GM-CSF基因转导的肿瘤疫苗研究
作者：李桂生 张叔人 高全立 杨春旭
单位：李桂生 杨春旭(广西柳州市工人医院 柳州 545005)；张叔人 高全立(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 通讯作者 100021)
关键词：GM-CSF；肿瘤；瘤苗
广西医科大学学报000205
摘要 目的：观察GM-CSF基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效 果。方法：用电穿孔法将小鼠GM-CSF的表达质粒导入RMA淋巴瘤细胞， 经G418筛选后，将GM-CSF高表达克隆(RMA-GM)细胞皮下接种C57BL/6小鼠，观察成 瘤性，以及经丝裂霉素-C处理灭活的RMA-GM细胞免疫小鼠，观察抗肿瘤作用。结果：RMA-GM细胞皮下接种C57BL/6小鼠后出瘤时间比对照组略延 长。经丝裂霉素-C处理灭活的RMA-GM细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比 ，肿瘤生长速度减慢，小鼠生存期明显延长，并且40%小鼠无瘤长期生存。结论：在RMA肿瘤模型中,GM-CSF基因转导的肿瘤细胞瘤苗有较好的 抗肿瘤免疫效果，此法有可能成为治疗肿瘤的有效途径。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R73-36
STUDY OF GM-CSF GENE TRANSFERED TUMOR VACCINE
Li Guisheng,Zhang Shuren,Gao Quanli
(Liuzhou Worker Hospital,Liu zhou 545005,China)
Abstract Objective：To evaluate the antitumor effect of GM-C SF gene transfered Tumor Vaccine.Methods：A mouse GM-CSF expressing plasmid was transferred into RMA lymphoma cell line by electroporation.After screening by G418，the high titer GM-CSF expressing cell clone (RMA-GM) were injecte d into the C56BL/6 mice subcutaneously.Tumor formation was evaluated.Mice were immmunized with mitomycin-C inactivated RMA-GM cells and antitumor effects we re evaluated.Results：Tumor formation in C57BL/6 mice inoculated by the RMA -GM cells was delayed slightly.After vaccination with mitomycin-C inactivated RMA-GM cells,the mice were challenged by parental tumor cells.Tumor developme n t speed was reduced;survival time was remarkably delayed compared with the contr ol groups and 40% mice without tumor were in long term survival.Conclusion：GM-CSF gene transfered tumor vaccine in RMA tumor model induced better antitumor immune effect and will be a novel approach to ca ncer in the future.
, 百拇医药
Key words GM-CSF；tumor；vaccine
1901年，Daul Ehrlich首次提出机体免疫系统具有控制肿瘤生长的能力，70年代初，Bu rnet正式提出免疫监视学说(Immune Surveillance)，认为肿瘤能被免疫系统识别，视为“ 非己”而被宿主排斥。肿瘤发生的一个重要机制就是肿瘤抗原表达低下或者肿瘤表面某些重 要分子表达低下或缺如，机体免疫系统不能识别肿瘤抗原或免疫系统不能被激活，从而发生 肿瘤。转粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)基因肿瘤疫苗可使肿瘤抗原有效表达从 而发挥抗肿瘤效应已在多种肿瘤得到证实[1]。但大部分以逆转录病毒或质脂体方 法将基因导入细胞。本实验用电穿孔法将构建的载体导入肿瘤细胞，观察抗肿瘤免疫效果。
1 材料与方法
1 .1 材料：细胞系 R MA 为 C 57BL/6 小 鼠来源的 T 淋 巴细胞瘤 (H-2b)，本室冻存。载体PJL 3GM-CSF携带有936bp长小鼠GM-CSF的cDNA，由澳大利亚Ludwig肿瘤研究所Gough教授惠 赠。pUC119由本所生化室黄常志教授惠赠，pcDNA3本室保存。
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1.2 实验动物：C57BL/6小鼠，体质量18～20 g，由医科院动物室提供。
1.3 方法
1.3.1 真核表达质粒pcDNA3GM-CSF基因构建、电穿孔转染RMA肿瘤细胞、RMA-G418抗 性克隆筛选，另文待发表。
1.3.2 细胞生长曲线：生长旺盛RMA细胞按1×103/孔接种96孔板，每种细胞3个复 孔，分别培养0、24、48、72 h，每孔加入10 μl MTT(mg/μl)，37℃ 5% CO2 再培养5 h ，弃上清，每孔加200 μl DMSO，振荡混匀，酶标仪检测OD630，OD570和OD 490吸光度值。
1.3.3 RMA最小致瘤量实验：5只小鼠一组，每只分别皮下接种RMA100、500、1 0 00、5 000、10 000个，观察小鼠成瘤情况，直至小鼠死亡的最小肿瘤细胞 接种数量即为RMA的最小致瘤量细胞数。
, 百拇医药
1.3.4 丝裂霉素灭活肿瘤细胞：将要处理的肿瘤细胞24 h前换液，收集肿瘤细胞，用RPM I-1640悬浮细胞，调细胞浓度为1×106/ml。每毫升加丝裂霉素1.5 mg，37℃放置1.5 ～2 h，每20 min振摇1次，然后PBS冲洗3次，收集肿瘤细胞。
1.3.5 转基因肿瘤细胞致瘤性动物实验：将转染了pcDNA3-mGM、pcDNA3和正常的R MA肿瘤细胞肋腹侧皮下接种，每种细胞接种的量分为1 000、2 000 和5 000个3组，这样共设9组动物，每组10只。观察实验动物的出瘤时间，肿瘤生长大小(每3 天测量1次肿块体积)及其死亡情况。
1.3.6 转基因瘤苗免疫实验：丝裂霉素-C灭活转导的RMA-GM、RMA-pcDNA3和正常RM A肿瘤细胞，分别以5×106个细胞注入小鼠双侧腹股沟，对照组注射PBS，每组10只，共4 组。免疫后第10天，于小鼠侧腹壁皮下接种5 000个RMA肿瘤细胞，观察实验动物的 出瘤时间、肿瘤生长大小(每3天测量1次肿块体积)及其死亡情况。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 肿瘤细胞生长曲线：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM细胞间形态无差别，体外生长速度无明显改变(图1)。
图1 RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM体外生长曲线
2.2 皮下接种致瘤性比较：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM分别皮下接种同基因小鼠C57BL /6，接种数量为1 000、2 000、5 000个3组，肿瘤均持续生长，但 与同一接种数量组相比，RMA-GM出瘤时间比RMA和RMA-pcDNA3平均晚3 d，肿块体积 也相应较小，但生存期无明显延长(见图2)。
2.3 免疫攻击实验：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM经丝裂霉素-C处理后，以5×106 个细胞数双侧腹股沟注射，免疫后第10天皮下接种5 000个RMA细胞，免疫接种RMA- GM组的小鼠肿瘤生长速度减慢(图3)，小鼠生存期延长(图4，表1)，其中有40%(4/10)小鼠长 期存活(超过60 d)。
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图2 用RMA,RMA-pcDNA3,RMA-GM细胞(2×103)皮下接种后肿瘤生长曲线
图3 用丝裂霉素-C处理的RMA,RMA-pcDNA3和RMA-GM接种小鼠后肿瘤生长 曲线
表1 用RMA-pcDNA3,RMA-GM细胞免疫接种后小鼠生存 情况 组 别
n
小鼠生存数量
30 d
45 d
RMA-GM
, 百拇医药
10
9
4
RMA-pcDNA3
10
4
0
两组比较，P<0.05
图4 用丝裂霉素-C处理的RMA,RMA-pcDNA3和RMA-GM接种小鼠后小鼠生长 情况
3 讨 论
, 百拇医药
本实验发现，筛选出的高表达克隆RMA-GM的体外生物学特性与正常RMA和只含空载体的 RMA相比没有明显的差异，如它们的形态相似，体外生长速度相同。在致瘤实验中，在相同 的皮下接种细胞数量下，RMA-GM比正常的和只含空载体的RMA出瘤时间延迟3d，肿块大小 也比同时期对照的小，生存期也略有延长，但无显著性差异。这一点与Nagai等[2] 的报道不完全相同，形成种差异的原因可能是所用细胞系不同，GM-CSF分泌量不同或转 染方法不同所引起。
大多数的文献报道，转GM-CSF基因的瘤细胞经γ-射线照射灭活后可作为有效的瘤苗 [2]。在所比较的多种转细胞因子基因制备的瘤苗中，转GM-CSF基因瘤苗免疫效果 较好。但也有相反的报道，如Arca等[3]报道将GM-CSF基因用逆转录病毒转染给B1 6BL6黑素瘤细胞，尽管24 h内可分泌GM-CSF 450 ng/106细胞，γ-射线灭活后免疫同基 因小鼠不能抵抗亲本肿瘤细胞的攻击。产生这些差异的原因是难以寻找的，因为被检测的细 胞类型和实验过程在不同的实验室是不同的。Nagai等[2]认为产生高效的免疫力并 不单单依靠肿瘤细胞产生的GM-CSF的量，GM-CSF须在接种肿瘤细胞部位以一定的水平维持 一定的时间，这样才能够活化抗原递呈细胞，如树突状细胞。
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我们用丝裂霉素-C灭活的肿瘤细胞作为瘤苗。正常的RMA细胞经丝裂霉素处理后，免疫 C57BL/6小鼠无1例可保护5 000个RMA细胞对小鼠的攻击。这一点与Chen等[4 ]的报道不同，产生的原因可能有三点，一是我们攻击的肿瘤细胞量是5 000个 而不是1 000个，二是γ-射线灭活瘤细胞的方法可能优于丝裂霉素-C灭活瘤细胞 的方法，三是两个实验室的细胞株或动物间存在差异。但RMA-GM经丝裂霉素-C灭活后免疫 小鼠产生的免疫保护力，明显强于含空载体的RMA对照组和正常RMA组。这可能是由于RMA-G M 经丝裂霉素-C灭活后在接种局部仍能保持一段时间分泌GM-CSF，诱导抗原递呈细胞聚集 在肿瘤接种部位并活化它们的抗原递呈能力，进而有效地捕获丝裂霉素-C灭活的RMA-GM- CSF所释放出的肿瘤抗原，激活T细胞产生免疫应答。灭活的RMA-GM免疫组10只小鼠中，4只 再攻击后没有长出肿瘤，5只肿块长到一定大小时停止生长，其中3只甚至出现肿块缩小现象 ，但这些小鼠最终都因肿瘤恢复增长而死亡，这些现象说明在肿瘤生长到一定阶段时，机体 免疫系统与肿瘤的斗争可能处于一种平衡状态，甚至一度免疫占了上风，如果此时采取增强 免疫功能的措施，有可能使肿瘤完全消退。
, 百拇医药
广西区科技厅资助项目(桂科攻 9731046)
参 考 文 献
1，Dranoff G,Jaffee EM,Lazenby A,et al.Irradiated tumor cells secreting mGM-CSF stimulates lasting long specific antitumor activity in mouse models.P roc Natl Acad Sci USA,1993,90:3 539.
2，Nagai E,Ogawa T,Kielian T,et al.Irradiated tumor cells adenovirally e ngineered to secret granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor establish antitumor immunity and eliminate pre-existing tumors in syngeneic mice.Cancer Immunol Immunother，1998，47:72.
, http://www.100md.com
3，Arca MJ,Krauss JC,Strome SE，et al.Diverse manifestation of tumorigen icity and immunogenicity displayed by the poorly immunogenic B16-BL6 melanoma t ransduced with cytokine genes.Cancer Immunol Immunother，1996，42:237.
4，Chen L,McGowan P,Ashe S,et al.Tumor immunogenicity determines the e f fect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity.J Exp Med，1994，17 9:523.
收稿日期：1999-12-01, 百拇医药
单位：李桂生 杨春旭(广西柳州市工人医院 柳州 545005)；张叔人 高全立(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 通讯作者 100021)
关键词：GM-CSF；肿瘤；瘤苗
广西医科大学学报000205
摘要 目的：观察GM-CSF基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效 果。方法：用电穿孔法将小鼠GM-CSF的表达质粒导入RMA淋巴瘤细胞， 经G418筛选后，将GM-CSF高表达克隆(RMA-GM)细胞皮下接种C57BL/6小鼠，观察成 瘤性，以及经丝裂霉素-C处理灭活的RMA-GM细胞免疫小鼠，观察抗肿瘤作用。结果：RMA-GM细胞皮下接种C57BL/6小鼠后出瘤时间比对照组略延 长。经丝裂霉素-C处理灭活的RMA-GM细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比 ，肿瘤生长速度减慢，小鼠生存期明显延长，并且40%小鼠无瘤长期生存。结论：在RMA肿瘤模型中,GM-CSF基因转导的肿瘤细胞瘤苗有较好的 抗肿瘤免疫效果，此法有可能成为治疗肿瘤的有效途径。
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中国图书资料分类法分类号 R73-36
STUDY OF GM-CSF GENE TRANSFERED TUMOR VACCINE
Li Guisheng,Zhang Shuren,Gao Quanli
(Liuzhou Worker Hospital,Liu zhou 545005,China)
Abstract Objective：To evaluate the antitumor effect of GM-C SF gene transfered Tumor Vaccine.Methods：A mouse GM-CSF expressing plasmid was transferred into RMA lymphoma cell line by electroporation.After screening by G418，the high titer GM-CSF expressing cell clone (RMA-GM) were injecte d into the C56BL/6 mice subcutaneously.Tumor formation was evaluated.Mice were immmunized with mitomycin-C inactivated RMA-GM cells and antitumor effects we re evaluated.Results：Tumor formation in C57BL/6 mice inoculated by the RMA -GM cells was delayed slightly.After vaccination with mitomycin-C inactivated RMA-GM cells,the mice were challenged by parental tumor cells.Tumor developme n t speed was reduced;survival time was remarkably delayed compared with the contr ol groups and 40% mice without tumor were in long term survival.Conclusion：GM-CSF gene transfered tumor vaccine in RMA tumor model induced better antitumor immune effect and will be a novel approach to ca ncer in the future.
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Key words GM-CSF；tumor；vaccine
1901年，Daul Ehrlich首次提出机体免疫系统具有控制肿瘤生长的能力，70年代初，Bu rnet正式提出免疫监视学说(Immune Surveillance)，认为肿瘤能被免疫系统识别，视为“ 非己”而被宿主排斥。肿瘤发生的一个重要机制就是肿瘤抗原表达低下或者肿瘤表面某些重 要分子表达低下或缺如，机体免疫系统不能识别肿瘤抗原或免疫系统不能被激活，从而发生 肿瘤。转粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)基因肿瘤疫苗可使肿瘤抗原有效表达从 而发挥抗肿瘤效应已在多种肿瘤得到证实[1]。但大部分以逆转录病毒或质脂体方 法将基因导入细胞。本实验用电穿孔法将构建的载体导入肿瘤细胞，观察抗肿瘤免疫效果。
1 材料与方法
1 .1 材料：细胞系 R MA 为 C 57BL/6 小 鼠来源的 T 淋 巴细胞瘤 (H-2b)，本室冻存。载体PJL 3GM-CSF携带有936bp长小鼠GM-CSF的cDNA，由澳大利亚Ludwig肿瘤研究所Gough教授惠 赠。pUC119由本所生化室黄常志教授惠赠，pcDNA3本室保存。
, http://www.100md.com
1.2 实验动物：C57BL/6小鼠，体质量18～20 g，由医科院动物室提供。
1.3 方法
1.3.1 真核表达质粒pcDNA3GM-CSF基因构建、电穿孔转染RMA肿瘤细胞、RMA-G418抗 性克隆筛选，另文待发表。
1.3.2 细胞生长曲线：生长旺盛RMA细胞按1×103/孔接种96孔板，每种细胞3个复 孔，分别培养0、24、48、72 h，每孔加入10 μl MTT(mg/μl)，37℃ 5% CO2 再培养5 h ，弃上清，每孔加200 μl DMSO，振荡混匀，酶标仪检测OD630，OD570和OD 490吸光度值。
1.3.3 RMA最小致瘤量实验：5只小鼠一组，每只分别皮下接种RMA100、500、1 0 00、5 000、10 000个，观察小鼠成瘤情况，直至小鼠死亡的最小肿瘤细胞 接种数量即为RMA的最小致瘤量细胞数。
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1.3.4 丝裂霉素灭活肿瘤细胞：将要处理的肿瘤细胞24 h前换液，收集肿瘤细胞，用RPM I-1640悬浮细胞，调细胞浓度为1×106/ml。每毫升加丝裂霉素1.5 mg，37℃放置1.5 ～2 h，每20 min振摇1次，然后PBS冲洗3次，收集肿瘤细胞。
1.3.5 转基因肿瘤细胞致瘤性动物实验：将转染了pcDNA3-mGM、pcDNA3和正常的R MA肿瘤细胞肋腹侧皮下接种，每种细胞接种的量分为1 000、2 000 和5 000个3组，这样共设9组动物，每组10只。观察实验动物的出瘤时间，肿瘤生长大小(每3 天测量1次肿块体积)及其死亡情况。
1.3.6 转基因瘤苗免疫实验：丝裂霉素-C灭活转导的RMA-GM、RMA-pcDNA3和正常RM A肿瘤细胞，分别以5×106个细胞注入小鼠双侧腹股沟，对照组注射PBS，每组10只，共4 组。免疫后第10天，于小鼠侧腹壁皮下接种5 000个RMA肿瘤细胞，观察实验动物的 出瘤时间、肿瘤生长大小(每3天测量1次肿块体积)及其死亡情况。
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2 结 果
2.1 肿瘤细胞生长曲线：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM细胞间形态无差别，体外生长速度无明显改变(图1)。
图1 RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM体外生长曲线
2.2 皮下接种致瘤性比较：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM分别皮下接种同基因小鼠C57BL /6，接种数量为1 000、2 000、5 000个3组，肿瘤均持续生长，但 与同一接种数量组相比，RMA-GM出瘤时间比RMA和RMA-pcDNA3平均晚3 d，肿块体积 也相应较小，但生存期无明显延长(见图2)。
2.3 免疫攻击实验：RMA、RMA-pcDNA3、RMA-GM经丝裂霉素-C处理后，以5×106 个细胞数双侧腹股沟注射，免疫后第10天皮下接种5 000个RMA细胞，免疫接种RMA- GM组的小鼠肿瘤生长速度减慢(图3)，小鼠生存期延长(图4，表1)，其中有40%(4/10)小鼠长 期存活(超过60 d)。
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图2 用RMA,RMA-pcDNA3,RMA-GM细胞(2×103)皮下接种后肿瘤生长曲线
图3 用丝裂霉素-C处理的RMA,RMA-pcDNA3和RMA-GM接种小鼠后肿瘤生长 曲线
表1 用RMA-pcDNA3,RMA-GM细胞免疫接种后小鼠生存 情况 组 别
n
小鼠生存数量
30 d
45 d
RMA-GM
, 百拇医药
10
9
4
RMA-pcDNA3
10
4
0
两组比较，P<0.05
图4 用丝裂霉素-C处理的RMA,RMA-pcDNA3和RMA-GM接种小鼠后小鼠生长 情况
3 讨 论
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本实验发现，筛选出的高表达克隆RMA-GM的体外生物学特性与正常RMA和只含空载体的 RMA相比没有明显的差异，如它们的形态相似，体外生长速度相同。在致瘤实验中，在相同 的皮下接种细胞数量下，RMA-GM比正常的和只含空载体的RMA出瘤时间延迟3d，肿块大小 也比同时期对照的小，生存期也略有延长，但无显著性差异。这一点与Nagai等[2] 的报道不完全相同，形成种差异的原因可能是所用细胞系不同，GM-CSF分泌量不同或转 染方法不同所引起。
大多数的文献报道，转GM-CSF基因的瘤细胞经γ-射线照射灭活后可作为有效的瘤苗 [2]。在所比较的多种转细胞因子基因制备的瘤苗中，转GM-CSF基因瘤苗免疫效果 较好。但也有相反的报道，如Arca等[3]报道将GM-CSF基因用逆转录病毒转染给B1 6BL6黑素瘤细胞，尽管24 h内可分泌GM-CSF 450 ng/106细胞，γ-射线灭活后免疫同基 因小鼠不能抵抗亲本肿瘤细胞的攻击。产生这些差异的原因是难以寻找的，因为被检测的细 胞类型和实验过程在不同的实验室是不同的。Nagai等[2]认为产生高效的免疫力并 不单单依靠肿瘤细胞产生的GM-CSF的量，GM-CSF须在接种肿瘤细胞部位以一定的水平维持 一定的时间，这样才能够活化抗原递呈细胞，如树突状细胞。
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我们用丝裂霉素-C灭活的肿瘤细胞作为瘤苗。正常的RMA细胞经丝裂霉素处理后，免疫 C57BL/6小鼠无1例可保护5 000个RMA细胞对小鼠的攻击。这一点与Chen等[4 ]的报道不同，产生的原因可能有三点，一是我们攻击的肿瘤细胞量是5 000个 而不是1 000个，二是γ-射线灭活瘤细胞的方法可能优于丝裂霉素-C灭活瘤细胞 的方法，三是两个实验室的细胞株或动物间存在差异。但RMA-GM经丝裂霉素-C灭活后免疫 小鼠产生的免疫保护力，明显强于含空载体的RMA对照组和正常RMA组。这可能是由于RMA-G M 经丝裂霉素-C灭活后在接种局部仍能保持一段时间分泌GM-CSF，诱导抗原递呈细胞聚集 在肿瘤接种部位并活化它们的抗原递呈能力，进而有效地捕获丝裂霉素-C灭活的RMA-GM- CSF所释放出的肿瘤抗原，激活T细胞产生免疫应答。灭活的RMA-GM免疫组10只小鼠中，4只 再攻击后没有长出肿瘤，5只肿块长到一定大小时停止生长，其中3只甚至出现肿块缩小现象 ，但这些小鼠最终都因肿瘤恢复增长而死亡，这些现象说明在肿瘤生长到一定阶段时，机体 免疫系统与肿瘤的斗争可能处于一种平衡状态，甚至一度免疫占了上风，如果此时采取增强 免疫功能的措施，有可能使肿瘤完全消退。
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广西区科技厅资助项目(桂科攻 9731046)
参 考 文 献
1，Dranoff G,Jaffee EM,Lazenby A,et al.Irradiated tumor cells secreting mGM-CSF stimulates lasting long specific antitumor activity in mouse models.P roc Natl Acad Sci USA,1993,90:3 539.
2，Nagai E,Ogawa T,Kielian T,et al.Irradiated tumor cells adenovirally e ngineered to secret granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor establish antitumor immunity and eliminate pre-existing tumors in syngeneic mice.Cancer Immunol Immunother，1998，47:72.
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3，Arca MJ,Krauss JC,Strome SE，et al.Diverse manifestation of tumorigen icity and immunogenicity displayed by the poorly immunogenic B16-BL6 melanoma t ransduced with cytokine genes.Cancer Immunol Immunother，1996，42:237.
4，Chen L,McGowan P,Ashe S,et al.Tumor immunogenicity determines the e f fect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity.J Exp Med，1994，17 9:523.
收稿日期：1999-12-01, 百拇医药