前列腺癌p53基因的点突变
作者：黄纲雄 陈碧芬 晋雯 高美钦
单位：福建医科大学病理解剖学教研室,福州 350004
关键词：前列腺肿瘤；基因p53；突变；聚核酶链反应；多态性；限制性片段长度
福建医科大学学报000213
摘要:目的 检测前列腺癌组织中p53基因突变的发生率，探讨其与前列腺癌发生的关系。方法 应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法，检测前列腺癌组织中p53基因第4号外显子72位密码子的点突变。结果 前列腺癌DNA样本中检出4号外显子p53基因点突变44%，其中杂合性突变36%，纯合性突变8%。对照组前列腺良性增生未见p53基因变化。结论 前列腺癌发生与p53基因突变有一定关系,应用PCR和Bstu I酶切多态性分析，对检测前列腺癌p53基因第4号外显子72位编码的点突变是一较特异的方法。
, 百拇医药
中图分类号:R394;R737.25;R446.8 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0135-03
Point Mutation of p53 Gene in Prostate Carcinomas
HUANG Gang-xiong,CHEN Bi-fen,JIN Wen
(Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)
ABSTRACT:Objective To determine how the point mutation of p53 was correlated with the prostate cancer.Methods Polymerization chain reaction(PCR)-restriction fragment length polymorphisms(RFLP) technique was used to detect p53 gene and analyze the mutation of p53 gene exon 4 condon 72 in 25 prostate carcinomas,DUl45 cell line and benign prostatic hypertrophy(BPH) as well as normal prostate tissues.Results P53 gene exon 4 was present in the chromosome DNA of all samples.The mutation p53 gene exon 4 condon 72 was present in 11 out of 25 carcinoma cases(44%),among them the mutation of homologosity in 2(8%),heterozygosity in 9(36%) and for the wild type of p53 with no mutation in 14(56%).No mutations were detected in those obtained from DU145 cell and 8 samples with non-tumors.Conclusion These findings suggest that p53 may be a target of chromosome 17 deletions and that this gene may play a role in the pathogenesis of prostate cancer.RFLP with Bstu I analysis of the p53 gene codon 72 may be a useful and direct technique to detect the point mutation of p53 gene in prostate cancer.
, 百拇医药
KEY WORDS:prostate neoplasm;gene p53;mutation;polymerization chain reaction;polymorphisms,restriction fragment length
肿瘤抑制基因p53蛋白的主要生物学功能是阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进细胞分化[1]。野生型p53基因是肿瘤抑制基因，p53基因的失活与人体许多恶性肿瘤的发生密切相关，其失活方式常以一个等位基因错义突变及另一个等位基因缺失最常见，已证实肺、乳腺、大肠等实体癌中约50%以上有p53基因突变或缺失[2～4]。笔者应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析和探针杂交技术，对前列腺癌和前列腺上皮异型增生、良性增生和正常前列腺组织的DNA样本，检测其p53基因变化,并探讨其与前列腺癌发生的关系。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 标本 1988～1992年本室25例前列腺癌组织，常规福尔马林固定石蜡包埋，其中细针穿刺1例,经尿道电切9例,根治切除15例。患者年龄62.6±9.7(50～89)岁。按Jewett改良分类法：B期11例，C期8例，D期6例，无A期病例。组织学分类：高分化6例，中分化15例，低分化4例。上皮异型增生(PIN Ⅱ级)1例，良性增生(BPH)5例，尸检的正常前列腺2例作对照。另以已知无p53基因第4号外显子突变的前列腺癌细胞株DU145为阴性对照。
1.2 PCR-RFLP检测
1.2.1 基因组DNA提取 按文献[5]，以Chelex-100煮沸法，经1.0 ml微型葡聚糖凝胶G-50过柱后收集DNA样品，-20°C保存。
1.2.2 寡核苷酸引物和p53 cDNA探针 参照Lambp等[6] 关于人p53基因结构的序列，选取第4号外显子引物：
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+5'GATGCTGTCCCCGGACGATATT3'
-5'CCAAGTCTGTGACTTGCACG3'
p53 cDNA探针用随机引物DNA标记试剂盒(丹麦DECO公司)和32P进行标记，并经葡聚糖G-25过柱分离回收后，液闪仪检测标记量。
1.2.3 PCR扩增反应体系及程序 按文献[5]方法进行，其扩增产物片段长度预计为247 bP，反应产物均经2%琼脂糖凝胶电泳及Southern印迹，转膜后与p53 cDNA基因探针杂交，最后放射自显影。
1.2.4 限制性内切酶RFLP反应 PCR产物经酚、氯仿-乙醇等纯化后，每例取样品15 μl以Bstu I(英国Biolabs公司)进行酶切反应，余5 μl样品不经酶反应作为对照。通过电泳、转膜、杂交及放射自显影等上述步骤，检测扩增产物酶切情况。已知p53基因4号外显子在72位密码子含有Bstu I酶切片位点(CG↓CG)。
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2 结 果
2.1 PCR扩增情况(图1)
图1 PCR扩增产物经探针杂交及放射自显影
4号外显子的p53基因片段(前3例为良性增生).
25例前列腺癌、8例非癌及DU145癌细胞株的DNA样本，经PCR扩增，分别在247 bp位置出现第4号外显子p53基因片段，表明所有样本中均有相应位点p53基因存在。
2.2 扩增产物的Bstu I酶切多态性分析
2.2.1 p53基因4号外显子的PCR-RFLP分析(图2)
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图2 p53基因4号外显子的PCR-RFLP分析示意图
2.2.2 扩增产物的Bstu I酶切情况(图3)
图3 p53基因4号外显子PCR-RFLP显示图像
A 前列腺癌DNA未经酶切与酶切片段对照(1～15为病例号),(1)完全酶切(N.9，12，14，15),DU145为阴性对照，呈完全性酶切；(2)不完全性酶切(N.1～5，7，8，10，13);(3)酶切无效(N.6，11).
B 正常前列腺和良性增生DNA扩增产物酶切图像，未经酶切(247 bp)和酶切(196 bp)片段对照(51 bp片段未显示).
25例前列腺癌于72位编码酶切位点处显示三种情况:(1)完全性酶切：出现196 bp和51 bp两个小片段(本图51 bp未显出)，表明酶切位点存在，为野生型p53基因，共14例(56%)；(2)不完全性酶切：出现247,196和51 bp 3条片段(51 bp未显出)，表示p53等位基因中一条酶切位点消失，为杂合性点突变，共9例(36%)；(3)不能被酶切：保持原来247 bp片段，表示p53二条等位基因均无酶切位点，为纯合性突变共2例(8%)。8例非癌组织及DU145癌细胞株均显示上述第1种情况，呈完全性酶切，表明均为野生型p53基因。
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3 讨 论
PCR-RFLP检测恶性肿瘤p53等位基因突变是基于基因多态性分析为基础，应用限制性内切酶的酶切方法，在p53基因病理改变高频区检测酶切位点变化情况，可发现p53基因异常和碱基突变，它常以正常组织或已知无p53基因点突变的DNA样本作对照而进行分析。笔者发现,25例前列腺癌组织中11例p53第4号外显子点突变，突变率为44%，其中杂合性突变9例(36%)，纯合性突变2例(8%)，表明前列腺癌发生与p53基因突变密切相关。文献报告前列腺癌p53基因4～11外显子突变率约5%～42%[7～9]，这一大范围的差别，一方面可能与前列腺癌为一种异质性肿瘤有关，它包含有癌上皮、不同程度异型增生上皮、正常上皮及平滑肌、血管纤维组织等多种成分混杂存在;另方面亦与各家采用方法的特异性程度不同有关[8] 。Gumerlock等[9]，推荐采用单链构象多态性方法并以基因组DNA及反转录cDNA联合检测，可使前列腺癌p53基因突变率提高到79%。此外，Mottaz等[10]报道早期前列腺癌中p53基因突变率仅5%，认为p53突变是前列腺癌发展过程中的晚发事件，因此p53突变率高低与前列腺癌预后有关。本文25例前列腺癌中C期和D期共14例，其中9例有p53基因点突变，B期11例仅2例p53基因突变，前列腺上皮异型增生(PIN Ⅱ)、良性增生(BPH)及正常对照共8例均无p53基因变化，这一结果支持p53基因变化是前列腺癌晚发事件的论点。
, http://www.100md.com
笔者应用PCR-RFLP分析和选用Bstu I内切酶方法,检出p53基因第4号外显子点突变达44%，这一方法较PCR-SSCP技术更简便易行，且可分析出杂合性或纯合性点突变情况。因此在选择适当的内切酶基础上可推广应用于检测p53基因5～11号外显子的点突变，并可广泛用于人体其他实体癌的p53基因点突变的筛选。
作者简介:黄纲雄(1967～)，男，讲师，医学硕士.
参考文献
[1]Gottlied TM,Oren M.P53 in growth control and neoplasm[J].Biochim Biophys Acta,1996,1287(2,3):77.
[2]Hensel CH,Xiang RH,Sakaguchi AY,et al.Use of SSCP and PCR techniques to detect p53 gene mutations in small cell lung cancer[J].Oncogene,1991,6(6):1067.
, 百拇医药
[3]Coles C,Condie A,Chetly U,et al.p53 mutations in breast cancer[J].Cancer Res,1992,52(19):5291.
[4]Cunningham J,Lust JA,Schaid DJ,et al.Expression of p53 and 17 p allelic loss in colorectal carcinoma[J].Cancer Res,1992,52(7):1974.
[5]Chen ML,Shieh YSC,Gerber MA.Comparative studies on the detection of hepatitis B virus DNA in frozen sections and paraffin sections by PCR[J].Mod Pathol,1991,3(5):555.
, http://www.100md.com
[6]Lamb P,Crawforl L.Characterization of the human p53 gene[J].Mol Cell Biol,1986,6(5):1379.
[7]Watanabe M,Fukutome K,Shiraishi T,et al.Differences in the p53 gene mutational spectra of prostate cancers between Japan and Western Countries[J].Carcinogenesis,1997,18(7):1355.
[8]Shi XB,Bodner SM,Deverv WRW,et al.Identification of p53 mutations in archival prostate tumors,sensitivity of an optimized SSCP assay[J].Diagn Mol Pathol,1996,5(4):271.
, 百拇医药
[9]Gumerlock PH,Chi SG,Shi XB,et al.P53 abnormalities in primary prostate cancer:Single-stand conformation polymorphism analysis of complementary DNA in comparison with genomic DNA.The cooperative prostate network[J].J Natl Cancer Inst,1997,89(1):66.
[10]Mottaz AE,Markwalder R,Fey MF,et al.Abnormal p53 expression is rare in clinically localized human prostate cancer:comparison between immunohistochemical and molecular detection of p53 mutations[J].Prostate,1997,31(4):209.
收稿日期:1999-10-09, http://www.100md.com
单位：福建医科大学病理解剖学教研室,福州 350004
关键词：前列腺肿瘤；基因p53；突变；聚核酶链反应；多态性；限制性片段长度
福建医科大学学报000213
摘要:目的 检测前列腺癌组织中p53基因突变的发生率，探讨其与前列腺癌发生的关系。方法 应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法，检测前列腺癌组织中p53基因第4号外显子72位密码子的点突变。结果 前列腺癌DNA样本中检出4号外显子p53基因点突变44%，其中杂合性突变36%，纯合性突变8%。对照组前列腺良性增生未见p53基因变化。结论 前列腺癌发生与p53基因突变有一定关系,应用PCR和Bstu I酶切多态性分析，对检测前列腺癌p53基因第4号外显子72位编码的点突变是一较特异的方法。
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中图分类号:R394;R737.25;R446.8 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0135-03
Point Mutation of p53 Gene in Prostate Carcinomas
HUANG Gang-xiong,CHEN Bi-fen,JIN Wen
(Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)
ABSTRACT:Objective To determine how the point mutation of p53 was correlated with the prostate cancer.Methods Polymerization chain reaction(PCR)-restriction fragment length polymorphisms(RFLP) technique was used to detect p53 gene and analyze the mutation of p53 gene exon 4 condon 72 in 25 prostate carcinomas,DUl45 cell line and benign prostatic hypertrophy(BPH) as well as normal prostate tissues.Results P53 gene exon 4 was present in the chromosome DNA of all samples.The mutation p53 gene exon 4 condon 72 was present in 11 out of 25 carcinoma cases(44%),among them the mutation of homologosity in 2(8%),heterozygosity in 9(36%) and for the wild type of p53 with no mutation in 14(56%).No mutations were detected in those obtained from DU145 cell and 8 samples with non-tumors.Conclusion These findings suggest that p53 may be a target of chromosome 17 deletions and that this gene may play a role in the pathogenesis of prostate cancer.RFLP with Bstu I analysis of the p53 gene codon 72 may be a useful and direct technique to detect the point mutation of p53 gene in prostate cancer.
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KEY WORDS:prostate neoplasm;gene p53;mutation;polymerization chain reaction;polymorphisms,restriction fragment length
肿瘤抑制基因p53蛋白的主要生物学功能是阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进细胞分化[1]。野生型p53基因是肿瘤抑制基因，p53基因的失活与人体许多恶性肿瘤的发生密切相关，其失活方式常以一个等位基因错义突变及另一个等位基因缺失最常见，已证实肺、乳腺、大肠等实体癌中约50%以上有p53基因突变或缺失[2～4]。笔者应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析和探针杂交技术，对前列腺癌和前列腺上皮异型增生、良性增生和正常前列腺组织的DNA样本，检测其p53基因变化,并探讨其与前列腺癌发生的关系。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 标本 1988～1992年本室25例前列腺癌组织，常规福尔马林固定石蜡包埋，其中细针穿刺1例,经尿道电切9例,根治切除15例。患者年龄62.6±9.7(50～89)岁。按Jewett改良分类法：B期11例，C期8例，D期6例，无A期病例。组织学分类：高分化6例，中分化15例，低分化4例。上皮异型增生(PIN Ⅱ级)1例，良性增生(BPH)5例，尸检的正常前列腺2例作对照。另以已知无p53基因第4号外显子突变的前列腺癌细胞株DU145为阴性对照。
1.2 PCR-RFLP检测
1.2.1 基因组DNA提取 按文献[5]，以Chelex-100煮沸法，经1.0 ml微型葡聚糖凝胶G-50过柱后收集DNA样品，-20°C保存。
1.2.2 寡核苷酸引物和p53 cDNA探针 参照Lambp等[6] 关于人p53基因结构的序列，选取第4号外显子引物：
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+5'GATGCTGTCCCCGGACGATATT3'
-5'CCAAGTCTGTGACTTGCACG3'
p53 cDNA探针用随机引物DNA标记试剂盒(丹麦DECO公司)和32P进行标记，并经葡聚糖G-25过柱分离回收后，液闪仪检测标记量。
1.2.3 PCR扩增反应体系及程序 按文献[5]方法进行，其扩增产物片段长度预计为247 bP，反应产物均经2%琼脂糖凝胶电泳及Southern印迹，转膜后与p53 cDNA基因探针杂交，最后放射自显影。
1.2.4 限制性内切酶RFLP反应 PCR产物经酚、氯仿-乙醇等纯化后，每例取样品15 μl以Bstu I(英国Biolabs公司)进行酶切反应，余5 μl样品不经酶反应作为对照。通过电泳、转膜、杂交及放射自显影等上述步骤，检测扩增产物酶切情况。已知p53基因4号外显子在72位密码子含有Bstu I酶切片位点(CG↓CG)。
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2 结 果
2.1 PCR扩增情况(图1)
图1 PCR扩增产物经探针杂交及放射自显影
4号外显子的p53基因片段(前3例为良性增生).
25例前列腺癌、8例非癌及DU145癌细胞株的DNA样本，经PCR扩增，分别在247 bp位置出现第4号外显子p53基因片段，表明所有样本中均有相应位点p53基因存在。
2.2 扩增产物的Bstu I酶切多态性分析
2.2.1 p53基因4号外显子的PCR-RFLP分析(图2)
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图2 p53基因4号外显子的PCR-RFLP分析示意图
2.2.2 扩增产物的Bstu I酶切情况(图3)
图3 p53基因4号外显子PCR-RFLP显示图像
A 前列腺癌DNA未经酶切与酶切片段对照(1～15为病例号),(1)完全酶切(N.9，12，14，15),DU145为阴性对照，呈完全性酶切；(2)不完全性酶切(N.1～5，7，8，10，13);(3)酶切无效(N.6，11).
B 正常前列腺和良性增生DNA扩增产物酶切图像，未经酶切(247 bp)和酶切(196 bp)片段对照(51 bp片段未显示).
25例前列腺癌于72位编码酶切位点处显示三种情况:(1)完全性酶切：出现196 bp和51 bp两个小片段(本图51 bp未显出)，表明酶切位点存在，为野生型p53基因，共14例(56%)；(2)不完全性酶切：出现247,196和51 bp 3条片段(51 bp未显出)，表示p53等位基因中一条酶切位点消失，为杂合性点突变，共9例(36%)；(3)不能被酶切：保持原来247 bp片段，表示p53二条等位基因均无酶切位点，为纯合性突变共2例(8%)。8例非癌组织及DU145癌细胞株均显示上述第1种情况，呈完全性酶切，表明均为野生型p53基因。
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3 讨 论
PCR-RFLP检测恶性肿瘤p53等位基因突变是基于基因多态性分析为基础，应用限制性内切酶的酶切方法，在p53基因病理改变高频区检测酶切位点变化情况，可发现p53基因异常和碱基突变，它常以正常组织或已知无p53基因点突变的DNA样本作对照而进行分析。笔者发现,25例前列腺癌组织中11例p53第4号外显子点突变，突变率为44%，其中杂合性突变9例(36%)，纯合性突变2例(8%)，表明前列腺癌发生与p53基因突变密切相关。文献报告前列腺癌p53基因4～11外显子突变率约5%～42%[7～9]，这一大范围的差别，一方面可能与前列腺癌为一种异质性肿瘤有关，它包含有癌上皮、不同程度异型增生上皮、正常上皮及平滑肌、血管纤维组织等多种成分混杂存在;另方面亦与各家采用方法的特异性程度不同有关[8] 。Gumerlock等[9]，推荐采用单链构象多态性方法并以基因组DNA及反转录cDNA联合检测，可使前列腺癌p53基因突变率提高到79%。此外，Mottaz等[10]报道早期前列腺癌中p53基因突变率仅5%，认为p53突变是前列腺癌发展过程中的晚发事件，因此p53突变率高低与前列腺癌预后有关。本文25例前列腺癌中C期和D期共14例，其中9例有p53基因点突变，B期11例仅2例p53基因突变，前列腺上皮异型增生(PIN Ⅱ)、良性增生(BPH)及正常对照共8例均无p53基因变化，这一结果支持p53基因变化是前列腺癌晚发事件的论点。
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笔者应用PCR-RFLP分析和选用Bstu I内切酶方法,检出p53基因第4号外显子点突变达44%，这一方法较PCR-SSCP技术更简便易行，且可分析出杂合性或纯合性点突变情况。因此在选择适当的内切酶基础上可推广应用于检测p53基因5～11号外显子的点突变，并可广泛用于人体其他实体癌的p53基因点突变的筛选。
作者简介:黄纲雄(1967～)，男，讲师，医学硕士.
参考文献
[1]Gottlied TM,Oren M.P53 in growth control and neoplasm[J].Biochim Biophys Acta,1996,1287(2,3):77.
[2]Hensel CH,Xiang RH,Sakaguchi AY,et al.Use of SSCP and PCR techniques to detect p53 gene mutations in small cell lung cancer[J].Oncogene,1991,6(6):1067.
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[3]Coles C,Condie A,Chetly U,et al.p53 mutations in breast cancer[J].Cancer Res,1992,52(19):5291.
[4]Cunningham J,Lust JA,Schaid DJ,et al.Expression of p53 and 17 p allelic loss in colorectal carcinoma[J].Cancer Res,1992,52(7):1974.
[5]Chen ML,Shieh YSC,Gerber MA.Comparative studies on the detection of hepatitis B virus DNA in frozen sections and paraffin sections by PCR[J].Mod Pathol,1991,3(5):555.
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[6]Lamb P,Crawforl L.Characterization of the human p53 gene[J].Mol Cell Biol,1986,6(5):1379.
[7]Watanabe M,Fukutome K,Shiraishi T,et al.Differences in the p53 gene mutational spectra of prostate cancers between Japan and Western Countries[J].Carcinogenesis,1997,18(7):1355.
[8]Shi XB,Bodner SM,Deverv WRW,et al.Identification of p53 mutations in archival prostate tumors,sensitivity of an optimized SSCP assay[J].Diagn Mol Pathol,1996,5(4):271.
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[9]Gumerlock PH,Chi SG,Shi XB,et al.P53 abnormalities in primary prostate cancer:Single-stand conformation polymorphism analysis of complementary DNA in comparison with genomic DNA.The cooperative prostate network[J].J Natl Cancer Inst,1997,89(1):66.
[10]Mottaz AE,Markwalder R,Fey MF,et al.Abnormal p53 expression is rare in clinically localized human prostate cancer:comparison between immunohistochemical and molecular detection of p53 mutations[J].Prostate,1997,31(4):209.
收稿日期:1999-10-09, http://www.100md.com