胞生长情况接近于对照组(见图1)。
, 百拇医药
转染含wt-P53基因的质粒pCEP4-P53对人肺腺癌细胞株A549生长的影响 在从第3天后开始显示出来，直到第7天明显抑制细胞的生长，与对照组相比抑制73.2% 细胞。而转染不带wt-P53基因的质粒pCEP4的细胞组则与对照组的生长曲线相近(见 图2)。
图1 肺腺癌细胞A549生长曲线
图2 小细胞肺癌LTEP的生长曲线
肺鳞癌细胞株LTEP-78的生长情况有所不同，转染质粒pCEP4-P53后，出现一定 的抑制作用。但是，第5天开始出现细胞增殖现象，到第7天只能抑制53.2%细胞生长(见 图3)。
, 百拇医药
本实验利用转染wt-P53基因对肺癌的三种细胞进行观察，发现三种肺癌细胞均 受wt-P53基因不同程度的抑制作用。如将每种细胞的实验组与对照组OD570nm 值相比，按(对照组OD570nm-实验组OD570nm)/对照组OD570nm，求出第 1、2、3、5和7天的相对抑瘤率，将抑瘤率与时间作坐标(见图4)。从图上可发现 wt-P53基因对小细胞肺癌和肺腺癌细胞的抑瘤作用较好，而肺鳞癌细胞相对较差。 另一方面，转染单纯质粒DNA的pCEP4后，三种肺癌细胞的生长情况与对照组相近，说明基因 转染制剂无明显毒性，经进一步研究完善可作为基因治疗手段。
图3 肺鳞癌LTEP-78生长曲线
, http://www.100md.com
图4 P53基因对三种肺癌细胞抑制率的比较
3 讨 论
野生型P53基因抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。虽然机理不详，但是许多研 究表明调节细胞的生长及启动细胞的凋亡与野生型P53基因正确表达的P53蛋白 所含有丰富的脯氨酸有关[4]。大多数肿瘤细胞的P53基因是缺失、变异或者 核苷酸的点突变，以至表达异常的P53蛋白，不能正常调节细胞生长。因此，我们设 计将正常的野生型P53基因导入肿瘤细胞中进行基因治疗，有望调节肿瘤细胞的生长 。实验结果显示，转染wt-P53基因的肺癌细胞在第3天后就出现明显的生长抑制作用 ，到第5天至第7天更为明显。这与转染wt-P53基因到肺癌细胞后第3天就有正常P 53蛋白的表达峰相关[5]。另一方面，使用MTT法检测时发现，转染wt- P53基因的肿瘤细胞在第三天就出现明显的抑制作用，而有些实验采用G418经过长时 间的培养进行抗性克隆筛选[6]，可能会忽略wt-P53基因在短时间内就抑制 肿瘤细胞生长及细胞的凋亡。因此认为本实验方法与之相比较为客观与可靠。
, http://www.100md.com
据报道转染wt-P53基因不但抑制肿瘤的生长和诱导肺癌细胞凋亡，而且增加肺 癌细胞对化疗的敏感性[7]。为了寻找对肺癌治疗的最佳方法，本实验通过观察细 胞的生长曲线来探讨转染P53基因对各种肺癌细胞的抑制程度。研究发现，转染wt-P 53基因的三种肺癌细胞中，肺腺癌细胞的生长抑制作用较明显，小细胞肺癌次之，而 肺鳞癌在第5、7天逐渐出现一定生长恢复情况。可能与三种细胞的恶性程度有关。这些实验 结果为今后进行肺癌的基因治疗提供理论依据。
参 考 文 献
1，Nguyen DM,Wiehle SA,Koch PE,et al.Delivery of the P53 tumor su ppressor gene into lung cancer cells byanadenovirus/DNAcomplex.Cancer Gene Ther apy,1997,4(3):191-198.
, 百拇医药
2，Coll JL,Negoescu A,Louis N,et al.Antitumor activity of bax and P5 3 naked gene transfer in lung cancer:in vitro and in vivo analysis.Human Gene Therapy,1998,9(14):2 063-2 074.
3，吴 克，全家妩.人类小细胞肺癌细胞转染野生型P53基因发生的凋亡. 中国生物制品学杂志，1999,12(2):65-68.
4，Walker KK,Levine AJ.Identification of a novel P53 functional do main that is necessary for efficient growth suppression.Proc Natl Acad Sci USA ，1996,93(26):15 335-15 340.
, http://www.100md.com
5，Zhang WW,Fang X,Mazur W,et al.High-efficiency gene transfer and hi gh-level expression of wild-type P53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus.Cancer Gene Therapy，1994，1(1):5-13.
6，李竹红，诸亚君，曹禄森，等.野生型P53基因促进长春新碱诱导的细胞 凋亡.药学学报,1997,32(8):565-568.
7，Fujiwara T,Grimm EA,Mukhopadhyay T,et al.Induction of chemosensitivit y in human lung cancer cells in vivo by adenovirus -mediated transfer of the wi ld-type P53 gene.Cancer Research,1994,54(9):2 287-2 291.
收稿日期：1999-12-30, 百拇医药